TLRs信號通路和TLRs的Cross-talk在炎癥性疾病中作用的研究進展

蔣孫班,康思思,趙利娜,王 朝,蔣麗娜

（1.河北北方學院醫(yī)學檢驗學院免疫教研室，河北 張家口 075000；2.河北省張家口市第二醫(yī)院患者回訪中心，河北 張家口 075000）

Toll樣受 體（Toll-like receptors，TLRs）是模式識別受體（Pattern recognition receptor，PRR）的一種，由其家族成員內(nèi)一系列蛋白分子組成，通過識別微生物共有的病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）和內(nèi)源性的損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）傳遞的信號，進而通過通路下游一系列分子激活先天免疫和適應(yīng)性免疫，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。TLR的Cross-talk主要通過髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，My D88）和含TIR結(jié)構(gòu)域的配體誘導β干擾素（TIR-domain-containing adaptor inducing interferonβ，TRIF）及其下游通路分子誘導，并在維持免疫穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮相應(yīng)功能［1］。研究［2-4］顯示：TLRs與免疫細胞中存在的其他PRR（包括其他TLRs）、免疫分子和蛋白酶類之間存在Crosstalk，并在炎癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。TAN等［5］對TLRs及其Cross-talk在增加機體先天免疫的特異性中的作用進行了總結(jié)，認為TLRs的Cross-talk在自身免疫和免疫防御過程中發(fā)揮重要作用。本文作者結(jié)合近年來國內(nèi)外相關(guān)研究，對TLRs信號通路及TLRs的Cross-talk在各種炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展中的作用進行綜述。

1 TLRs及其信號通路

TLRs廣泛分布于上皮細胞、淋巴細胞、樹突狀細胞、內(nèi)皮細胞和巨噬細胞等細胞表面，分布于免疫器官和心、腦、肺、肝及腎等臟器組織中［6］，多與宿主防御功能有關(guān)［7］。TLRs是由細胞內(nèi)Toll-白細胞介素1受體（Toll-interleukin 1 receptor，TIR）、胞外富含亮氨酸的重復性單位（leucinerich repeat，LRR）和跨膜區(qū)三部分構(gòu)成的Ⅰ型跨膜蛋白組成，其胞外結(jié)構(gòu)域可介導PAMPs分子的識別［8］，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域?qū)⑹荏w的識別信號向下游轉(zhuǎn)導［9-10］。細胞中定位合適的TLRs對于其配體親和性及TLRs自身結(jié)構(gòu)的維持和信號轉(zhuǎn)導的激活至關(guān)重要。TLRs信號通路在調(diào)控免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用［11］。TLRs信號通路中MyD88是介導信號通路和先天免疫反應(yīng)信號途徑中重要的關(guān)鍵接頭分子，也是機體內(nèi)重要的信號傳導蛋白。MyD88通過調(diào)控信號傳導途徑可實現(xiàn)其生物學功能［12］，MyD88的缺失可導致下游免疫相關(guān)信號的活化和失活及信號轉(zhuǎn)導的中斷，其也參與活化核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號級聯(lián)放大反應(yīng)［13］。TLRs信號轉(zhuǎn)導主要通過My D88、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和NF-κB的激活發(fā)揮功能［14］。因此，根據(jù)TLRs信號轉(zhuǎn)導過程是否有My D88的參與，將TLRs信號轉(zhuǎn)導通路分為依賴MyD88的TLRs信號轉(zhuǎn)導通路和不依賴MyD88的TLRs信號轉(zhuǎn)導通路［15-16］。而在2條通路的下游信號分子中，腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3（tumor necrosis factor receptor associated factors 3，TRAF3）和腫瘤壞死因子受體作用因子6（TNF receptor associated factors 6，TRAF6）是關(guān)鍵的節(jié)點。

