STE029逆轉(zhuǎn)肺腺癌EGFR-TKI耐藥及其機(jī)制研究

黃麟 侯梅 劉潔薇 李洋 沈旺 周清華

近20年來，由于傳統(tǒng)的放化療手段對(duì)晚期肺癌的療效有限，特異性差，在提高肺癌的總治愈率及總生存率方面收效甚微[1]。為減少傳統(tǒng)細(xì)胞毒性藥物的副反應(yīng)、提高藥物治療的特異性、改善臨床療效，針對(duì)腫瘤的分子靶向藥物已得到了廣泛的臨床應(yīng)用。

表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。吉非替尼是第一代EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor,TKI）家族中的一員，可通過與ATP或底物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EGFR的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，特異性抑制EGFR酪氨酸激酶活性，從而抑制其下游Ras/Raf/MAPK、ERK1/2、PI3K/Akt/mTOR等多種促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、黏附、凋亡抑制和血管新生的信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[2]。然而，幾乎所有對(duì)吉非替尼敏感的患者在治療6個(gè)月-12個(gè)月后均會(huì)產(chǎn)生獲得性耐藥，導(dǎo)致疾病進(jìn)展[3]。因此，防止或逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI的獲得性耐藥，逐漸成為了近年來肺癌研究的熱點(diǎn)和前沿課題。作為第三代EGFR-TKI的代表藥物，AZD9291有效克服了部分NSCLC患者在接受第一代EGFR-TKI治療后的獲得性耐藥，它的藥物靶點(diǎn)為EGFRT790M抗藥性突變，其療效和安全性已得到廣泛認(rèn)可[4-6]。然而，目前已有研究[4]發(fā)現(xiàn)，在接受AZD9291治療約9個(gè)月后，多數(shù)患者會(huì)再次耐藥，對(duì)此尚無(wú)確定有效的治療方案；并且，TKI獲得性耐藥的EGFR突變患者中僅有50%存在T790M耐藥突變[7,8]，仍有近半數(shù)的TKI獲得性耐藥患者無(wú)法從AZD9291的治療中獲益。因此，進(jìn)一步研究和開發(fā)針對(duì)EGFR-TKI獲得性耐藥尤其是非T790M突變的獲得性耐藥的藥物和治療方法具有重要的意義。

STE029是由羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzyme A reductase,HMGCR）抑制劑與一種腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜特異性靶向分子耦合而成，具有高度親脂性，其分子式為：C65H85C1N2O9S。HMGCR抑制劑的代表性藥物有辛伐他汀、洛伐他汀等，均以其強(qiáng)效降低膽固醇的作用而被公眾所熟知。越來越多的臨床和基礎(chǔ)研究[9-13]表明，HMGCR抑制劑能抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其抗腫瘤作用的機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面[14-16]：抑制增殖和促進(jìn)凋亡、抗血管生成作用、抑制腫瘤干細(xì)胞以及化療協(xié)同作用。除抗腫瘤作用之外，近年來已有學(xué)者開始研究HMGCR抑制劑在逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥中的作用。一項(xiàng)II期臨床研究結(jié)果[17]顯示，在EGFR野生型的非腺癌NSCLC患者中，辛伐他汀與吉非替尼聯(lián)合組的客觀緩解率（40%vs0%,P=0.043）及中位無(wú)進(jìn)展生存期（3.6個(gè)月vs1.7個(gè)月，P=0.027）均明顯優(yōu)于吉非替尼單藥組。Hwang及其團(tuán)隊(duì)[18]則發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可通過抑制Akt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑，下調(diào)Survivin表達(dá)，誘導(dǎo)凋亡，最終增加EGFRT790M突變的NSCLC細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性。STE029的另一部分為具有腫瘤細(xì)胞特異性的細(xì)胞膜靶向分子，我團(tuán)隊(duì)前期研究表明其對(duì)肺腺癌非T790M突變的EGFR-TKI耐藥細(xì)胞具有抗腫瘤作用，與HMGCR抑制劑耦合后，在理論上可提高HMGCR抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷作用。

