基質(zhì)細(xì)胞衍生因子?1α/趨化因子CXC受體4誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞血管新生促進(jìn)腦卒中的神經(jīng)康復(fù)機(jī)制

郭丹 張娟 王洪濤 劉行高 郭遠(yuǎn)瑾

1華中科技大學(xué)協(xié)和東西湖醫(yī)院（武漢市東西湖區(qū)人民醫(yī)院）康復(fù)醫(yī)學(xué)科（武漢 430040）；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（武漢 430022）

缺血性腦卒中作為世界上主要的致死性疾病之一，其發(fā)病率、死亡率、致殘率和復(fù)發(fā)率都很高［1］。最近研究發(fā)現(xiàn)，盡管大鼠缺血模型急性期存在短暫的血管生成，但嚴(yán)重的內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜損傷可能是恢復(fù)期血管生成的主要有害影響，提示神經(jīng)血管小生境修復(fù)是缺血誘導(dǎo)的卒中的一種策略［2］。內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是從骨髓中動(dòng)員出來的不成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，其在維持內(nèi)皮完整性和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮著重要作用，有利于損傷血管的再內(nèi)皮化以及缺血組織的血運(yùn)重建［3］。研究表明，EPCs通過旁分泌或細(xì)胞效應(yīng)在大腦中促進(jìn)血管生成和神經(jīng)修復(fù)［4］。最近一項(xiàng)蛋白組學(xué)研究在長期腦低灌注小鼠模型EPCs分泌組中鑒定了38種蛋白質(zhì)參與神經(jīng)血管小生境修復(fù)，其中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子?1α（stromal cell?derived factor?1α，SDF?1α）具有強(qiáng)信號(hào)［信號(hào)強(qiáng)度=（159±56.7）］［5］。SDF?1α是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其通過與受體（CXCRs，如CXCR4或CXCR7）結(jié)合在血管生成、炎癥和病理性疼痛中發(fā)揮關(guān)鍵作用［6］。研究證明，SDF?1α參與協(xié)調(diào)神經(jīng)祖細(xì)胞的遷移、增殖和分化［7］。因此，本研究假設(shè)缺血性腦卒中后EPCs在受損區(qū)域積聚并通過SDF?1α/CXCR4或CXCR7軸介導(dǎo)神經(jīng)血管生成，并采用體外共培養(yǎng)系統(tǒng)和體內(nèi)缺血缺氧誘導(dǎo)的卒中大鼠模型驗(yàn)證上述假設(shè)。

1 材料與方法

1.1 EPCs制備從本院提供的臍血中分離人EPCs。具體操作為：取新鮮臍血與0.01 mol/L磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）混合。將混合物小心均勻地倒入淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)液（美國Corning公司）上。在1 800×g下離心30 min，仔細(xì)提取血漿和分離溶液之間的界面（白色層），并在PBS中以600×g離心10 min。將顆粒重新懸浮并傾倒在分離培養(yǎng)液上，在1 200×g下離心30 min。提取中間相并用EGM2內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液（瑞士LONZA公司）重新懸浮顆粒，將細(xì)胞置于25 cm2培養(yǎng)瓶中。

1.2 hBMECs處理人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HB?MECs）購自美國Sciencell公司，并在EGM2內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)。為探討氧糖剝奪（oxygen?glu?cose deprivation，OGD）對(duì)HBMECs的影響，將細(xì)胞分為對(duì)照組、OGD 3 h組、OGD 6 h組和OGD 9 h組。當(dāng)HBMECs在培養(yǎng)皿中60%～70%融合時(shí)，用無糖DMEM代替EGM2內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液，在含5%O2和95%N2的培養(yǎng)箱中缺氧0、3、6、9 h。

1.3 缺氧HBMECs條件培養(yǎng)液制備收集HBMECs暴露于OGD 6 h組的培養(yǎng)液，使用帶有10 kDa分子量截留膜的AmiconUltra?15離心過濾器（美國Millipore公司）將培養(yǎng)液離心（4 000×g，15 min）濃縮20倍，然后將培養(yǎng)液通過0.22 mm過濾器（Milli?pore），并在-80℃下儲(chǔ)存。

