乙酰肝素酶抑制劑OGT2115通過Wnt/β?catenin信號(hào)通路促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞的凋亡

陳佳偉 常衛(wèi)才 劉子祥 王鄭林 周少波

1蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院普外科（安徽蚌埠 233000）；2安徽省組織移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（安徽蚌埠 233000）

膽囊癌（gallbladder carcinoma，GBC）在膽道腫瘤中常見，總生存率不到5%［1-2］，其發(fā)病隱匿，早期局限性膽囊癌患者通常無癥狀［3］，放化療效果差，預(yù)后差［4］，大多數(shù)患者確診后都處于疾病晚期，往往無法治愈［3，5-7］，它約占世界范圍內(nèi)所有癌癥死亡率的1.7%［8］，到目前為止，關(guān)于膽囊癌發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展的分子改變的研究相對(duì)于其他腫瘤癌癥較少。乙酰肝素酶是一種通過硫酸乙酰肝素（HS）的酶促切割和非酶促信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞外環(huán)境來促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的蛋白質(zhì)［9］，可以重塑細(xì)胞外基質(zhì)［10］，調(diào)節(jié)細(xì)胞的一些關(guān)鍵生物過程如增殖、分化以及遷移和侵襲能力等［11-13］。有不少研究發(fā)現(xiàn)肝素酶抑制劑在治療腫瘤方面都具有一定的積極作用，如在骨髓瘤、乳腺癌、口腔舌癌、結(jié)腸癌等腫瘤中［14-17］。Wnt/β?catenin信號(hào)通路在腫瘤中起到重要作用，多項(xiàng)研究表明β?catenin在膽囊癌中表達(dá)升高［18-19］，且Wnt/β?catenin信號(hào)通路促進(jìn)了膽囊癌細(xì)胞的進(jìn)展［20-21］。關(guān)于肝素酶抑制劑對(duì)膽囊癌和Wnt/β?catenin信號(hào)通路的調(diào)控作用尚未明確，因此本研究旨在評(píng)估肝素酶抑制劑OGT2115對(duì)膽囊癌的抗腫瘤活性及對(duì)初步的相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料膽囊癌細(xì)胞GBC?SD購(gòu)自武漢普諾賽。胎牛血清購(gòu)自Clark Bioscience；Bax、Bcl?2、上皮鈣黏素（E?cadherin）、β?肌動(dòng)蛋白（β?actin）多抗和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自abclonal；Caspase?3、β聯(lián)蛋白（β?catenin）、c?MYC、細(xì)胞周期素D1（Cyclin D1）購(gòu)自Affinity生物公司；BCA蛋白濃度定量試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)；肝素酶抑制劑OGT2115、Wnt/β?catenin信號(hào)通路抑制劑IWR?1購(gòu)自MCE；Annexin?FITC/PI試劑盒購(gòu)自聯(lián)科生物；HPSE、Fas以及β?catenin ELISA試劑盒購(gòu)自泉州睿信生物；CCK?8、Hoechst 33342/PI雙染試劑盒購(gòu)自Biosharp；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑以及PCR引物購(gòu)自上海生工。本研究經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（倫理編號(hào)：倫動(dòng)科批字［2021］第309號(hào)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)GBC?SD細(xì)胞用含10%胎牛血清，1%雙抗的RMPI?1640完全培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)箱條件為37℃、100%濕度、5%CO2濃度，等細(xì)胞培養(yǎng)到貼壁80%～90%左右時(shí)，用胰蛋白酶將貼壁細(xì)胞消化脫落，1 000 r/min離心5 min；去掉上清后，用新鮮培養(yǎng)液重新吹打成均勻的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行傳代或者種板。

1.2.2 CCK?8檢測(cè)細(xì)胞增殖取在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，按每孔2 000個(gè)細(xì)胞/100 μL接種至96孔板中，觀察細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，加入新鮮含不同濃度OGT2115的培養(yǎng)液，藥物終濃度為0、1、2、4、8 μmo/L，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL新的完全培養(yǎng)液和10 μL CCK?8試劑，37℃避光孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度（OD值），利用公式根據(jù)OD值計(jì)算藥物抑制率，Graphpadprism 9對(duì)測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸，測(cè)得OGT2115作用于GBC?SD的半抑制濃度（IC50）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡非線性回歸測(cè)得的IC50為4.579 μmol/L，采用4.0 μmol/L的OGT 2115處理GBC?SD細(xì)胞，以正常不加藥物培養(yǎng)的GBC?SD細(xì)胞作為對(duì)照組。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，收集106個(gè)細(xì)胞（包含培養(yǎng)上清中的細(xì)胞），4℃預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌2次，加入bindingbuffer重懸，依次加入AnnexinⅤ?FITC 5 μL和PI 10 μL，室溫避光孵育10 min，用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)凋亡。

1.2.4 ELISA檢測(cè)HPSE活性、凋亡及信號(hào)通路相關(guān)蛋白活性將正常GBC?SD與加了OGT2115的細(xì)胞培養(yǎng)上清液收集，根據(jù)試劑盒的說明進(jìn)行加樣操作，檢測(cè)HPSE、CD95以及β?catenin活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 qRT?PCR檢測(cè)凋亡及Wnt/β?catenin信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)將GBC?SD用Wnt/β?catenin信號(hào)通路抑制劑IWR?1預(yù)處理后，用OGT2115處理，并與正常細(xì)胞組和OGT2115組對(duì)比，用Trizol提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后加樣，根據(jù)試劑提供的說明書兩步法反應(yīng)條件，用SYBR Green法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)條件：95℃變性40 s，60℃退火延伸30 s，總計(jì)40個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。