因此，為了解決NSCLC中非T790M突變的EGFR-TKI耐藥的難題，本研究旨在探究STE029克服NSCLC吉非替尼耐藥的作用機(jī)制，為NSCLC治療中EGFR-TKI耐藥問題的解決提供新的思路。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑 人肺腺癌EGFR突變陽(yáng)性吉非替尼敏感PC9細(xì)胞株、人肺腺癌EGFR突變陽(yáng)性吉非替尼耐藥PC9/BB4細(xì)胞株、人肺腺癌EGFR野生型A549細(xì)胞株均由天津市肺癌研究所提供；吉非替尼（ZD1839）購(gòu)自美國(guó)Selleck Chemicals公司；STE029由美國(guó)大仁公司惠贈(zèng)；CCK8試劑購(gòu)于日本同仁化學(xué)研究所；EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州銳博生物科技公司；Hoechst 33258細(xì)胞凋亡染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；EGFR兔單抗、p-EGFR兔單抗、Akt兔單抗、p-Akt兔單抗、Cyclin D1兔單抗、p-Cyclin D1兔單抗、caspase-8鼠單抗、cleaved caspase-8兔單抗、caspase-9兔單抗、cleaved caspase-9兔單抗、Gsk-3β兔單抗、β-actin鼠單抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2實(shí)驗(yàn)分組吉非替尼和STE029分別用DMSO和無(wú)水乙醇溶解，體外實(shí)驗(yàn)中不同藥物處理分組如下（CCK8實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)單獨(dú)說明）：對(duì)照組、STE029單藥組、吉非替尼單藥組、STE029+吉非替尼聯(lián)合用藥組；PC9細(xì)胞的給藥濃度為STE029 1 μmol/L、吉非替尼0.05 μmol/L；PC9/BB4、A549細(xì)胞的給藥濃度為STE029 6 μmol/L、吉非替尼1 μmol/L；對(duì)照組予完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。