1.1 MyD88依賴信號通路MyD88具有N端的死亡結(jié)構(gòu)域和C端的TIR結(jié)構(gòu)域［17］。在依賴MyD88的信號轉(zhuǎn)導通路中，C端的TIR結(jié)構(gòu)域和TLRs的TIR相互結(jié)合，N端死亡結(jié)構(gòu)域和白細胞介素1受體相關(guān)激酶 （interleukin-1 receptor-associated kinase，IRAK）死亡結(jié)構(gòu)域相互作用，MyD88募集IRAK結(jié)合，募集的IRAK自身磷化后脫離MyD88，與作為重要節(jié)點的TRAF6結(jié)合后，分化出NF-κB和JAK/APK 2條不同的信號傳導途徑，激活轉(zhuǎn)化生長因子β活化激酶1（transforming growth factor-β-activated kinase 1，TAK1）和MAPK激酶6（MAP kinase kinase 6，MKK 6）的活化后轉(zhuǎn)位而激活下游的NF-κB、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和MAPK的p38信號通路的轉(zhuǎn)導，從而誘導白細胞介素1（interleukin-1，IL-1）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素12（interleukin-12，IL-12）和腫瘤壞死因子（tumour necrosis factor，TNF）等促炎細胞因子的分泌，自然殺傷細胞達到炎癥的部位，進行消滅病原體，完成轉(zhuǎn)導過程［18］。

1.2 My D88非依賴性信號通路MyD88缺失TLR4不缺失的小鼠樹突狀細胞仍可成熟。研究［15，19-20］顯示：MyD88存在同源蛋白，也證實了MyD88非依賴信號通路的存在；同時其也被稱為TRIF依賴途徑，在TLRs家族中只存在于TLR3和TLR4的下游通路［21］。TRIF分別與TRAF6和TRAF3相互作用并招募下游分子，最終在細胞核中共同作用于NF-κB活化過程。研究［22］顯示：該信號通路中LPS刺激可導致TRAF3招募的干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）的活化，進而對下游信號進行調(diào)節(jié)。MyD88同源蛋白有TIR結(jié)構(gòu)域的連接蛋白（MyD88轉(zhuǎn)接樣蛋白，包括TIRAP和MAL），在TRIF依賴信號通路中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究［23］顯示：另一種含有TIR結(jié)構(gòu)域的銜接蛋白1（TIR domain containing adapter molecule-1，TICAM-1）可誘導產(chǎn)生IRF3，IRF3由羧基末端的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化協(xié)同調(diào)控完成轉(zhuǎn)錄的活性，病毒在自我復制過程中產(chǎn)生的dsRNA被TLR3識別活化TRAF6下游的TANK結(jié)合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK 1），使IRF3羧基末端的絲氨酸殘基磷酸化，使其從細胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移至細胞核中，磷酸化的IRF3和干擾素刺激的反應(yīng)成分ISRES共同作用，誘導靶基因IFN和ISG56的激活及轉(zhuǎn)錄?？梢娫贛yD88依賴信號通路和TRIF依賴途徑中，TRAF3或TRAF6均作為重要的分子，使上游信號向不同方向正確傳遞。

2 TLRs的Cross-talk

TLRs通過結(jié)合入侵的病原體，并激發(fā)下游信號通路而在機體免疫中起關(guān)鍵作用，但TLRs受體本身無法完全賦予炎癥屬性和特征。反之，在炎癥發(fā)展進程中，TLRs與不同的細胞內(nèi)外信號分子結(jié)合并與其他調(diào)節(jié)途徑發(fā)生Cross-talk的能力是決定炎癥反應(yīng)的類型、強度和持續(xù)時間的重要因素［24］。已有研究［24-27］顯示：Fc受體（Fc receptor，F(xiàn)cR）、補體（complement，C）、PRR和一些信號分子通過與TLRs的Cross-talk調(diào)節(jié)，在細胞分泌炎性細胞因子與炎癥進程等過程中起重要作用。一方面，上述分子被上游的病原體激活后，進而激活其下游的信號分子通路，通過與活化的TLRs下游通路產(chǎn)生協(xié)同作用或在某一水平上匯合，促進白細胞介素（interleukin，IL）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等細胞因子的釋放，以加強免疫應(yīng)答，促進T輔助細胞類別轉(zhuǎn)換和減少病原體的免疫逃逸。另一方面，為防止炎癥相關(guān)通路的過度激活或體內(nèi)出現(xiàn)免疫抑制的微環(huán)境，某些信號分子會作為TLRs通路的抑制分子，通過下調(diào)TLRs的表達，干擾TLRs與配體的識別和抑制TLRs的信號轉(zhuǎn)導來降低免疫應(yīng)答。不過，這種Cross-talk作用具有兩面性，功能正常時其在宿主的免疫防御中起重要作用，而在其功能紊亂時可能引發(fā)針對機體自身抗原的免疫應(yīng)答、炎癥失控甚至休克。

