探索提高肺癌腦膜轉(zhuǎn)移腦脊液細胞學病理檢測陽性率的方法及影響因素

高乃升 滕沖 范承娟 信濤

近年來，肺癌靶向治療及免疫治療進展迅速，肺癌患者生存期延長，但肺癌腦膜轉(zhuǎn)移癌（leptomeningeal metastases, LM）發(fā)病率正在不斷升高[1,2]。因LM臨床癥狀復雜，影像學表現(xiàn)不典型，最終只能依靠腦脊液細胞病理學進行確定診斷，所以臨床診斷、治療往往滯后于臨床表現(xiàn)，進而影響了肺癌LM的治療及預后[3]。腦脊液中檢出腫瘤細胞是LM診斷的金標準，傳統(tǒng)的腦脊液固定送檢方式為普通塑料試管封閉后送檢離心、液基涂片檢查，其細胞病理學陽性率不高[4]，而腦脊液離體后蛋白會很快降解，這種保存方式是否為影響腦脊液陽性率的因素，腦脊液樣本離體后立即固定是否會增加腦脊液細胞學陽性檢出率，目前尚無此方面的研究。

鞘內(nèi)化療（intrathecal chemotherpy, ITC）可以通過腰椎穿刺等方法將抗腫瘤藥物直接注入腦脊液中，被認為是治療LM的可靠手段。培美曲塞作為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的一線治療常用藥物，本課題組綜合臨床及基礎(chǔ)研究成果，于2018年注冊并完成首個國際原創(chuàng)性單臂二期臨床研究培美曲塞聯(lián)合地塞米松鞘內(nèi)注射治療表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）突變肺癌多線酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）治療失敗后LM安全性及療效研究（注冊號：ChiCTR1800016615）。該研究探索了培美曲塞鞘內(nèi)注射的安全劑量，研究結(jié)果顯示培美曲塞鞘內(nèi)注射多線靶向治療失敗肺癌LM取得很好的療效（客觀有效率超過80%）中位總生存期（median overall survival, mOS）超過9個月，安全性也明顯好于傳統(tǒng)藥物[5]，并將培美曲塞鞘內(nèi)注射寫入LM治療指南[6-9]。在試驗過程中我們發(fā)現(xiàn)采用傳統(tǒng)固定方式細胞病理陽性率不足50%，是否因腦脊液固定方式的問題導致陽性檢出率低成為我們的研究熱點問題。2021年1月經(jīng)與我院病理科溝通，臨床工作中采用TIB細胞保存液試劑盒保存腦脊液的方式后，我們發(fā)現(xiàn)腦脊液細胞病理學陽性檢出率顯著提高，因此本試驗回顧性分析通過不同腦脊液固定方式對腦脊液細胞學并配合腦脊液生化檢查的研究，探索提高LM的診斷方法，及其在判斷預后的臨床應用價值，旨在建立一種簡便、可靠、高效的系統(tǒng)立體診斷方法，為LM的機制研究診斷和治療提供保障。

1 材料與方法

1.1一般資料收集2019年6月-2021年11月于哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院腫瘤內(nèi)科二病房收治的105例依據(jù)臨床癥狀和影像學陽性表現(xiàn)診斷為肺腺癌腦膜轉(zhuǎn)移，同時于我科接受培美曲塞鞘內(nèi)化療的患者。①既往明確肺腺癌病史的患者；②新近出現(xiàn)的臨床癥狀/體征，如頭痛、 惡心、嘔吐等精神神經(jīng)癥狀；③典型的如腦膜強化等影像學表現(xiàn)；④充分知情同意告知；其中LM的診斷需同時滿足條件①的前提下加上②、③或其中之一。排除標準：①合并嚴重全身感染、局部感染或嚴重的基礎(chǔ)疾病；②存在意識障礙；③心肺功能差不能耐受后續(xù)治療。

