支氣管哮喘患兒血清lncRNA TUG1、miR-326水平與氣道炎癥的關(guān)系

李曉娜，趙和萌，周進(jìn)進(jìn)，王娟

連云港市第一人民醫(yī)院兒內(nèi)科，江蘇 連云港 222000

支氣管哮喘（BA）是兒童時(shí)期常見的慢性呼吸道炎癥性疾病，近年來，隨著環(huán)境污染的加重，兒童BA患病率逐年上升。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國兒童BA患病率為2.12%［1］，其反復(fù)發(fā)作不僅嚴(yán)重?fù)p害患兒身心健康，而且導(dǎo)致兒童誤學(xué)率和家長誤工率居高不下，給其家庭乃至社會帶來負(fù)擔(dān)［2］。盡管目前針對兒童BA的診治已取得較大進(jìn)展，但仍有超過20%的兒童BA未達(dá)到良好控制［3］，研究BA發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制是目前研究熱點(diǎn)。氣道炎癥是BA發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制［4］。近年越來越多研究表明，長鏈非編碼RNA（lncRNA）、微小RNA（miRNA）等非編碼RNA參與氣道炎癥發(fā)生、發(fā)展［5-6］。?；撬嵘险{(diào)基因1（lncRNA TUG1）是新近發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，研究報(bào)道，lncRNA TUG1在BA大鼠模型中表達(dá)上調(diào)［7］。miR-326是一種保守的miRNA，研究報(bào)道，miR-326在BA氣道平滑肌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)［8］。目前，關(guān)于lncRNA TUG1、miR-326與BA患兒氣道炎癥的關(guān)系報(bào)道較少。本研究我們探討B(tài)A患兒血清lncRNA TUG1、miR-326水平與氣道炎癥的關(guān)系，旨在為兒童BA防治提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2019年1月—2022年1月我院收治的106例BA患兒，根據(jù)病情嚴(yán)重程度分為兩組，急性發(fā)作期組43例，男24例、女19例，年齡1～14（7.41±2.68）歲。臨床緩解期組63例，男36例、女27例，年齡1～14（7.35±2.53）歲。另選取同期57例健康兒童為對照組，男32例、女25例，年齡1～14（7.27±2.19）歲。三組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。BA患兒納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)肺通氣功能檢測確診，符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年版）》［9］診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡1～14歲；③臨床資料完整；④患兒家屬或監(jiān)護(hù)人知情并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并過敏性鼻炎、支氣管擴(kuò)張、肺結(jié)核等氣道內(nèi)阻塞性疾病或先天性氣道、肺組織發(fā)育異常；②合并造血、免疫系統(tǒng)損害；③合并嚴(yán)重心肝腎功能損害；④近3個(gè)月內(nèi)使用糖皮質(zhì)激素；⑤近3個(gè)月內(nèi)呼吸道感染史。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（2019-213）。

1.2 觀察指標(biāo)與方法

1.2.1 血清指標(biāo)檢測收集BA患兒入院次日清晨和對照組體檢時(shí)6 mL空腹靜脈血，3 000 r/min離心15 min（離心半徑10 cm），取上層血清，分置兩管保存-80℃冰箱至檢測。取1管血清標(biāo)本，使用TRIzol試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，編號：ALH011）提取血清總RNA，微量分光光度計(jì)（賽默飛世爾科技有限公司，型號：NanoDrop）驗(yàn)證純度、濃度合格（光密度260/280），使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司，編號：RR036A）合成cDNA。以cDNA為模板，按照SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒（上海赫果生物科技有限公司，編號：DRR820A）進(jìn)行PCR擴(kuò)增：lncRNA TUG1正向引物：5＇-GGACACAATTCGCCACGACTT-3＇，反 向 引 物：5＇-GCGCAGTCCCAGATTCCA-3＇；內(nèi)參GAPDH正向引物：5＇-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3＇，反向引物：5＇-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3＇；miR-326正向引物：5＇-TGAAAGACGTGATGGCACAC-3＇，反向引物：5＇-CTTCCATTTTGGGGTTTTTGG-3＇；內(nèi)參U6正向引物：5＇-CCCCGTCAGATAATCTGTG-3＇，反向引物：5＇-CTTGTCAGATACGGGAGG-3＇。PCR反應(yīng)體積20 μL：SYBR?Premix Ex Taq 10 μL、正反向引物各0.8 μL、cDNA模板2.0 μL、ROX Reference Dye（50×）0.4 μL、RNase Free H2O 6.0 μL；反應(yīng)條件：95℃90 s、95℃30 s、63℃30 s、72℃15 s共循環(huán)40次，收集Ct值，采用2-ΔΔCT法計(jì)算血清lncRNA TUG1、miR-326相對表達(dá)量。另1管血清標(biāo)本采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測血清白細(xì)胞介素-4（IL-4）、IL-10、IL-13、干擾素-γ（IFN-γ），試劑盒均購自武漢亞科因生物技術(shù)有限公司，編號：KET6015-1、KET6019-1、KET6021-1、KET6011-1。