1.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況收集進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，PBS漂洗，胰酶消化，完全培養(yǎng)基重懸。取96孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液鋪板，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（僅含100 μL完全培養(yǎng)基）。接種24 h后細(xì)胞貼壁，吸出殘余培養(yǎng)基，加入吉非替尼終濃度分別為0μmol/L、0.003,9 μmol/L、0.015,6 μmol/L、0.062,5 μmol/L、0.25 μmol/L、1 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L的完全培養(yǎng)基100 μL；PC9細(xì)胞加入STE029終濃度分別為0 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L的完全培養(yǎng)基100 μL，PC9/BB4及A549細(xì)胞加入STE029終濃度分別為1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L的完全培養(yǎng)基100 μL，分別置于37oC、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。于加含藥培養(yǎng)基72 h后每孔加入含10 μL CCK-8的DMEM培養(yǎng)基（無(wú)血清）100 μL，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm處的吸光值。計(jì)算細(xì)胞抑制率，應(yīng)用曲線回歸分析，求出吉非替尼、STE029半數(shù)抑制濃度（50%inhibitory concentration, IC50）。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.4EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)/mL細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后加藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后檢測(cè)細(xì)胞增殖。用細(xì)胞完全培養(yǎng)基按1,000:1的比例稀釋EdU溶液，每孔加入100 μL 50 μmol/L EdU培養(yǎng)基孵育2 h，棄培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞1次-2次，每次5 min；每孔加入50 μL細(xì)胞固定液（含4%多聚甲醛的PBS）室溫孵育30 min，棄固定液；每孔加入50 μL 2 mg/mL甘氨酸，脫色擺床孵育5 min后每孔加入100 μL PBS清洗5 min，每孔加入100 μL滲透劑（含0.5%Triton X-100的PBS）脫色搖床孵育10 min；PBS清洗5 min，每孔加入100 μL的1×Apollo?染色反應(yīng)液（按說明書），避光、室溫、脫色搖床孵育30 min，加入100 μL滲透劑脫色擺床清洗3次，10 min/次；每孔加入100 μL去離子水稀釋后的Hoechest 33342染液（100:1），避光、室溫、脫色搖床孵育30 min，PBS清洗3次，加入100 μL PBS上機(jī)檢測(cè)。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.5Hoechst 33258檢測(cè)細(xì)胞凋亡取潔凈蓋玻片在70%乙醇中浸泡5 min或更長(zhǎng)時(shí)間，無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)吹干或用無(wú)菌的PBS或0.9%NaCl等溶液洗滌3遍，再用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌1遍。將蓋玻片置于6孔板內(nèi)，種入細(xì)胞培養(yǎng)過夜。刺激細(xì)胞發(fā)生凋亡后，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 mL固定液，固定10 min。去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗2遍，每次3 min，吸盡液體。洗滌時(shí)宜用搖床或手動(dòng)晃動(dòng)。加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，染色5 min，搖床或手動(dòng)晃動(dòng)數(shù)次。去染色液，用PBS或0.9%NaCl洗2遍，每次3 min，吸盡液體。洗滌時(shí)宜用搖床或手動(dòng)晃動(dòng)。滴1滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，讓細(xì)胞接觸封片液。熒光顯微鏡可檢測(cè)到呈亮藍(lán)色的細(xì)胞核。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.6Western blot檢測(cè)EGFR/Akt/GSK-3β/Cyclin D1、Caspase蛋白表達(dá)藥物處理48 h后，收集細(xì)胞，加入適量蛋白裂解液，充分混勻，冰上孵育30 min，4oC、13,000 rpm離心15 min，取上清，-80oC保存。配制SDS-PAGE凝膠，按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，目的蛋白抗體4oC孵育過夜，二抗常溫孵育2 h，常規(guī)暗室ECL顯影，分析圖片。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.7體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討STE029逆轉(zhuǎn)肺腺癌吉非替尼耐藥的作用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為4周齡-6周齡雌性BALB/c-Nude品系小鼠（胸腺細(xì)胞免疫缺陷鼠），實(shí)驗(yàn)和飼養(yǎng)條件按照SPF動(dòng)物的規(guī)范要求。建立PC9、PC9/BB4裸鼠皮下移植瘤模型：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，每只BALB/c-Nude裸鼠接種100 μL（6×107個(gè)/mL）于右側(cè)腹股溝處，每種細(xì)胞共接種20只，隨機(jī)分為4組，每組5只，并進(jìn)行編號(hào)。待腫瘤體積達(dá)100 mm3以上時(shí)開始給藥，劑量如下：吉非替尼單藥10 mg/kg；STE029單藥8 mg/kg；聯(lián)合用藥組予吉非替尼10 mg/kg+STE029 8 mg/kg；對(duì)照組予含2.5%無(wú)水乙醇、1%Tween80的無(wú)菌三蒸水100 μL；上述藥物均腹腔注射給藥，每周2次。共給藥5周，每周測(cè)量2次腫瘤體積、裸鼠體重及腫瘤生物發(fā)光強(qiáng)度。脫頸法處死裸鼠后，無(wú)菌條件下小心剝離種植瘤，瘤體稱重，游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體的體積。計(jì)算抑瘤率。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件及GraphPad Prism 6.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及圖像處理。應(yīng)用曲線回歸分析求IC50。移植瘤生長(zhǎng)趨勢(shì)的比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析。多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。界值（雙側(cè)0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1STE029聯(lián)合吉非替尼對(duì)PC9、PC9/BB4、A549細(xì)胞體外抑制率的檢測(cè) 應(yīng)用曲線回歸分析分別計(jì)算吉非替尼、STE029在各個(gè)細(xì)胞株中的IC50（表1）。CCK8法檢測(cè)結(jié)果顯示，吉非替尼與STE029聯(lián)合處理72 h與吉非替尼單藥處理72 h的各細(xì)胞株相比（表2）：①吉非替尼敏感的PC9細(xì)胞的吉非替尼IC50顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；②吉非替尼耐藥的PC9/BB4細(xì)胞的吉非替尼IC50顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；③EGFR野生型的A549細(xì)胞的吉非替尼IC50在STE029濃度為8 μmol/L處理后顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。分別繪制不同藥物處理下各細(xì)胞株的藥物濃度-存活率曲線，以藥物濃度（μmol/L）為橫軸，以存活率（%）為縱軸作圖（圖1）。