1.2試驗材料TIB細胞保存液試劑盒［泰普生物科學（中國）有限公司］；主要成分為氯化鈉、氯化鉀、乙酸鈣、甲醇、EDTA。

1.3試驗方法

1.3.1試驗設(shè)計本試驗為回顧性研究，以依據(jù)臨床癥狀和影像學陽性表現(xiàn)診斷為LM患者腦脊液作為研究對象，根據(jù)不同送檢方式分為應用TIB細胞保存液試劑盒收集并送檢腦脊液的標本（實驗組）和常規(guī)應用腰穿包內(nèi)無菌塑料試管收集并送檢腦脊液的標本（對照組），將首次進行腦脊液細胞病理學檢測患者的腦脊液納入研究，探索不同固定送檢方式對腦脊液細胞病理學陽性率的影響；應用Logistic回歸分析結(jié)果評價腦脊液生化檢測與腦脊液細胞病理學陽性率的相關(guān)性，并根據(jù)受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve, ROC）評估腦脊液生化對肺癌LM的診斷價值；動態(tài)監(jiān)測于我科接受培美曲塞鞘內(nèi)化療并進有完整的腦脊液細胞學及腦脊液生化（葡萄糖、總蛋白）檢測≥2個周期的患者，研究培美曲塞鞘內(nèi)注射治療后腦脊液生化指標與細胞學變化對臨床療效的影響及對指導預后的臨床應用價值。

1.3.2腦脊液采集方法在無菌條件下對入組患者進行腰椎穿刺術(shù)，實驗組為2021年1月-2021年11月共52例患者使用TIB細胞保存液試劑盒收集的5 mL腦脊液，對照組為2019年6月-2020年12月共53例患者使用腰穿包內(nèi)無菌塑料試管收集的5 mL腦脊液，于2 h-4 h內(nèi)送檢病理科行腦脊液細胞病理學檢查。將全部患者首次腦脊液送檢的細胞病理學標本納入腦脊液細胞病理學陽性率的研究。同時患者均使用2支無菌管各收集1 mL腦脊液分別于2 h-4 h內(nèi)送檢生化（總蛋白、葡萄糖）檢測，留取標本后行培美曲塞鞘內(nèi)注射治療。

1.3.3治療方法培美曲塞鞘內(nèi)注射前需要進行相應預處理，口服葉酸、肌注維生素B12，葉酸口服至末次鞘內(nèi)用藥結(jié)束后21 d；患者進行50 mg培美曲塞+1 mg地塞米松的鞘內(nèi)注射化療，每3周（21 d）為1個用藥周期。

1.4療效評估所有患者均經(jīng)腰椎穿刺術(shù)留取腦脊液，記錄腦脊液細胞學結(jié)果，生化項目指標（腦脊液葡萄糖正常值范圍2.5 mmol/L-4.5 mmol/L、腦脊液總蛋白正常值范圍180 mg/L-430 mg/L）。陽性結(jié)果判定為腦脊液見核異型或腫瘤細胞。治療后根據(jù)RANO標準進行療效評估。

1.5統(tǒng)計分析采用R語言統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，所測結(jié)果滿足正態(tài)分布且方差齊的變量采用Studentt檢驗，方差不齊采用近似t檢驗，偏態(tài)分布的變量采用秩和檢驗，分類變量采用卡方或Fisher精確性檢驗。利用Logistic回歸分析建立診斷模型，并通過ROC曲線評價診斷價值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1一般臨床資料結(jié)果在2019年6月-2021年11月期間共入組105例患者，原發(fā)灶病理分型均為肺腺癌，其中男性31例，女性74例，平均年齡為53歲，所有患者表示出相應的大腦或腦膜受累癥狀，約90%患者存在相關(guān)基因突變，并均給予腰椎穿刺檢查。詳見表1。

表 1 腦膜轉(zhuǎn)移癌患者基線特征Tab 1 Clinical features of baseline patients with leptomeningeal metastases

2.2腦脊液細胞學檢測結(jié)果在無菌條件下對105例入組患者進行腰椎穿刺術(shù)行腦脊液細胞學檢測，實驗組中42例（80.77%）患者首次腦脊液細胞學檢查結(jié)果為陽性，10例（19.23%）患者結(jié)果為陰性；對照組中24例（45.28%）患者首次腦脊液細胞學檢查結(jié)果為陽性，29例（54.72%）患者首次檢查結(jié)果為陰性，有統(tǒng)計學差異（P＜0.001）。