1.4 檢測(cè)EPCs對(duì)HBMECs的影響

1.4.1 細(xì)胞凋亡檢測(cè)將HBMECs分為三組：正常對(duì)照組，OGD?HBMECs組（HBMECs暴露于OGD 6 h）和EPCs+OGD?HBMECs組（HBMECs暴露于OGD 6 h，然后與EPCs共培養(yǎng)24 h）。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HBMECs凋亡。消化細(xì)胞并在1 000×g下離心5 min。用300 mL結(jié)合緩沖液重新懸浮顆粒，然后用5 μL膜聯(lián)蛋白V?PE和5 μL 7?AAD（美國BD pharmingen公司）孵育15 min。通過FACS?Can?to?II流式細(xì)胞術(shù)（美國Becton?Dickinson公司）和FlowJo軟件分析細(xì)胞凋亡。

1.4.2 血管生成實(shí)驗(yàn)將EPCs接種到Transwell室中，然后將其插入24孔板中。HBMECs暴露于OGD 6 h后，將反應(yīng)室移至OGD?HBMECs生長的平板上。將OGD?HBMECs和EPCs在37℃和5%CO2的環(huán)境中共培養(yǎng)24 h，然后將HBMECs消化并接種到Matrigel包被的24孔板Transwell小室（美國Corning公司）中。用顯微鏡（日本Olympus公司）觀察血管的形成。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）將內(nèi)皮細(xì)胞分為正常對(duì)照組（Ctrl?HBMECs）、OGD 6 h組（OGD?HBMECs）、OGD?HBMECs與EPCs共培養(yǎng)組（OGD?HBMECs+EPCs），和正常內(nèi)皮細(xì)胞與EPCs共培養(yǎng)組（Ctrl?HBMECs+EPCs）。收集培養(yǎng)液并通過ELI?SA試劑盒（美國R&D Systems公司）測(cè)量SDF?1α的濃度。

為了進(jìn)一步研究OGD?HBMECs是否影響EPCs分泌SDF?1α，用SDF?1α shRNA慢病毒（sh?SDF?1α）或?qū)φ眨╯h?NC）（美國Santa Cruz公司）感染EPCs 48 h，然后與OGD?HBMECs共培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)液，檢測(cè)SDF?1α水平。

為了進(jìn)一步研究CXCR4和CXCR7是否參與OGD?HBMECs凋亡，使用Lipofectamine 3000（美國Invitrogen公司）將OGD?HBMECs轉(zhuǎn)染CXCR4或CXCR7小干擾RNA（siRNA）（美國Santa Cruz Bio?technology公司）6 h。與EPCs再孵育24 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行凋亡分析。

1.6 Western blot細(xì)胞用RIPA裂解緩沖液裂解，并通過BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。用8%～10%十二烷基硫酸聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白裂解液，并轉(zhuǎn)移到硝化纖維素濾膜上。將膜與5%脫脂奶粉緩沖液孵育1 h，然后與小鼠抗CXCR4（1∶200，美國Santa Cruz公司）和小鼠抗CXCR7（1∶1 000，美國Abcam公司）一級(jí)抗體在4℃孵育過夜。在室溫下將膜與山羊抗兔或山羊抗鼠二級(jí)抗體（1∶5 000，美國LI?COR公司）在搖床中孵育2 h。最后，采用ECL底物試劑盒（美國Abcam公司）檢測(cè)信號(hào)，并用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.7 大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型建立及治療成年雄性Sprague?Dawley大鼠（年齡10～12周，體質(zhì)量250～300 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［合格證編號(hào)：SCXK（京）2016?0006］）用于本實(shí)驗(yàn)。參照文獻(xiàn)方法建立MCAO模型［8］，具體操作為：大鼠通過腹腔注射戊巴比妥（100 mg/kg）誘導(dǎo)麻醉。采用頸部正中切口，鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。從左側(cè)頸外動(dòng)脈向大腦中動(dòng)脈插入硅膠包裹的尼龍栓線，插入深度約為20 mm。通過使用Moor LAB激光多普勒流量計(jì)（英國Moor Instruments公司）檢測(cè)表面腦血流，證實(shí)了手術(shù)的成功。縫合線插入后2 h，再次麻醉大鼠，取出縫合線進(jìn)行再灌注。在整個(gè)造模過程中，有8只大鼠死亡，38只大鼠成功建立MCAO模型，并隨機(jī)分為：MCAO模型組（n=9）、MCAO+EPCs組（n=10）、MCAO+缺氧內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液預(yù)處理EPCs（HBMECs?pEPCs）組（n=10）、MCAO+HBMECs?pEPCs+AMD3100（CXCR4拮抗劑）組（n=9）。假手術(shù)組除不插入尼龍栓線外，其余步驟同MCAO組。在MCAO后2 h，一次性向MCAO+EPCs組經(jīng)尾靜脈注射EPCs（3.0×106細(xì)胞/300 μL PBS），MCAO+HBMECs?pEPCs組和MCAO+HB?MECs?pEPCs+AMD3100組經(jīng)尾靜脈注射HBMECs?pEPCs（3.0×106細(xì)胞/300 μL PBS）。模型組和假手術(shù)組在注射等體積的PBS。此外，MCAO+HB?MECs?pEPCs+AMD3100組每天腹腔注射AMD 3100（5 μg/kg體質(zhì)量，10 μg/mL，美國Selleck公司）1次，共2周。