2.2吉非替尼、STE029單藥及聯(lián)合用藥對(duì)PC9、PC9/BB4、A549細(xì)胞增殖及凋亡的影響經(jīng)藥物處理后，在PC9及PC9/BB4細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，藥物處理組處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞較少（各組之間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異），而聯(lián)合用藥組較單藥組處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞明顯減少（P＜0.001）；在A549細(xì)胞中，藥物處理組較對(duì)照組處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞少（P＜0.001），而聯(lián)合用藥組與單藥組之間增殖細(xì)胞比例無(wú)明顯差異（圖2）；經(jīng)Hoechst 33258染料染色后，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，呈淡藍(lán)色；在A549細(xì)胞中，聯(lián)合用藥組細(xì)胞的細(xì)胞核固縮、碎裂，大部分細(xì)胞發(fā)生了凋亡，呈高亮藍(lán)色（與對(duì)照組相比，P＜0.01）；在PC9及PC9/BB4細(xì)胞中，各藥物處理組細(xì)胞均可見凋亡細(xì)胞，但各組之間無(wú)明顯差異（P＞0.05）（圖3）。

2.3STE029聯(lián)合吉非替尼對(duì)PC9、PC9/BB4及A549細(xì)胞EGFR通路、細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響在人肺腺癌PC9、PC9/BB4、A549細(xì)胞中，EGFR、Akt、GSK-3β及β-actin的蛋白表達(dá)量未見明顯差異。在PC9及PC9/BB4細(xì)胞中，與各對(duì)應(yīng)的單藥組相比，聯(lián)合用藥組p-EGFR、p-Akt蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.000,1），GSK-3β的蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.001），其下游p-Cyclin D1及Cyclin D1的蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.001）；在A549細(xì)胞中，與各單藥組相比，聯(lián)合用藥能顯著抑制p-Akt的表達(dá)（P＜0.001），而GSK-3β及p-Cyclin D1、Cyclin D1的蛋白表達(dá)卻未見明顯差異（圖4A）。在人肺腺癌PC9、PC9/BB4、A549細(xì)胞中，caspase-9、caspase-9及β-actin的蛋白表達(dá)量未見明顯差異。與各對(duì)照組相比，STE029單藥、吉非替尼單藥及二者聯(lián)合用藥均能誘導(dǎo)凋亡發(fā)生，cleaved caspase-8及cleaved caspase-9的蛋白表達(dá)量均有上調(diào)（P＜0.05）：在PC9、PC9/BB4細(xì)胞株，與單藥組相比，聯(lián)合用藥組cleaved caspase-8及cleaved caspase-9的蛋白表達(dá)量未見顯著升高；在A549細(xì)胞中，聯(lián)合用藥組cleaved caspase-8及cleaved caspase-9的蛋白較各單藥組均明顯上調(diào)（P＜0.001）（圖4B）。

表 1 人肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C9、PC9/BB4、A549細(xì)胞株對(duì)吉非替尼、STE029的IC50Tab 1 Comparison of Gefitinib IC50 and STE029 IC50 in PC9, PC9/BB4, A549 cell lines

2.4吉非替尼、STE029單藥及聯(lián)合用藥對(duì)PC9、PC9/BB4移植瘤成瘤性的影響通過觀察到皮下移植瘤生長(zhǎng)速度發(fā)現(xiàn)，用同等濃度的吉非替尼處理相同時(shí)間后，PC9皮下移植瘤生長(zhǎng)速度明顯慢于PC9/BB4皮下移植瘤，二者間差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000,1）（圖5A），由此可見，與PC9相比，PC9/BB4移植瘤對(duì)吉非替尼顯著耐藥。

經(jīng)重復(fù)測(cè)量的方差分析顯示，PC9皮下移植瘤中各用藥組較對(duì)照組皮下移植瘤的生長(zhǎng)速度有明顯差異（P＜0.01）；STE029單藥與吉非替尼單藥組之間腫瘤生長(zhǎng)速度亦有明顯差異（P＜0.000,1）；與STE029單藥組及吉非替尼單藥組相比，聯(lián)合用藥組皮下移植瘤的生長(zhǎng)明顯受到抑制，移植瘤體積間差異均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（聯(lián)合用藥vsSTE029單藥：P=0.000,4；聯(lián)合用藥vs吉非替尼單藥：P=0.005,4）（圖5B）；PC9/BB4皮下移植瘤中STE029單藥組皮下移植瘤生長(zhǎng)速度與對(duì)照組及吉非替尼單藥組相比無(wú)明顯差異（STE029單藥組vs對(duì)照組：P=0.226,1；STE029單藥組vs吉非替尼單藥組：P=0.903,8）；吉非替尼單藥組及聯(lián)合用藥組與對(duì)照組相比，移植瘤生長(zhǎng)緩慢（吉非替尼單藥vs對(duì)照組：P=0.010,4；聯(lián)合用藥組vs對(duì)照組：P=0.007,9）；聯(lián)合用藥組皮下移植瘤生長(zhǎng)速度顯著低于單藥組（聯(lián)合用藥組vsSTE029單藥：P＜0.000,1；聯(lián)合用藥組vs吉非替尼單藥：P=0.008,5）（圖5B）。