2.3腦脊液生化檢測輔助診斷結(jié)果對105例患者均行腦脊液生化檢查，其中于首次治療前行腦脊液葡萄糖檢查患者共105例，腦脊液葡萄糖＜2.5 mmol/L共37例（35.24%），≥2.5 mmol/L共68例（64.76%），105例患者中腦脊液細胞學陽性共66例（62.85%），陰性共39例（37.14%）；首次治療前行腦脊液總蛋白檢查患者共71例，腦脊液總蛋白＜430 mg/L共27例（38.03%），≥430 mg/L共44例（61.97%），71例患者中腦脊液細胞學陽性共53例（74.65%），陰性共18例（25.35%）。

首次行腦脊液生化檢測的患者分別行Logistic回歸分析結(jié)果顯示，腦脊液葡萄糖＜2.5 mmol/L發(fā)生腦脊液細胞病理學陽性風險是腦脊液葡萄糖≥2.5 mmol/L的2.456倍（OR=2.456,P＜0.05），腦脊液總蛋白≥430 mg/L發(fā)生腦脊液細胞病理學陽性風險是腦脊液總蛋白＜430 mg/L的2.647倍（OR=2.647,P＞0.05）。ROC曲線顯示，腦脊液中葡萄糖靈敏度為76.9%，特異度為54.5%，Youden指數(shù)為0.315，曲線下面積（area under the curve, AUC）為0.620；腦脊液中總蛋白靈敏度為44.4%，特異度為90.6%，Youden指數(shù)為0.350，AUC為0.671（圖1）。

圖 1 腦脊液生化檢測的診斷價值。A：腦脊液葡萄糖診斷價值；B：腦脊液總蛋白診斷價值。Fig 1 Cerebrospinal fluid biochemical testing's diagnostic utility. A: Diagnostic value of cerebrospinal fluid glucose test; B: Diagnostic value of cerebrospinal fluid total protein; AUC: area under the curve.

2.4培美曲塞鞘內(nèi)治療后腦脊液生化檢測結(jié)果

2.4.1腦脊液葡萄糖檢測結(jié)果本部分共納入73例行2個周期培美曲塞鞘內(nèi)注射治療后，有完整的腦脊液細胞學和腦脊液生化（葡萄糖）檢測的患者，腦脊液細胞學轉(zhuǎn)陰率逐漸增加，治療1個周期后轉(zhuǎn)陰率為4.35%，治療2個周期后為13.04%。治療2個周期后腦脊液葡萄糖水平較治療前升高，有統(tǒng)計學差異（P＜0.001）（表2）。對首次腦脊液細胞學中46例陽性患者，27例陰性患者治療后腦脊液葡萄糖分別做橫向、縱向評估，治療2個周期后葡萄糖水平均升高，無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（表3）。

2.4.2腦脊液總蛋白檢測結(jié)果50例行2個周期培美曲塞鞘內(nèi)注射治療后，并有完整的腦脊液細胞學和腦脊液生化（總蛋白）檢測患者中，腦脊液細胞學轉(zhuǎn)陰率逐漸增加，治療1個周期后轉(zhuǎn)陰率為5.26%，治療2個周期后為13.16%。治療2個周期后腦脊液總蛋白水平較治療前升高，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表2）。對首次腦脊液細胞學中38例陽性患者、12例陰性患者治療后腦脊液總蛋白分別做橫向、縱向評估，首次細胞學陽性患者中治療2個周期后腦脊液總蛋白水平降低，陰性患者中腦脊液總蛋白水平升高，無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（表4）。

