基于新抗原的腫瘤個體化治療研究與應(yīng)用進(jìn)展＊

韋樹麗 胡茫莎 王蘋莉

新抗原是一類由腫瘤細(xì)胞的突變基因編碼，經(jīng)過轉(zhuǎn)錄及翻譯過程而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可被抗原提呈細(xì)胞（APC）識別、吞噬、加工并遞呈于細(xì)胞表面，激活T細(xì)胞，引起效應(yīng)T細(xì)胞的活化、增殖而發(fā)揮抗腫瘤作用。新抗原主要存在于腫瘤細(xì)胞，正常組織中幾乎不表達(dá)，因此針對新抗原的治療不易發(fā)生脫靶現(xiàn)象，此外由于新抗原未經(jīng)過中樞免疫耐受過程，相較于腫瘤相關(guān)抗原具有更強(qiáng)的免疫原性，這些特點(diǎn)使得新抗原成為腫瘤免疫治療的優(yōu)秀靶點(diǎn)?；谛驴乖膫€體化治療正成為腫瘤免疫治療的熱點(diǎn)領(lǐng)域，本文將對近些年基于新抗原的腫瘤個體化治療的最新研究和應(yīng)用進(jìn)展做一介紹。

1 新抗原特異性T細(xì)胞治療

1.1 特異性腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）過繼治療

早在1980年，TIL就被發(fā)現(xiàn)具有抑制黑色素瘤轉(zhuǎn)移的能力，這也成為后續(xù)Rosenberg團(tuán)隊(duì)創(chuàng)立TIL療法的理論基礎(chǔ)之一。TIL療法通過從切除的腫瘤標(biāo)本中分離出對腫瘤細(xì)胞有反應(yīng)的淋巴細(xì)胞，在體外數(shù)量級擴(kuò)增后回輸給患者，從而達(dá)到抗腫瘤作用。

為了分析回輸?shù)牧馨图?xì)胞靶向癌細(xì)胞的機(jī)制，Rosenberg團(tuán)隊(duì)利用外顯子測序技術(shù)分析曾經(jīng)接受TIL治療的黑色素瘤患者的腫瘤樣本，從中均篩選到了2～3個新抗原的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)載有新抗原的APC與TIL共孵育可引起特異性T細(xì)胞反應(yīng)，這表明新抗原的存在是TIL治療有效的機(jī)制之一[1]?；谶@一理論，Rosenberg團(tuán)隊(duì)分析了一位經(jīng)過多種化療方案均以失敗告終的晚期膽管癌患者的腫瘤標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)存在一種新抗原的表達(dá)——ERBB2IP，將對新抗原有反應(yīng)的TILs體外富集使其濃度達(dá)到25%并回輸給該患者后，腫瘤病灶顯著縮小且療效維持1 年余[2]。

2016年該團(tuán)隊(duì)在另一名結(jié)直腸癌肺轉(zhuǎn)移患者的腫瘤標(biāo)本中分析到了KRAS突變，并獲得與該突變相關(guān)的新抗原，回輸針對該突變新抗原的TILs后，患者7處轉(zhuǎn)移灶中的6處發(fā)生消退，剩余一處病灶在經(jīng)過手術(shù)切除后也未再復(fù)發(fā)[3]。KRAS基因是常見的致癌基因，大約30%的腫瘤類型包含該靶點(diǎn)的突變[4]，此案例的報道激起了研究者對于靶向由KRAS等熱點(diǎn)突變新抗原的研究熱潮。后續(xù)在上皮癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌等腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)另一熱點(diǎn)突變--TP53也可以產(chǎn)生新抗原，并發(fā)現(xiàn)在外周血中存在對TP53有反應(yīng)的特異性T細(xì)胞，且與腫瘤組織中存在的特異性T細(xì)胞的反應(yīng)相近[5-8]。這與之前可以在外周血中篩選到新抗原特異性T細(xì)胞的結(jié)論一致[9]。這一發(fā)現(xiàn)為難以取得組織標(biāo)本或標(biāo)本量少的患者提供了另一種獲取TILs的途徑。GEN-011就是一種利用患者外周血進(jìn)行新抗原特異性T細(xì)胞篩選和擴(kuò)增的針對實(shí)體腫瘤的T細(xì)胞過繼療法，目前正在進(jìn)行難治性實(shí)體瘤的1期臨床試驗(yàn)（NCT04596033）[10]。