3 TLRs的Cross-talk與炎癥性疾病

3.1 TLRs的Cross-talk與系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）SLE的病因及其發(fā)病機制尚不完全清楚，研究者［28］認為：SLE發(fā)病的主要原因為遺傳與環(huán)境因素相互作用引起機體免疫功能紊亂，病原微生物感染人體誘導疾病發(fā)生。TLRs在類風濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種自身免疫性疾病的外周血單個核細胞中可被外源性的病原體和內(nèi)源性的損害分子激活，導致核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）和干擾素調(diào)節(jié)因子（interferon regulatory factor，IRF）轉(zhuǎn)入細胞核激活炎性細胞因子和趨化因子，使其在自身免疫性疾病中表達上調(diào)［29-30］。

已有研究［31］顯示：許多細胞因子在SLE的發(fā)病過程中起重要作用，其中B細胞活化因子（B cell-activating factor，BAFF）被認為是其中具有代表性的細胞因子。同時，超過一半的活動性SLE患者在基因表達分析［32］結(jié)果中顯示具有Ⅰ型干擾素明顯升高的特點。而缺乏Ⅰ型干擾素受體的基因修飾小鼠的特征為對狼瘡樣疾病有高度抗性。SLE的特征之一為B細胞反應(yīng)過度，而Ⅰ型干擾素是TLRs通路的下游產(chǎn)物，提示TLRs信號通路可能與B細胞的激活過程發(fā)生協(xié)同，通過降低B細胞反應(yīng)的閾值增加B細胞的反應(yīng)強度。研究［33］顯示：B細胞中的BAFF通過結(jié)合跨膜激活物、鈣調(diào)節(jié)物、親環(huán)蛋白配體相互作用物（transmembrane activator and calcium modulator and cyclophilin ligand interactor，TACI），一種對于BAFF轉(zhuǎn)基因小鼠中類別轉(zhuǎn)換自身抗體的產(chǎn)生至關(guān)重要的受體，與TLR7下游中的MyD88通路發(fā)生協(xié)同，促進未成熟B細胞的類別轉(zhuǎn)換和自身抗體的產(chǎn)生。抑制TLR7信號通路對TACI的影響有限，但足以減少自生抗體的產(chǎn)生。除此之外，漿細胞中TLR7信號通路也產(chǎn)生了類似效應(yīng)。TLR7的功能增強可以引起生發(fā)中心（germ center，GC）自發(fā)形成和濾泡外體細胞高頻突變，促進漿細胞分化，使自身免疫表型增加［34］。有研究［35］顯示：對于維持GC結(jié)構(gòu)至關(guān)重要的濾泡樹突狀細胞，在特異性狼瘡中連接補體受體CD21結(jié)合補體形成自身免疫復合物后，通過TLR7途徑表達Ⅰ型干擾素。該途徑對于自發(fā)GC的形成和同型轉(zhuǎn)換自身抗體的產(chǎn)生很重要。此外，TLR7和TLR9的Cross-talk在SLE的發(fā)病過程中起重要作用。UNC93B1蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一種蛋白，NC93B1蛋白中不同的氨基酸與TLR7和TLR9結(jié)合，帶有N端D34A突變的UNC93B1與TLR9正常相互作用，但與TLR7的相互作用較野生型UNC93B1強。增強的UNC93B1-TLR7結(jié)合增加了TLR7由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向內(nèi)體的信號輸出。這使得TLR9和TLR7在刺激抗體產(chǎn)生的過程中起相反的作用，即前者抑制了后者的促進作用［36］。TLRs作為模式識別受體之一，參與了B細胞相關(guān)的SLE的發(fā)病過程，但其具體的分子機制有待進一步研究。