1.2.2 氣道炎癥指標(biāo)檢測BA患兒入院次日清晨和對照組體檢時(shí)，采用瑞士ANALYZER CLD 88 sp分析儀，通過多重潮氣呼吸法在線測定呼出氣一氧化氮（FeNO），連續(xù)測定3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS28.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以±s表示，多組間比較采用F檢驗(yàn)，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。偏態(tài)分布計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用H檢驗(yàn)，事后多重比較用Bonferroni校正。Pearson/Spearman相關(guān)法分析BA患兒血清lncRNA TUG1、miR-326水平與FeNO和炎癥因子的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血清lncRNA TUG1、miR-326水平比較對照組、臨床緩解期組、急性發(fā)作期組血清lncRNA TUG1水平依次升高，miR-326水平依次降低（P均＜0.05）。見表1。

表1 三組血清lncRNA TUG1、miR-326水平比較

2.2 三組FeNO和血清炎癥因子水平比較對照組、臨床緩解期組、急性發(fā)作期組FeNO和血清IL-4、IL-13水平依次升高，IL-10、IFN-γ水平依次降低（P均＜0.05）。見表2。

表2 三組FeNO和血清炎癥因子水平比較

2.3 BA患兒血清lncRNA TUG1、miR-326水平與FeNO和炎癥因子的相關(guān)性經(jīng)https：//starbase.sysu.edu.cn/網(wǎng)站預(yù)測，lncRNA TUG1與miR-326存在互補(bǔ)序列（圖1）。Pearson/Spearman相關(guān)性分析顯示，BA患兒血清lncRNA TUG1水平與miR-326、IL-10、IFN-γ水 平 呈 負(fù) 相 關(guān)（r分 別 為-0.625、-0.581、-0.667，P均＜0.05），與FeNO和IL-4、IL-13水平呈正相關(guān)（r分別為0.701、0.634、0.651，P均＜0.05）；miR-326水平與IL-10、IL-13水平呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.558、-0.602，P均＜0.05），與FeNO、IL-4、IFN-γ水平呈正相關(guān)（r分別為0.689、0.614、0.638，P均＜0.05）。

圖1 lncRNA TUG1與miR-326的互補(bǔ)序列示意圖

3 討論

BA是多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征的異質(zhì)性疾病，以喘息、咳嗽、胸悶、氣急等癥狀反復(fù)發(fā)作為主要臨床表現(xiàn)，隨著病情進(jìn)展可引起氣道增厚狹窄甚至阻塞性通氣功能障礙，嚴(yán)重危急患兒生命安全，探索其發(fā)病機(jī)制有助于早期診斷和提升治療效果［10］。氣道重塑是BA發(fā)生、發(fā)展以及難以根治的主要原因，慢性、持續(xù)的氣道炎癥可導(dǎo)致氣道上皮反復(fù)損傷和修復(fù)，從而引起炎癥細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞釋放生長因子、趨化因子等多種細(xì)胞因子，驅(qū)動氣道重塑。因此，抑制氣道炎癥對改善BA肺功能和提升患者生活質(zhì)量有重要意義［11］。