1.8 Morris水迷宮試驗(yàn)治療后第六周進(jìn)行Morris水迷宮試驗(yàn)（每組n=8）。實(shí)驗(yàn)裝置由一個(gè)圓形水箱（直徑100 cm，高35 cm）組成，水箱中的水深度為15.5 cm，溫度為（23±1）℃，通過添加黑色無毒碳墨水使其不透明。在水面以下1 cm處設(shè)置一個(gè)逃逸平臺(tái)（直徑4.5 cm，高度14.5 cm）被淹沒，并放置在一個(gè)象限的中點(diǎn)。每只大鼠每天接受4次訓(xùn)練，連續(xù)4 d。在第5天，通過移除平臺(tái)并讓每只大鼠自由游泳60 s來執(zhí)行空間搜索測(cè)試。分別測(cè)量大鼠在目標(biāo)象限（隱藏平臺(tái)訓(xùn)練期間平臺(tái)所在的位置）和三個(gè)非目標(biāo)象限（右象限、左象限和對(duì)側(cè)象限）游泳的時(shí)間。對(duì)于空間搜索試驗(yàn)，還測(cè)量和計(jì)算了每只大鼠穿過平臺(tái)部位的次數(shù)。

1.9 免疫熒光染色治療后第7周，依次用PBS和4%冷多聚甲醛心內(nèi)灌注大鼠（每組4只）。取大腦組織在4%多聚甲醛中固定6 h，然后在4℃的30%蔗糖緩沖液中孵育48 h，然后進(jìn)行冷凍切片。連續(xù)的冠狀切片以5 μm的間隔從Bregma前后軸-2.0 mm到-7.0 mm切割，以收集整個(gè)受損皮層。用10%山羊血清和/或0.3%Triton X?100在0.01 mol/L PBS中在37℃下封閉腦切片40 min，然后與Claudin?5（1∶1 000，兔IgG，美國Sigma公司），CD133（1∶100，兔IgG，美國Abcam公司），CD31（1∶100，兔IgG，美國Abcam公司），和vWF（1∶200，小鼠IgG，美國Abcam公司）一級(jí)抗體孵育4 h。將切片與山羊抗小鼠IgG（H+L）Alexa?Fluor?488或555結(jié)合物（美國Invitrogen公司）二級(jí)抗體孵育1 h。最后，將切片與DAPI孵育10 min后在顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間差異采用單因素方差分析（ANOVA）和SNK方差齊性檢驗(yàn)或Dunnett后驗(yàn)平方差檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EPCs對(duì)HBMECs生物活性的影響與OGD 3 h相比，OGD 6 h或9 h的HBMECs凋亡率顯著升高（P<0.05），但OGD 6 h和9 h之間沒有顯著差異（圖1A）。因此，選擇OGD 6 h進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。與OGD組相比，EPCs處理導(dǎo)致HBMECs凋亡率顯著降低（P<0.05、圖1B）和血管環(huán)數(shù)顯著增加（P<0.05、圖1C）。