3 討論

腦脊液作為LM的最佳液體診斷標本，是目前細胞病理學診斷的主要載體，提高LM腦脊液中細胞病理學診斷的陽性率一直是臨床研究的熱點。

LM患者早期表現(xiàn)并不典型，晚期由于腦脊液回流受阻，會出現(xiàn)相應的顱內(nèi)壓增高表現(xiàn)。既往關(guān)于實體瘤或淋巴瘤的LM研究中，頭痛、精神狀態(tài)異常和顱神經(jīng)功能障礙是最常見的癥狀[10]。磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）上的特征性發(fā)現(xiàn)是腦膜強化，最明顯的是在小腦葉之間的顱底，沿顱神經(jīng)以及脊髓和神經(jīng)根周圍，在對187例LM患者的回顧性研究中顯示，53%的患者通過影像學確診，23%通過細胞學確診，24%通過兩者共同確診，但值得關(guān)注的是，LM影像學一經(jīng)確診提示預后極差[11,12]。由于不顯著的影像學表現(xiàn)和早期臨床癥狀，使LM誤診或漏診概率增加，從而喪失最佳治療時間，因此腦脊液細胞學結(jié)果就尤為重要。腦脊液被認為是EGFR突變型NSCLC中LM最有代表性的檢測標本[13,14]，但是研究表明LM患者在首次腦脊液樣本中發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的概率不超過50%[4]。實際的臨床工作中，由于腦脊液細胞學陽性率不高，導致部分LM患者診斷不明確，并且由于LM患者疾病進展快、預后差的特點，不及時的診斷使我們的治療也變得相對困難。

表 2 治療前后腦脊液生化變化情況Tab 2 Cerebrospinal fluid biochemical changes before and after treatment

表 3 首次腦脊液細胞學陰性、陽性組患者治療前后腦脊液葡萄糖變化情況Tab 3 Changes of CSF glucose in the cytological negative and positive groups before and after treatment

表 4 首次腦脊液細胞學陰性、陽性組患者治療前后腦脊液總蛋白變化情況Tab 4 Changes of total protein in CSF cytology negative and positive groups before and after treatment

本研究在前期臨床工作中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)影像學及臨床癥狀明確診斷為LM的患者中，腦脊液細胞學陽性率不顯著，是否腦脊液細胞學檢查的敏感性在一定程度上受到了腦脊液細胞學檢查方式的影響，因此我們提出如何能在臨床工作中簡便、高效地提高腦脊液細胞學陽性率。在本試驗結(jié)果中，首次腦脊液細胞學陽性率（80.77%）遠高于既往研究，我們分析實驗組中TIB細胞保存液試劑盒的成分主要為氯化鈉、氯化鉀、乙酸鈣、甲醇、EDTA等，其中氯化鈉、氯化鉀在細胞固定時使細胞內(nèi)外維持一個穩(wěn)定、合理的滲透壓，甲醇具有縮短固定時間、結(jié)構(gòu)顯示清晰等優(yōu)點[15]。綜合相關(guān)因素考慮腦脊液的離體固定可認為是臨床工作中重要的組成部分，也是核心元素之一，在對腦脊液進行離體后立即固定的方式，可能使腦脊液中的腫瘤細胞在外界環(huán)境中變化的概率下降，有助于細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整表達，并且此方式簡便、高效，可作為臨床工作中提高腦脊液細胞學陽性檢出率的有效方法。

由于細胞學分析的敏感性尚不完善，因此還在尋找是否存在相關(guān)檢測指標的異常變化，可以在臨床工作中高度警示LM發(fā)生，降低漏診率。有研究[16,17]顯示由于腦脊液流動受阻，至少50%的患者的腦脊液壓力升高，約80%的病例腦脊液蛋白濃度升高，在沒有感染的情況下，25%-40%的病例葡萄糖水平降低。腦脊液檢查結(jié)果的異?？商崾荆ǖ窃\斷性）LM的發(fā)生。理想情況下，這些指標不僅具有診斷價值，而且具有預后價值，從而有助于選擇適當?shù)闹委煼椒?。本試驗通過對腦脊液生化檢測Logistic回歸分析結(jié)果得出，腦脊液葡萄糖＜2.5 mmol/L是LM具有診斷價值的因素（P＜0.05）。在ROC曲線中，AUC數(shù)值越接近于1，表示診斷效果越佳，通過分析ROC曲線得出兩者AUC值均提示對LM患者具有一定的診斷價值。通過此研究提示在臨床工作中，當腫瘤患者存在陽性臨床癥狀且腦脊液葡萄糖降低、總蛋白升高時應高度懷疑LM的可能。并且對于具有LM臨床癥狀的患者，如果出現(xiàn)腦脊液細胞學診斷陰性應該進行連續(xù)動態(tài)檢測并伴隨理化檢查及相關(guān)基因檢測（驅(qū)動基因陽性肺癌患者），可以提高LM診斷的陽性率。