圖 1 各細(xì)胞株在不同藥物處理方式下的存活率回歸曲線圖。A：PC9細(xì)胞；B：PC9/BB4細(xì)胞；C：A549細(xì)胞。Fig 1 Regression curve of survival rate treated with different combination of Gefitinib and STE029. A: PC9 cell; B: PC9/BB4 cell; C: A549 cell.

連續(xù)用藥5周后脫頸法處死裸鼠，取出皮下移植瘤，如圖5C所示，各用藥組之間裸鼠皮下移植瘤大小有明顯差異。經(jīng)F檢驗(yàn)，各組間皮下移植瘤的重量均存在明顯差異（P＜0.000,1）。STE029單藥、吉非替尼單藥及聯(lián)合用藥組的皮下移植瘤的重量均明顯低于對(duì)照組（P＜0.01）；與STE029單藥或吉非替尼單藥組相比，聯(lián)合用藥組皮下移植瘤的重量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），具體結(jié)果見表3及圖5D。

圖 2 PC9、PC9/BB4、A549細(xì)胞在不同藥物處理后檢測(cè)細(xì)胞增殖狀態(tài)。EdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖（×200），處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞為紅色。Fig 2 Cell proliferation was tested by EdU fluorescent staining in PC9, PC9/BB4, A549 cells after treated with different combination of Gefitinib and STE029. Proliferated cells showed red signal by EdU staining (×200).

圖 3 PC9、PC9/BB4、A549細(xì)胞在不同藥物處理后檢測(cè)細(xì)胞凋亡狀態(tài)。Hoechst 33258染液染細(xì)胞后，凋亡細(xì)胞核固縮，呈亮藍(lán)色（×200）。Fig 3 Cell proliferation was tested by EdU fluorescent staining in PC9, PC9/BB4, A549 cells after treated with different combination of Gefitinib and STE029. Cell apoptosis was tested by Hoechst 33258 fluorescent staining, and apoptosis cells showed highlight signal (×200).

圖 4 吉非替尼、STE029聯(lián)合應(yīng)用對(duì)PC9、PC9/BB4、A549細(xì)胞EGFR通路及細(xì)胞周期（A）、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白（B）表達(dá)水平的影響Fig 4 Western-blotting for EGFR signaling pathway and cell cycle-related proteins (A) and cell apoptosis-related proteins (B) in PC9, PC9/BB4, A549 cell lines influenced by Gefitinib or STE029 or Gefitinib+STE029. EGFR: epidermal growth factor receptor.

圖 5 STE029聯(lián)合吉非替尼對(duì)裸鼠體內(nèi)皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響。A：同等劑量吉非替尼干預(yù)后，BALB/c-Nude裸鼠體內(nèi)PC9、PC9/BB4皮下原發(fā)移植瘤的生長(zhǎng)趨勢(shì)，PC9/BB4皮下原發(fā)移植瘤較PC9對(duì)吉非替尼顯著耐藥（P＜0.000,1）；B：藥物干預(yù)后，BALB/c-Nude裸鼠體內(nèi)PC9、PC9/BB4皮下原發(fā)移植瘤的生長(zhǎng)趨勢(shì)；C：對(duì)照組、STE029單藥組、吉非替尼單藥處理組和聯(lián)合用藥組在BALB/c-Nude裸鼠體內(nèi)皮下形成的原發(fā)移植瘤；D：不同處理組皮下移植瘤第35天時(shí)瘤體重量。Fig 5 STE029 overcomes Gefitinib resistance in vivo. Compared to PC9 xenografts, PC9/BB4 xenografts showed significant resistance to Gefitinib(P＜0.000,1) (A); Tumor growth curves (B), Macroscopic appearance (C) and tumor weight (D) of xenografts harvested on day 35 for PC9, PC9/BB4 xenografts according to different treatments. ***: P＜0.001; *: P＜0.05.