圖1 EPCs對(duì)HBMECs生物活性的影響Fig.1 The effect of EPCs on the biological activity of HBMECs

2.2 EPCs衍生的SDF?1α通過CXCR4而不是CXCR7減輕HBMECs凋亡與OGD?HBMECs組相比，OGD?HBMECs+EPCs培養(yǎng)液中的SDF?1α顯著增加（P<0.05，圖2A）。OGD?HBMECs觸發(fā)了EPCs中SDF?1α的產(chǎn)生和分泌，SDF?1α沉默EPCs致上清液中的SDF?1α急劇減少（P<0.05，圖2B）。CXCR7的表達(dá)不受EPCs處理的影響；然而，CXCR4的表達(dá)在OGD?HBMECs+EPCs處理的細(xì)胞中顯著增加（P<0.05，圖2C）。與對(duì)照siRNA相比，CXCR4敲除顯著增加HBMECs凋亡（P<0.05，圖2D）。

圖2 EPCs衍生的SDF?1α通過CXCR4而不是CXCR7減輕HBMECs凋亡Fig.2 EPCs?derived SDF?1α attenuates HBMECs apoptosis through CXCR4 but not CXCR7

2.3 MCAO對(duì)大鼠大腦皮層中EPCs和SDF?1α表達(dá)變化影響MCAO模型大鼠在建模后第4天時(shí)大腦皮層中的EPCs數(shù)量以及Claudin5陽性血管的平均光密度顯著高于假手術(shù)組（P<0.05），但在第10天時(shí)降低到正常水平（P<0.05，圖3A?B）。此外，MCAO還導(dǎo)致建模后第4天時(shí)大腦皮層中SDF?1α蛋白水平增加（P<0.05），但在第10天時(shí)降低到正常水平（P<0.05，圖3C）。

圖3 MCAO對(duì)大鼠大腦皮層中EPCs和SDF?1α表達(dá)變化影響Fig.3 The effect of MCAO on the expression of EPCs and SDF?1α in rat cerebral cortex

2.4 HBMECs?pEPCs促進(jìn)MCAO大鼠神經(jīng)血管小生境修復(fù)和改善認(rèn)知功能與MCAO+EPCs組大鼠相比，HBMECs?pEPCs組大鼠大腦皮層中形成的血管密度增強(qiáng)（P<0.05），但AMD3100治療顯著降低了HBMECs?pEPCs治療形成的血管密度（P<0.05，圖4A中CD31陽性）。采用Morris水迷宮試驗(yàn)測(cè)量認(rèn)知功能。與MCAO+EPCs組相比，MCAO+HBMECs?pEPCs組大鼠在目標(biāo)象限的游泳時(shí)間和交叉次數(shù)顯著增加（P<0.05），但AMD3100治療顯著減弱了HBMECs?pEPCs這一作用（P<0.05，圖4B、C）。

圖4 HBMECs?pEPCs促進(jìn)MCAO大鼠神經(jīng)血管小生境修復(fù)和改善認(rèn)知功能Fig.4 HBMECs?pEPCs promoted neurovascular niche repair and improve cognitive function in MCAO rats

3 討論

目前認(rèn)為，血管生成可以通過恢復(fù)血液供應(yīng)保護(hù)細(xì)胞免受各種環(huán)境壓力，包括缺氧和營養(yǎng)不良，并且在受損組織中發(fā)現(xiàn)多種促血管生成因子上調(diào)，如VEGFA和ANGPT2［9-12］。此外，還發(fā)現(xiàn)血管生成可恢復(fù)缺氧或缺血條件下HBMECs功能障礙引起的血管滲漏［13-14］。因此，缺氧應(yīng)激時(shí)促進(jìn)血管生成被認(rèn)為是治療卒中的一種有效的神經(jīng)元保護(hù)措施。本研究證明OGD?HBMECs損傷誘導(dǎo)EPCs中SDF?1α的增加，并且EPCs通過SDF?1α/CXCR4軸在體外增強(qiáng)HBMECs的功能和減少HBMECs的凋亡。體內(nèi)研究的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步支持HBMECs?pEPCs促進(jìn)MCAO大鼠神經(jīng)血管小生境修復(fù)。