靶向新抗原的TIL療法具有治愈癌癥的潛力，近些年在實(shí)體瘤治療中取得了良好療效。在一項(xiàng)2期臨床試驗(yàn)（NCT02360579）中，曾接受免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療而效果不佳的晚期黑色素瘤患者經(jīng)過TIL療法治療后，客觀緩解率達(dá)到了41%，疾病控制率更是達(dá)到了81%[11]。一項(xiàng)臨床試驗(yàn)報告顯示TIL療法聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者，可以達(dá)到44%的客觀緩解率及89%的疾病控制率[12]。荷蘭癌癥研究所啟動的針對TIL治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的可行性研究中，一位患者在多次接受針對其突變抗原肽的TIL治療后保持無病狀態(tài)9年余[13]。

雖然部分患者對TIL治療產(chǎn)生良好應(yīng)答，但是也存在對此療法無應(yīng)答的患者。最近Steven Rosenberg和Paul Robbins團(tuán)隊(duì)利用單細(xì)胞測序等技術(shù)，比較了對TIL療法有完全反應(yīng)（CR）和無反應(yīng)（NR）患者的TILs的表型差異，發(fā)現(xiàn)了以CD39和CD69為分群依據(jù)的兩個功能不同的細(xì)胞亞群[14]。大多數(shù)腫瘤新抗原反應(yīng)性TILs處于CD39+分化狀態(tài)，而CD39和CD69雙陽性的TILs（DP TILs）為終末分化狀態(tài)，增殖潛力差。CR患者不僅存在DP TILs，還存在CD39和CD69雙陰性的TILs（DN TILs），DN TILs細(xì)胞具有干細(xì)胞樣的特征，具備自我更新、擴(kuò)增的能力從而使TILs持續(xù)存在并引起腫瘤消退。同一時期，Baharom等[15]通過單細(xì)胞測序發(fā)現(xiàn)，給予新抗原疫苗后，初始T細(xì)胞將增殖分化成干細(xì)胞樣T細(xì)胞，并可進(jìn)一步發(fā)育成效應(yīng)性T細(xì)胞，而且在腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞中TCF1+PD-1+“干細(xì)胞樣”細(xì)胞占了較高比例。以上的發(fā)現(xiàn)提示未來基于T細(xì)胞的免疫療法的有效開發(fā)可以通過分離和擴(kuò)增具有干細(xì)胞特征的新抗原特異性T細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)。

1.2 新抗原特異性工程化T細(xì)胞治療

工程化T細(xì)胞治療主要包括T細(xì)胞受體修飾的T細(xì)胞（TCR-T）治療和嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞（CAR-T）治療。傳統(tǒng)的TCR-T和CAR-T治療的靶點(diǎn)主要為腫瘤相關(guān)抗原，這些抗原并非腫瘤特異性，在正常細(xì)胞中也存在低水平表達(dá)，易產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，引起正常組織損傷[16-17]。而新抗原是由腫瘤細(xì)胞發(fā)生基因突變而產(chǎn)生的異常蛋白，不存在于正常細(xì)胞表面，基于新抗原的療法可以避免脫靶現(xiàn)象的發(fā)生。

2019年，Ziopharm Oncology與 MD Anderson癌癥中心宣布達(dá)成一項(xiàng)與Ziopharm的“睡美人”免疫療法計(jì)劃有關(guān)的新的研發(fā)協(xié)議，該協(xié)議旨在使用非病毒基因轉(zhuǎn)移來穩(wěn)定表達(dá)和臨床評估T細(xì)胞中的新生抗原特異性T細(xì)胞受體（TCRs）。美國國家癌癥中心最近開展了鑒定及使用新生抗原特異性TCRs治療多種實(shí)體瘤的臨床試驗(yàn)（NCT03412877）。PACT制藥公司則通過預(yù)測新抗原，篩選反應(yīng)性T細(xì)胞并分析其受體信息及慢病毒轉(zhuǎn)染T細(xì)胞來構(gòu)建neoTCR-P1細(xì)胞深層儲存庫，在臨床前研究中，這些經(jīng)過改造的T細(xì)胞被證明可殺死表達(dá)突變抗原的腫瘤[18]。