3.2 TLRs的Cross-talk與急性肺損傷（acute lung injury，ALI）鑒于多種炎性介質(zhì)和效應(yīng)細胞共同參與ALI/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的病理生理機制，已有越來越多的研究闡述TLR-TLR的Cross-talk在ALI發(fā)展中的作用。創(chuàng)傷患者出現(xiàn)ALI后，肺中的多形核中性粒細胞 （polymorphonuclear neutrophil，PMN）在內(nèi)皮細胞（endothelial cell，EC）和巨噬細胞的參與下，經(jīng)過一系列細胞事件后發(fā)生遷移，因其參與炎癥的放大效應(yīng)而作為ALI的 關(guān) 鍵 事 件［37］。研 究［38］顯 示：PMN介 導 的TLR4-TLR2串擾的擴增加劇了炎癥的程度。PMN中高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）通過促進p47蛋白磷酸化和P47-GP91的組合，從而裝配完整的NADPH氧化酶。NADPH氧化酶是一種高度可調(diào)節(jié)的膜結(jié)合酶復合物，其利用NAD（P）H作為電子供體，通過單電子還原氧來催化超氧化物的產(chǎn)生。核心酶由膜結(jié)合的蛋白（即gp91和p22）和胞質(zhì)內(nèi)蛋白（即p40、p47、p67和rac-1/2）組成［39］。NADPH氧化酶產(chǎn)生活性氧作為氧化劑，參與TLR下游的NFκB信號轉(zhuǎn)導途徑的增強。研究［37］顯示：白細胞介素1受體相關(guān)激酶4（interleukin-1 receptorassociated kinase 4，IRAK4）（在TLR激活后，MyD88依賴性途徑的下游成分）是ALI患者TLR2被氧化劑活化增強的作用靶點。氧化劑本身雖無法直接激活I(lǐng)RAK4，但可以放大脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的IRAK4激活。故IRAK 4可能是負責TLR4-MyD88信號傳導的重要氧化還原調(diào)節(jié)激酶。還有研究［40］顯示：HMGB1通過激活經(jīng)典巨噬細胞（M 1）中的雙鏈RNA活化蛋白激酶（double-stranded RNAactivated protein kinase，PKR）并通過TLR2和TLR4的Cross-talk介導的NF-κB信號通路誘導M 1極化，從而參與小鼠LPS誘導的ALI過程?？梢奌MGB1充當炎癥的早期介質(zhì)，通過TLR4-TLR2的Cross-talk導致出血后ALI的發(fā)展。有研究［41］顯示：肺巨噬細胞（pulmonary macrophage，PM）中，TLR4-TLR3的Cross-talk亦會加重肺損傷，表明LPS通過TLR4-MyD88-NF-κB信號上調(diào)PM中TLR3的表達，而增加的TLR3導致MIP-2表達增強。MIP-2作為PM分泌的趨化因子，在PMN的遷移過程中起重要決定作用。除此之外，TLR3表達升高也增加了TNF和IL等炎性細胞因子的釋放，進而促進PMN遷移，最終導致ALI。由此可見，TLR-TLR的協(xié)同放大可能是有害的，因其可能導致免疫過度激活，從而阻礙免疫穩(wěn)態(tài)。因此，深入了解TLRs協(xié)同放大的機制可能有助于設(shè)計新的治療策略，為預防和治療嚴重的炎癥反應(yīng)提供依據(jù)。