先前的研究表明，EPCs的系統(tǒng)輸送可保護(hù)大腦免受缺血性損傷，促進(jìn)神經(jīng)血管修復(fù)，并改善長期神經(jīng)行為結(jié)果［5］。在EPCs介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)過程中，趨化因子SDF?1α發(fā)揮了關(guān)鍵作用［15-17］。SDF?1α通過將循環(huán)中的EPCs歸巢到活躍的血管生成部位來介導(dǎo)血管發(fā)育［18］。研究表明，SDF?1α可在血清饑餓條件下減弱內(nèi)皮祖細(xì)胞的凋亡，并可防止細(xì)胞的衰老，增強(qiáng)受損動(dòng)脈的再內(nèi)皮化［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，EPCs可抑制OGD?HBMECs的凋亡，增強(qiáng)其功能。已有研究表明，EPCs通過分泌BDNF和bFGF促進(jìn)缺血性腦卒中小鼠血管生成，增加髓鞘厚度。LI等［20］報(bào)道，將SDF?1α過度表達(dá)的EPCs移植到卒中小鼠體內(nèi)，可增加血管密度，表明神經(jīng)血管修復(fù)部分依賴于EPCs替代或分泌細(xì)胞因子。本研究檢測(cè)到由OGD?HBMECs的條件培養(yǎng)液刺激引起EPCs中SDF?1α的明顯增加，并且當(dāng)OGD?HBMECs和EPC共培養(yǎng)時(shí)，CXCR4上調(diào)，而CXCR7沒有改變。此外，來自RNAi的數(shù)據(jù)表明CXCR4在HBMECs中負(fù)責(zé)SDF?1α依賴性抗凋亡，而不是CXCR7。研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4受體在HBMECs的增殖和遷移過程中起重要作用，CXCR7可能在成熟過程中起作用。因此，EPCs通過SDF?1α/CXCR4軸介導(dǎo)神經(jīng)血管生成，維持神經(jīng)血管小生境穩(wěn)態(tài)。

在成人缺血模型中，體循環(huán)中的EPCs被激活并遷移到損傷區(qū)域，通過細(xì)胞替換整合到新血管中［21-22］。體循環(huán)EPCs減少會(huì)增加腦損傷和認(rèn)知障礙的風(fēng)險(xiǎn)。本研究在大鼠MCAO模型大腦皮層中發(fā)現(xiàn)EPCs的積聚。EPCs衍生出幾種營養(yǎng)因子，已知SDF?1α、VEGF、血管生成素或MMPs可能負(fù)責(zé)維持正常和受損大腦中的神經(jīng)血管小生境微環(huán)境穩(wěn)態(tài)［23］。其中，SDF?1α在小鼠腦長期低灌注模型中顯示出改善血管損傷的能力［5］。在缺血性患者中，SDF?1α的表達(dá)以及血液中EPCs細(xì)胞的數(shù)量密切相關(guān)［24］。亞急性給予SDF?1α可促進(jìn)缺血半暗帶血管生成，顯著改善缺血大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)［25］。本研究發(fā)現(xiàn)SDF?1α在MCAO大鼠中增加，并且證實(shí)它在病理?xiàng)l件下由累積的EPCs釋放，可能有助于神經(jīng)血管重塑。

總之，這些數(shù)據(jù)表明EPCs衍生的SDF?1α在內(nèi)皮祖細(xì)胞的發(fā)育中發(fā)揮了重要作用，提高了EPCs治療缺血性卒中的效果。HBMECs?pEPCs能有效地促進(jìn)血管生成，其作用機(jī)制至少部分由SDF?1α/CXCR4軸介導(dǎo)。此外，HBMECs?pEPCs治療MCAO大鼠的認(rèn)知功能結(jié)果比EPCs治療更明顯。然而，EPCs是否通過其他通路對(duì)卒中神經(jīng)血管重塑和認(rèn)知功能恢復(fù)的影響值得進(jìn)一步研究。