新生抗原特異性TCRs治療或?qū)⒊蔀閭€性化腫瘤特異性免疫治療的新方法，但由于每個患者的突變都具有獨(dú)特性，尋找個性化的T細(xì)胞，測序克隆相關(guān)的TCRs并實(shí)現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染，這整個過程中的時間和及經(jīng)濟(jì)的消耗將是TCR-T推廣和量產(chǎn)所面臨的挑戰(zhàn)之一。

2 基于新抗原的雙特異性抗體療法

雙特異性抗體是含有兩種特異性抗原結(jié)合位點(diǎn)的人工抗體，可以聯(lián)通靶細(xì)胞和功能分子/細(xì)胞，激發(fā)具有導(dǎo)向性的免疫反應(yīng)，在腫瘤的免疫治療中具有廣闊的應(yīng)用前景[19]。近日，由約翰-霍普金斯大學(xué)學(xué)者領(lǐng)銜的研究團(tuán)隊(duì)成功研發(fā)出靶向熱點(diǎn)突變——RAS和p53突變體的雙特異性抗體，該抗體的一臂靶向癌細(xì)胞表面的由突變的RAS或TP53基因所編碼的蛋白質(zhì)，另一臂與T細(xì)胞受體（通常為CD3）結(jié)合，橋接并激活免疫細(xì)胞以攻擊腫瘤細(xì)胞[20-21]。研究結(jié)果表明該雙特異性抗體能夠顯著抑制腫瘤的生長。但是雙特異性抗體缺少Fc段，穩(wěn)定性不高，后續(xù)還需進(jìn)一步優(yōu)化改造[22]。

3 基于新抗原的個體化疫苗治療

2012年Sahin團(tuán)隊(duì)首次通過二代測序（NGS）技術(shù)在小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16F10中篩選到數(shù)個具有免疫原性的新抗原，將基于新抗原設(shè)計(jì)的多肽疫苗與佐劑一起對黑色素瘤小鼠進(jìn)行皮下注射后，小鼠腫瘤的生長速度比接受單純佐劑注射組及未接受任何治療組顯著減緩，且在數(shù)月后，仍有40%的小鼠存活。若先將新抗原疫苗免疫小鼠，再經(jīng)黑色素瘤造模后，小鼠腫瘤生長的速度同樣減慢，表明新抗原疫苗具有治療和預(yù)防的雙重價值[23]。2014年，Gubin等[24]使用基因組學(xué)和生物信息學(xué)方法來鑒定腫瘤特異性突變蛋白，以此設(shè)計(jì)的長肽疫苗在治療患有進(jìn)行性生長肉瘤的小鼠中發(fā)揮了強(qiáng)大的抗腫瘤效應(yīng)，顯示高應(yīng)答率。良好的臨床前研究結(jié)果掀起了基于新抗原的腫瘤個體化疫苗的臨床研究熱潮。