3.3 TLRs的Cross-talk與膿毒癥TLR4作為最主要的TLRs之一，在膿毒癥的發(fā)病過程中起重要作用。IL家族分子與TLR4介導的敗血癥相關(guān)。有研究［42］顯示：JAK/STAT和TLRs通路的Crosstalk是調(diào)節(jié)宿主全身炎癥反應(yīng)的重要機制。經(jīng)由STAT 3的IL-6反信號通路激活以LPS為配體的TLR4及其下游通路，并反饋到MyD88/NF-κB途徑中，從而驅(qū)動TLR4/LPS產(chǎn)生更多的IL-6，加重炎癥。IL-6是重要的炎性細胞因子之一，IL-6通過與膜結(jié)合并相互作用，由酶水解產(chǎn)生天然可溶性白細胞介素6Ra（soluble interleukin-6Ra，sIL-6Ra），之后進行“反式傳遞”信號于gp130受體亞基，由gp130激活STAT 3，進一步正向調(diào)節(jié)MyD88而非TRIF通路，使小鼠對LPS的超敏反應(yīng)加劇，加速膿毒癥病理進程。還有研究［43］顯示：依賴于IL-17受體的Sef/IL-17R（SEFIR）結(jié)構(gòu)域與TLR的TIR結(jié)構(gòu)域（構(gòu)成STIR結(jié)構(gòu)域超家族）在長度和二級結(jié)構(gòu)上具有相似性，IL-17RD的SEFIR結(jié)構(gòu)域可靶向抑制TIR適配器：MyD88、Mal、TRIF和TRAM，減少促炎因子的表達。另外，TLR4與補體的Cross-talk可引發(fā)細胞因子風暴導致膿毒癥，其中補體C5和CD14的Cross-talk已被深入研究。CD14是一種結(jié)合蛋白，可促進LPS從LPS結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)移至TLR4-MD2復合物中，從而提高細胞對LPS的敏感性。研究［44］顯示：補體C5和TLR受體CD14的雙重阻斷，可能通過抑制C5a介導的TLR4下游MAPKs和JNK通路，最終提升實驗性敗血癥者的存活率。不過，TLRs與其他模式識別受體的Cross-talk可能有利于改善膿毒癥患者的癥狀。研究［45］顯示：清道夫受體（scavenger receptor，SR）通過抑制TLR4下游通路TRAF6的泛素化，減少NF-κB的激活及其隨后產(chǎn)生的一系列炎癥反應(yīng)。TLR和核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLR）信號之間的Crosstalk導致TNF-α和IL-6啟動子的NF-κB增強激活，增強炎癥性細胞因子的分泌并加速細菌清除，從而預防多發(fā)性膿毒癥［46］。有研究［47］顯示：一種免疫負調(diào)節(jié)劑，T細胞免疫球蛋白黏蛋白3（T-cell immunoglobulin and mucin domain 3，Tim-3）通過促進胞內(nèi)磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidyl inositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）的磷酸化和A 20活性來抑制LPS-TLR4介導的NF-κB活化，以抑制巨噬細胞的過度激活和引導內(nèi)毒素耐受。A 20是一種維持內(nèi)毒素耐受增加的鋅指蛋白，而PI3K-AKT是介導巨噬細胞活化的關(guān)鍵途徑。鑒于不受控制的巨噬細胞活化可能導致過度的炎癥反應(yīng)和敗血癥患者存活率降低，盡管其具體機制尚不清楚，但Tim-3的免疫抑制作用可視為敗血癥患者的一種新的適應(yīng)性補償和保護機制。研究［48］顯示：肺泡上皮細胞中TLR2與TLR4的Cross-talk既加重敗血癥，又引發(fā)ALI?？梢奣LR2與TLR4協(xié)同作用對炎癥疾病進程具有重要影響。

4 小結(jié)和展望

TLRs的Cross-talk作為先天性免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁，在病原體被模式識別受體識別加工后產(chǎn)生的病理生理學效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。TLRs的Cross-talk類型眾多，在各種炎癥性疾病中產(chǎn)生包括細胞凋亡、免疫抑制和免疫過激等多方面的效應(yīng)，這種效應(yīng)在宿主中普遍存在，只是作用強弱不等。盡管已發(fā)現(xiàn)眾多TLRs的Cross-talk組成、功能和信號通路，但同一分子基礎(chǔ)和功能的TLRs的Cross-talk產(chǎn)生的不同生物化學變化及這種變化如何調(diào)節(jié)信號傳導值得進一步研究。另有研究［47］顯示：免疫抑制劑在抑制TLRs的Cross-talk引發(fā)的過度免疫應(yīng)答過程中起重要作用，可作為今后研究的重點。

綜上所述，以TLRs的Cross-talk作為研究靶點，研究其在炎癥相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展中的分子機制，可為相關(guān)疾病的診斷、預防和治療提供理論依據(jù)。