表1 qRT?PCR引物序列Tab.1 qRT?PCR primer sequence

1.2.6 Western blot檢測(cè)凋亡及Wnt/β?catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白將細(xì)胞按上述分組進(jìn)行藥物處理后，用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，并檢測(cè)及調(diào)整蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行蛋白凝膠電泳分離，將電泳好的蛋白從凝膠中轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，用1∶1 000稀釋的caspase?3、Bax、BCL?2、β?catenin、c?myc、Cyclin D1、E?cadherin以及β?actin抗體在4℃下孵育過夜。將孵好抗體的PVDF膜用TBST洗3遍后，用1∶5 000稀釋的山羊抗兔或山羊抗小鼠的IgG二抗在室溫孵育2 h，經(jīng)ECL顯色后，在化學(xué)發(fā)光成像檢測(cè)儀中曝光成像。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用Graphpadprism 9進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以（）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK?8實(shí)驗(yàn)結(jié)果0、1、2、4、8 μmo/L的OGT2115作用24 h對(duì)GBC?SD的增殖具有抑制作用，且隨濃度的增加抑制率升高。測(cè)得OGT2115作用于GBC?SD的IC50為4.58 μmol/L。見圖1。

圖1 不同濃度OGT2115對(duì)GBC?SD細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of different concentrations of OGT2115 on the proliferation of GBC?SD cells

2.2 Annexin?FITC/PI流式檢測(cè)結(jié)果與空白對(duì)照相比，OGT2115作用24 h后，GBC?SD的凋亡率升高，見圖2。

圖2 GBC?SD Annexin?FITC/PI流式細(xì)胞圖Fig.2 GBC?SD Annexin?FITC/PI flow cytometry

2.3 ELISA檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組相比，OGT2115處理后，細(xì)胞上清中HPSE、β?catenin活性下降，凋亡相關(guān)蛋白Fas升高，見圖3。

2.4 凋亡及信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)結(jié)果從qRT?PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，與對(duì)照組相比，OGT2115組和IWR?1+OGT2115組的凋亡相關(guān)基因caspase?3、Bax蛋白表達(dá)含量升高，凋亡保護(hù)蛋白Bcl?2表達(dá)含量下降，β?catenin、c?myc、Cyclin D1、E?cadherin表達(dá)含量下降，且使用IWR?1通路抑制劑預(yù)處理后，OGT2115對(duì)凋亡及信號(hào)通路相關(guān)蛋白的作用更為明顯，見圖4、5。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖4 各分組不同分子mRNA表達(dá)情況Fig.4 Expression of different molecular mRNA in each subgroup

圖5 各分組不同蛋白表達(dá)情況Fig.5 Expression of different proteins by subgroups

3 討論

乙酰肝素酶在多種類型的惡性腫瘤中表達(dá)升高，與癌癥的侵襲性和預(yù)后不良相關(guān)［17，22-23］。過表達(dá)乙酰肝素酶可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與生長(zhǎng)［24］，而抑制其活性可以降低癌細(xì)胞的浸潤(rùn)與遷移［25］，乙酰肝素酶抑制劑作為抗癌治療劑，也在不斷的進(jìn)行臨床試驗(yàn)評(píng)估。本研究結(jié)果表明，OGT2115，作為一種乙酰肝素酶抑制劑，對(duì)膽囊癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制具有濃度依賴性。

細(xì)胞凋亡是屬于一種程序性細(xì)胞死亡，在維持生物體的正常生長(zhǎng)中起著重要作用［26］。細(xì)胞凋亡包括死亡受體介導(dǎo)的外源通路、線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源通路以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路［27］。在凋亡刺激后，促凋亡蛋白Bax易位至線粒體，細(xì)胞色素c則從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，隨后細(xì)胞色素c與凋亡蛋白酶激活因子1和pro?caspase?9結(jié)合形成凋亡體的蛋白質(zhì)復(fù)合物，激活caspase?3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［28］，而Bcl?2可以通過維持線粒體膜的完整性和阻止細(xì)胞色素c的釋放來抑制細(xì)胞凋亡［29］。Fas是腫瘤壞死受體家族的成員和死亡受體的原型，可通過激活蛋白酶級(jí)聯(lián)引起配體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［30］。有研究報(bào)道，乙酰肝素酶抑制劑誘導(dǎo)淋巴瘤、膀胱癌等細(xì)胞的凋亡［22-30］，在本研究中，ELISA、qRT?PCR和Western blot分析結(jié)果顯示OGT2115下調(diào)Bcl?2的蛋白表達(dá)，提高Bax、Caspase3的蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)Fas的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了OGT2115誘導(dǎo)GBC?SD細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

Wnt/β?catenin信號(hào)通路被公認(rèn)為是腫瘤進(jìn)展關(guān)鍵通路，影響腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等各方面。β?catenin是Wnt/β?catenin通路中至關(guān)重要的下游效應(yīng)子，可以與E?cadherin形成復(fù)合物促進(jìn)細(xì)胞粘附。在腫瘤細(xì)胞中，Wnt信號(hào)通路被激活后轉(zhuǎn)移β?catenin，進(jìn)而導(dǎo)致c?myc與Cyclin D1的激活，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)展［31］。研究表明，HPSE促進(jìn)HSV?1復(fù)制后的β?catenin活化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)了病毒的活性［32］。本研究結(jié)果表明，OGT2115可以抑制GBC?SD細(xì)胞中β?catenin、Cyclin D1、c?myc、E?cad?herin的表達(dá)，且抑制該信號(hào)通路后，OGT2115對(duì)信號(hào)通路以及凋亡的作用更為明顯。

通過本研究表明肝素酶抑制劑OGT2115處理膽囊癌細(xì)胞，抑制GBC?SD細(xì)胞的生長(zhǎng)與活性，能通過Wnt/β?catenin通路促進(jìn)GBC?SD的凋亡。