患者生活質(zhì)量的提高和生存期的延長仍是LM的診治目標。既往研究[18]中已確定的影響預后的因素包括：低腫瘤患者卡氏（KarnofskyPerformance Status, KPS）評分、多發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、嚴重的神經(jīng)功能障礙、腦實質(zhì)病變等。有研究[19]顯示腦脊液中大量循環(huán)腫瘤細胞消耗葡萄糖，腦膜的廣泛和彌漫性受累可能會導致葡萄糖轉(zhuǎn)移受損，導致腦脊液中葡萄糖減少，并且腦脊液中葡萄糖減少、蛋白升高是LM的患者中不良預后因素。但是Hitchins等[20]報告中初始腦脊液蛋白升高（＞0.5 g/L）的患者卻比初始水平較低的患者臨床緩解率更高（65%vs13%,P＜0.05）。因此相關(guān)指標的臨床意義應繼續(xù)探討。

鞘內(nèi)化療的優(yōu)點在于可以不通過血-腦屏障障礙，通過腰椎穿刺等給藥手段將藥物直接注入腦脊液中，小劑量獲得高濃度[21]。培美曲塞聯(lián)合鉑類目前被認為是晚期NSCLC，特別是非鱗狀細胞惡性腫瘤患者的一線治療方案[22,23]。在我科前期研究[5]中，確定了培美曲塞50 mg為NSCLC LM患者鞘內(nèi)注射的安全劑量，并且培美曲塞鞘內(nèi)化療具有良好的臨床療效和安全性。本試驗通過對同時于我科接受培美曲塞鞘內(nèi)化療≥2個周期進行動態(tài)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，在腦脊液細胞學結(jié)果中，治療后腦脊液細胞學轉(zhuǎn)陰率均逐漸增加，提示鞘內(nèi)治療對腫瘤細胞的清除存在相關(guān)作用。腦脊液生化檢測方面，腦脊液葡萄糖水平治療2個周期后較治療前升高，存在統(tǒng)計學差異（P＜0.001）。由此我們考慮是否可以將腦脊液葡萄糖作為指導預后的指標之一，繼續(xù)進行多周期鞘內(nèi)注射治療患者的研究，通過動態(tài)監(jiān)測腦脊液中葡萄糖變化，綜合多因素評估治療效能，通過腦脊液葡萄糖的變化尋找合適的鞘內(nèi)治療周期及持續(xù)時間等。本試驗的不足在于，作為回顧性研究，受到患者經(jīng)濟條件、腦脊液取樣的標本量及自身條件限制，未能對同一患者進行自身對照的前瞻性研究。理論上來講總蛋白含量可能成為陽性診斷的指標，但是本試驗結(jié)果不明顯，考慮腦脊液生化檢測未采用細胞固定液進行檢測，因此后續(xù)試驗中建議所有腦脊液樣本送檢生化均采用Streck Cell-Free DNA BCT試管送檢，并在擴大樣本量的基礎(chǔ)上行后續(xù)探討。

綜上所述，腦脊液離體后的立即固定處理并送檢是影響LM患者腦脊液細胞學陽性檢出率的重要因素，這種看似簡單的操作可以顯著影響LM的診斷率，應該在臨床工作中給予充分的重視。對于臨床癥狀和影像學陽性初步診斷為LM的患者，采取細胞病理學和腦脊液生化指標綜合評估可以提高LM的檢出率，并且當肺癌患者出現(xiàn)腦膜刺激癥狀時，應給予高度重視，早診斷早治療會延長患者的生存時間、提高患者的生存質(zhì)量。

Author contributions

Gao NS, Xin T, Teng C and Fan CJ designed the study.Gao NS performed the experiments. Gao NS analyzed the data.Gao NS and Xin T contributed analysis tools. Gao NS, Xin T,Teng C and Fan CJ provided critical inputs on design, analysis,and interpretation of the study. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.