FeNO是氣道細(xì)胞產(chǎn)生的一種生物調(diào)節(jié)因子，其濃度與氣道炎癥細(xì)胞數(shù)目呈高度相關(guān)，因此被國內(nèi)外指南作為BA氣道炎癥和BA控制水平的檢測指標(biāo)［10，12］。氣道炎癥能引起上皮細(xì)胞損傷和修復(fù)，進(jìn)而誘導(dǎo)大量炎癥細(xì)胞產(chǎn)生，IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ是常見的炎癥細(xì)胞因子，其中IL-4、IL-13作為促炎細(xì)胞因子，能進(jìn)一步促進(jìn)BA進(jìn)展，IL-10、IFN-γ作為抗炎細(xì)胞因子，能通過抑制嗜酸性粒細(xì)胞活化、分化和募集等抑制氣道炎癥發(fā)展［13-14］。本研究中，對照組、臨床緩解期組、急性發(fā)作期組FeNO和血清IL-4、IL-13水平依次升高，IL-10、IFN-γ水平依次降低，說明BA患兒存在明顯氣道炎癥，且與BA進(jìn)展有關(guān)，符合BA病理過程。目前主要認(rèn)為，BA氣道炎癥啟動和持續(xù)過程由遺傳機(jī)制、神經(jīng)調(diào)節(jié)機(jī)制、免疫機(jī)制等多種機(jī)制共同參與。近年來，隨著表觀遺傳學(xué)的深入，發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)中非編碼RNA調(diào)控、組蛋白修飾、DNA甲基化等在BA發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用［15］。lncRNA是一類新興的表觀遺傳學(xué)調(diào)控分子，能通過競爭性占有胞內(nèi)miRNA海綿樣干涉miRNA活性，間接調(diào)控靶mRNA表達(dá)，進(jìn)而參與氣道炎癥發(fā)生、發(fā) 展［5］。lncRNA TUG1定 位 于22號 染 色 體q12.2，最初因其在新生小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞中隨著牛磺酸加入而表達(dá)上調(diào)，故被稱為lncRNA TUG1。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA TUG1能通過促進(jìn)核因子-κB（NF-κB）通路活化參與炎癥反應(yīng)過程，如敲低lncRNA TUG1能抑制NF-κB通路活化來抑制椎間盤盤髓核細(xì)胞炎癥和凋亡［16］。lncRNA TUG1能通過促進(jìn)NF-κB p65轉(zhuǎn)錄激活NF-κB通路，促進(jìn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)［17］。上述研究均提示lncRNA TUG1能通過NF-κB通路參與炎癥反應(yīng)。氣道平滑肌細(xì)胞的異常增殖和遷移是氣道炎癥反應(yīng)刺激的一個(gè)重要表現(xiàn)。近年研究發(fā)現(xiàn)，抑制lncRNA TUG1能抑制氣道平滑肌細(xì)胞的異常增殖和遷移［18］。本研究結(jié)果顯示，對照組、臨床緩解期組、急性發(fā)作期組血清lncRNA TUG1水平依次升高，說明血清lncRNA TUG1高水平參與BA發(fā)生、發(fā)展。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，BA患兒血清lncRNA TUG1水平與FeNO和IL-4、IL-13水平呈正相關(guān)，與IL-10、IFN-γ水平呈負(fù)相關(guān)，提示血清lncRNA TUG1高水平可能通過促進(jìn)氣道炎癥參與BA發(fā)生、發(fā)展。分析其機(jī)制可能與lncRNA TUG1能促進(jìn)NF-κB通路活化有關(guān)。NF-κB是參與多種炎癥蛋白基因轉(zhuǎn)錄的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在BA氣道炎癥中發(fā)揮重要作用［19］。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)lncRNA TUG1能促進(jìn)NF-κB信號通路活化，激活氣道炎癥反應(yīng)［20］。此外，氣道炎癥是BA氣道高反應(yīng)性的重要原因。近期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，lncRNA TUG1作為競爭性內(nèi)源RNA能促進(jìn)PM2.5暴露誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性［21］。

miRNA是一類新興的表觀遺傳學(xué)調(diào)控分子，能通過降解或抑制蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控靶基因表達(dá)，參與氣道炎癥發(fā)生、發(fā)展［6］。miR-326定位于11號染色體q13.4。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-326能通過NF-κB通路參與炎癥過程，如上調(diào)miR-326能通過Toll樣受體4/髓樣分化初級反應(yīng)基因88/NF-κB信號通路抑制肝星狀細(xì)胞炎癥反應(yīng)［22］。上調(diào)miR-326能靶向程序性細(xì)胞死亡因子4使NF-κB信號通路失活，抑制肺炎發(fā)展［23］。上述研究說明miR-326參與抑制NF-κB信號通路激活，但關(guān)于miR-326與BA患兒氣道炎癥的關(guān)系尚未可知。本研究結(jié)果顯示，對照組、臨床緩解期組、急性發(fā)作期組血清miR-326水平依次降低，說明血清miR-326低水平參與BA發(fā)生和發(fā)展。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，BA患兒血清miR-326水平與FeNO和IL-4、IL-13水平呈負(fù)相關(guān)，與IL-10、IFN-γ水平呈正相關(guān)，提示血清miR-326低水平可能通過促進(jìn)氣道炎癥參與BA發(fā)生和發(fā)展，分析其機(jī)制可能與miR-326能抑制NF-κB通路活化有關(guān)。環(huán)境污染物尤其是PM2.5暴露是誘導(dǎo)RA氣道炎癥的重要原 因［3］。在PM2.5暴 露 誘 導(dǎo) 的 炎 癥 反 應(yīng) 中，上調(diào)miR-326能抑制NF-κBp65的磷酸化，進(jìn)而抑制NF-κB信號通路激活［24］。同時(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-326能靶向腫瘤壞死因子超家族成員14，抑制氣道平滑肌細(xì)胞炎癥、異常增殖和氣道重塑［25］。筆者通過Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)，lncRNA TUG1與miR-326存在互補(bǔ)序列。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，BA患兒血清lncRNA TUG1與miR-326水平呈負(fù)相關(guān)，提示二者可能共同參與BA患兒氣道炎癥發(fā)生、發(fā)展。李青華等［26］通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，沉默lncRNA TUG1能靶向抑制miR-326，促進(jìn)BA患兒氣道平滑肌細(xì)胞炎癥因子釋放。進(jìn)一步佐證了本研究結(jié)果。

綜上所述，BA患兒血清lncRNA TUG1水平升高，miR-326水平降低，可能共同參與BA患兒氣道炎癥發(fā)生、發(fā)展。但本研究樣本量較少，關(guān)于lncRNA TUG1、miR-326參與BA發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。