2015年，基于新抗原的樹突狀細(xì)胞（DC）疫苗首次進(jìn)行人體試驗(yàn)，3位黑色素瘤患者在接受疫苗接種后，其抗腫瘤免疫的抗原廣度和克隆多樣性均有所擴(kuò)大[25]。而在2017年，德國Sahin團(tuán)隊(duì)和美國Wu團(tuán)隊(duì)主導(dǎo)的兩個Ⅰ期臨床試驗(yàn)更是證明基于新抗原的腫瘤個體化疫苗可以引起強(qiáng)大的抗瘤效應(yīng)和較低的副作用，能帶來直接的臨床獲益，這相較于此前的個案報道更具說服力[26-27]。兩個臨床試驗(yàn)納入的研究對象均是中晚期黑色素瘤患者，均為復(fù)發(fā)高危人群。13名患者接受了Sahin團(tuán)隊(duì)mRNA個體化疫苗治療，其中8位患者在23個月內(nèi)無疾病復(fù)發(fā)，另外5位患者在接受疫苗之前已發(fā)生疾病進(jìn)展，在接受治療后有2位獲得了客觀應(yīng)答，其中1位獲得了完全緩解，且26個月無復(fù)發(fā)，另1位在疫苗的序貫治療和抗PD-1抗體治療后腫瘤完全消退[26]。Wu團(tuán)隊(duì)則招募了10位高危黑色素瘤術(shù)后患者，通過全基因組測序，比較每位患者的癌細(xì)胞和正常細(xì)胞之間的基因差異，確定每位患者的基因突變情況，根據(jù)不同的基因突變情況為每位患者制定針對多達(dá)20種腫瘤新抗原的個體化癌癥疫苗，最終有6位患者接受了完整的個體化抗癌疫苗（NeoVax疫苗）治療。25個月的中位隨訪時間內(nèi)，4例ⅢB/C期患者無復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)的2例ⅣM1a/b期（肺轉(zhuǎn)移）患者經(jīng)4個療程的抗PD-1治療后，獲得了完全緩解[27]。更為有趣的是，該團(tuán)隊(duì)在對這6位患者及當(dāng)時新入組的2名患者進(jìn)行隨訪的4年多的時間中，8名患者全部存活，其中3名患者未復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)的5名患者中，2名Ⅳ期患者受抗PD-1單抗治療后完全緩解，1名患者接受了手術(shù)切除后未發(fā)現(xiàn)疾病證據(jù)，2名患者發(fā)展為不可切除的轉(zhuǎn)移性疾病。對這些患者的T細(xì)胞進(jìn)行分析后，研究者發(fā)現(xiàn)患者的TCR譜系的多樣性隨著疫苗的多次注射而不斷得到擴(kuò)展，T細(xì)胞對大多數(shù)新抗原的反應(yīng)在接種后可以維持到4.5年，而且這些患者體內(nèi)還產(chǎn)生了靶向其他新抗原（非NeoVax疫苗抗原）的特異性T細(xì)胞[28]。這一長期隨訪的試驗(yàn)結(jié)果表明：個體新抗原疫苗可以刺激黑色素瘤患者產(chǎn)生持久的免疫應(yīng)答。

德美兩個團(tuán)隊(duì)在黑色素瘤中得到肯定的試驗(yàn)結(jié)果后，又將目標(biāo)轉(zhuǎn)向了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[29-30]。研究者通過單細(xì)胞TCR分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)經(jīng)過新抗原疫苗治療后，來自外周血的新抗原特異性T細(xì)胞可以遷移聚集到顱內(nèi)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中[29]。由此證明，新抗原靶向疫苗可能有力地改變膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的免疫環(huán)境。近日，Michael Platten團(tuán)隊(duì)用靶向腦膠質(zhì)瘤IDH1突變的腫瘤疫苗治療了32例患者，總體反應(yīng)率達(dá)84.4%，3年無進(jìn)展率和無死亡率分別為63%和84%[31]。此外，個體新抗原疫苗單藥或聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑在非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)直腸癌、晚期集合管癌、胰腺癌中也展現(xiàn)出良好的治療效果[32-36]。2020年，Chen教授團(tuán)隊(duì)在國際上發(fā)表了首個基于新生抗原個體化多肽疫苗單藥治療泛癌中晚期實(shí)體瘤患者的臨床試驗(yàn)，結(jié)果顯示該類疫苗疾病控制率高，且明顯延長晚期腫瘤患者的生存期[36]。

4 展望

生物信息學(xué)工具、基因組大數(shù)據(jù)和計(jì)算機(jī)算法的發(fā)展，納米材料等新載體的開發(fā)推動了新抗原的研究與應(yīng)用，使得腫瘤的治療方式向著個體化和精準(zhǔn)化的方向發(fā)展。目前基于新抗原的腫瘤個體化治療的研究主要集中于新抗原疫苗及靶向新抗原的TIL回輸，雖然相關(guān)的臨床試驗(yàn)大部分處于Ⅰ期或Ⅱ期階段，但是已有結(jié)果表明這是極具潛力的治療方案。而且相較于免疫檢查點(diǎn)抑制劑單藥使用，其與基于新抗原的個體化治療方案聯(lián)用顯著延長了部分患者的生存期，類似的試驗(yàn)結(jié)果在EGFR靶向治療聯(lián)合新抗原疫苗中也有體現(xiàn)。此外，臨床研究也顯示，高的新抗原負(fù)荷與免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療腫瘤的臨床持久獲益相關(guān)，提示新抗原不僅具有作為治療靶點(diǎn)的作用，還具有預(yù)測臨床預(yù)后的潛力，相信其在未來臨床應(yīng)用中將大放異彩[37-38]。