3 討論

吉非替尼作為第一代EGFR-TKI的代表藥物，在EGFR敏感突變患者的治療中能取得較為滿意的臨床療效。然而，EGFR-TKI獲得性耐藥常常在治療數(shù)月后出現(xiàn)，具有EGFR-TKI獲得性耐藥的患者則無(wú)法繼續(xù)從吉非替尼治療中獲益。吉非替尼也被用于EGFR野生型患者的治療，往往與含鉑雙藥化療聯(lián)合使用，但治療效果始終差強(qiáng)人意。因此，增加EGFR-TKI在耐藥患者中的敏感性是當(dāng)下基礎(chǔ)與臨床研究中亟待解決的難題。

表 2 人肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C9、PC9/BB4、A549細(xì)胞株聯(lián)合不同濃度STE029處理后對(duì)吉非替尼IC50的影響Tab 2 Comparison of Gefitinib IC50 in PC9, PC9/BB4, A549 cell lines after in combination with STE029

表 3 PC9、PC9/BB4皮下移植瘤第35天時(shí)瘤體重量（g）Tab 3 Tumor weight evaluated on day 35th according to different treatments

前期實(shí)驗(yàn)已驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)所采用的人肺腺癌PC9、PC9/BB4細(xì)胞中EGFR基因的外顯子19均存在15 bp的缺失突變，屬于最為常見的EGFRI類突變。并且，PC9/BB4細(xì)胞未檢測(cè)到T790M的突變，說明其獲得性耐藥的產(chǎn)生與T790M耐藥突變之間無(wú)明顯相關(guān)性。本研究采用的人肺腺癌A549細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期穩(wěn)定培養(yǎng)的EGFR野生型細(xì)胞，對(duì)吉非替尼天然耐藥，亦是研究EGFR-TKI對(duì)肺腺癌作用機(jī)制較為常用的細(xì)胞株。因此，以敏感株P(guān)C9細(xì)胞為參照，使用PC9/BB4以及A549細(xì)胞來研究如何克服NSCLC EGFR-TKI耐藥，可為對(duì)第三代TKI藥物不敏感的患者提供新的治療思路，具有更為重要的臨床意義。

通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，本研究證實(shí)了STE029可逆轉(zhuǎn)肺腺癌吉非替尼耐藥。在體外，STE029抑制肺腺癌細(xì)胞增殖，并可顯著增加人肺腺癌EGFR突變型和野生型細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性；ST029、吉非替尼均可抑制肺腺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，二者聯(lián)用均可使上述抗腫瘤作用增強(qiáng)。在體內(nèi)，STE029聯(lián)合吉非替尼可顯著抑制人肺腺癌皮下移植瘤的生長(zhǎng)和成瘤。

作為EGFR下游信號(hào)通路中最重要的一部分，PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑在EGFR突變型及野生型細(xì)胞耐藥及耐藥逆轉(zhuǎn)中均發(fā)揮了重要作用。已有研究[19]表明，PI3K/Akt信號(hào)通路在多類腫瘤細(xì)胞中呈過度激活狀態(tài)，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、血管生成，抑制細(xì)胞凋亡以及促進(jìn)細(xì)胞免疫逃逸及耐藥性產(chǎn)生。PI3K/Akt信號(hào)通路參與腫瘤耐藥的機(jī)制十分復(fù)雜，其中，抗凋亡和細(xì)胞周期的激活是其主要發(fā)揮作用的兩個(gè)方面。過度激活的PI3K/Akt可抑制caspase家族成員的活化而抑制凋亡[20]。caspase家族在細(xì)胞凋亡過程中起到非常重要的作用，其成員分為始動(dòng)caspase（caspase-1、-2、-4、-5、-8、-9）和效應(yīng)caspase（caspase-3、-6、-7、-14）兩類。一般情況下，當(dāng)細(xì)胞接收到死亡信號(hào)后，線粒體釋放的Cty C結(jié)合并激活凋亡酶激活因子-1（apoptotic protease activating factor-1, Apaf-1），活化的Apaf-1可直接與caspase-9結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。然而，過度活化的Akt可通過磷酸化caspase-9而阻礙其與上游蛋白的結(jié)合，導(dǎo)致凋亡過程無(wú)法順利啟動(dòng)；caspase-8則可被活化的Fas和TNFR所激活，進(jìn)而啟動(dòng)凋亡過程[20,21]，Akt可通過直接抑制Fas的激活從而抑制caspase-8依賴的細(xì)胞凋亡。吉非替尼可通過直接抑制EGFR的激活而抑制其下游Akt的激活已得到廣泛證實(shí)，亦有研究[22]發(fā)現(xiàn)HMGCR可抑制內(nèi)皮細(xì)胞中Akt的磷酸化。本研究發(fā)現(xiàn)，STE029協(xié)同吉非替尼作用于人肺腺癌TKI敏感及耐藥細(xì)胞，均能顯著抑制p-Akt的表達(dá)，在EGFR基因野生型的A549細(xì)胞中還伴隨有cleaved caspase-8、cleaved caspase-9蛋白表達(dá)的上調(diào)，說明STE029克服A549細(xì)胞吉非替尼耐藥與PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制以及凋亡的激活有關(guān)，但二者之間是否存在直接的調(diào)控關(guān)系還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

GSK-3是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是一種常見的糖原合成酶激酶的限速酶，有α、β兩個(gè)亞型。近年來，已有大量的研究[23-25]證實(shí)，GSK-3β在多種腫瘤中存在異常表達(dá)，作為細(xì)胞外因子/胞質(zhì)蛋白（Wnt/β-catenin）信號(hào)通路中的重要調(diào)節(jié)蛋白。GSK-3β是一種負(fù)性調(diào)節(jié)因子，其過表達(dá)將通過促進(jìn)β-catenin的磷酸化進(jìn)而促進(jìn)β-catenin的降解，解除β-catenin對(duì)核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF的活化作用，進(jìn)而下調(diào)TCF/LEF目的基因如c-myc和Cyclin D1的表達(dá)，最終達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[26,27]。Cyclin D1是細(xì)胞周期中推動(dòng)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵蛋白，抑制Cyclin D1則可將細(xì)胞阻滯于G0期/G1期，無(wú)法繼續(xù)增殖。GSK-3β確切的調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚，有研究[26]顯示，過度激活的PI3K/Akt信號(hào)通路可通過磷酸化GSK-3β而抑制其活性，從而促進(jìn)原癌基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，STE029協(xié)同吉非替尼作用于人肺腺癌EGFR突變細(xì)胞，在抑制磷酸化Akt激活的同時(shí)，GSK-3β活性成分在細(xì)胞中累積增多，同時(shí)伴有Cyclin D1蛋白表達(dá)量的顯著下調(diào)，這說明，STE029克服PC9/BB4細(xì)胞吉非替尼耐藥與PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制、GSK-3β高活性及細(xì)胞增殖的阻滯有關(guān)，但三者之間是否存在直接的調(diào)控關(guān)系還無(wú)法就此定論。

綜上，本研究證實(shí)了STE029可逆轉(zhuǎn)人肺腺癌EGFR突變和野生型細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥性。STE029與吉非替尼聯(lián)合可上調(diào)GSK-3β的表達(dá)，抑制Cyclin D1的表達(dá)，抑制PC9、PC9/BB4細(xì)胞的增殖，亦可通過caspase-8、caspase-9途徑誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。然而，不論何種抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用，在提高療效的同時(shí)也將增加藥物毒副作用。因此，如何在提高治療效果的同時(shí)減輕藥物不良反應(yīng)也是后續(xù)研究和應(yīng)用中需要關(guān)注和解決的重點(diǎn)問題。

Author contributions

Zhou QH, Li Y and Huang L conceived and designed the study. Huang L performed the experiments. Huang L and Liu JW analyzed the data. Shen W contributed analysis tools. Zhou QH and Hou M provided critical inputs on design, analysis,and interpretation of the study. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.