PCOS不孕癥患者子宮內(nèi)膜組織miR-21、miR-155表達(dá)及其與內(nèi)膜容受性的關(guān)系

張麗欣，張春曉

(赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，赤峰 024000)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡婦女較為常見的內(nèi)分泌疾病，主要表現(xiàn)為月經(jīng)失調(diào)、不孕、多毛、肥胖等癥狀[1]。有研究報(bào)道，PCOS影響約18%的育齡婦女，導(dǎo)致其生殖障礙、代謝紊亂及精神問題的發(fā)生[2]。PCOS不孕癥患者在經(jīng)過積極促排卵、調(diào)節(jié)激素水平等治療后排卵率升高，但臨床妊娠率仍不理想。有研究顯示，PCOS患者胚胎著床期子宮內(nèi)膜容受性降低，進(jìn)而導(dǎo)致其妊娠率下降[3]。微小核糖核酸(miRNA)是一種具有調(diào)控作用的內(nèi)源性非編碼單鏈核苷酸小分子，大約由22個(gè)核苷酸組成，參與諸多細(xì)胞的生理和病理過程[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在PCOS患者和健康對(duì)照人群之間存在差異表達(dá)，其表達(dá)差異與月經(jīng)周期、竇卵泡計(jì)數(shù)及激素水平有關(guān)，可能會(huì)導(dǎo)致患PCOS的風(fēng)險(xiǎn)增加[5]。微小RNA-21(miR-21)、miR-155都屬于miRNA家族的一員，在多種疾病中發(fā)揮重要作用。有研究報(bào)道，在胰島素抵抗PCOS(PCOS-IR)大鼠模型中通過添加肌醇下調(diào)miR-21、miR-155表達(dá)水平，能改善血糖水平和胰島素抵抗指數(shù)，降低黃體生成素(LH)和睪酮(T)水平，升高雌二醇(E2)水平[6]。但miR-21、miR-155在PCOS不孕癥患者子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平與其容受性的關(guān)系鮮有報(bào)道。因此，本研究通過探討PCOS不孕癥患者子宮內(nèi)膜組織miR-21、miR-155表達(dá)水平與其容受性的關(guān)系，以期為臨床干預(yù)提供一定的理論基礎(chǔ)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

收集2019年5月至2021年8月在本院生殖醫(yī)學(xué)科就診的PCOS不孕癥患者148例為PCOS組，另選取同期在本院體檢、明確因男性因素不孕的135例女性為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：PCOS組均符合《多囊卵巢綜合征的病因及診斷標(biāo)準(zhǔn)》[7]中對(duì)PCOS的診斷標(biāo)準(zhǔn)并確診不孕(1年內(nèi)性生活正常，未避孕且配偶體檢健康，而沒有成功妊娠)；對(duì)照組均經(jīng)體檢確認(rèn)健康并明確因男性因素不孕。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在嚴(yán)重肝腎功能損害、惡性腫瘤、嚴(yán)重精神疾病、嚴(yán)重內(nèi)分泌代謝或感染性疾病者；合并先天性子宮畸形、子宮內(nèi)膜異位癥或輸卵管病變者；3個(gè)月內(nèi)存在激素類藥物用藥史。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過，且所有研究對(duì)象均在充分知情同意后簽署知情同意書。

二、研究方法

1.主要儀器及試劑：離心機(jī)(深圳宸鑫)，-80℃超低溫冰箱(上海沛升)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(南京伊若達(dá))，電子顯微鏡(PZ-B4LS，北京品智創(chuàng)思)。生理鹽水、組織細(xì)胞裂解液、戊二醛溶液購(gòu)自北京百奧萊博；miRNA提取試劑盒、Fermentas逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒購(gòu)自北京瑞爾欣德；All-in-oneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購(gòu)自上海鈺博。

2.樣本處理和總RNA提?。核醒芯繉?duì)象均于排卵(于月經(jīng)周期第10天開始進(jìn)行連續(xù)陰道B超檢測(cè)直到排卵)后第7～9天采用一次性宮腔組織吸引管(開封博路醫(yī)療)抽取子宮內(nèi)膜組織，生理鹽水清洗干凈后-80℃冰箱保存待測(cè)。檢測(cè)時(shí)，將子宮內(nèi)膜組織置于無菌離心管中，加入組織細(xì)胞裂解液，研磨使其充分溶解，以4℃、12 000 r/min離心3 min，取上清液置于新的離心管中，采用Trizol裂解抽提法提取樣本總RNA，用分光光度計(jì)法檢測(cè)RNA的完整性，確定符合逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)準(zhǔn)。

3. 子宮內(nèi)膜組織miR-21、miR-155表達(dá)水平檢測(cè)：采用Fermentas逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)按照All-in-oneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：96℃ 10 min，93℃ 15 s、62℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)；每個(gè)反應(yīng)至少重復(fù)3次以降低誤差。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算miR-21、miR-155的相對(duì)表達(dá)水平。具體引物序列如下：miR-21上游引物為5’-GCTTATCAGACTGATGTTG-3’，下游引物為5’-GAACATGTCTGCGTATCTC-3’；miR-155上游引物為5’-TGCTAATCGTGATAGGGG-3’，下游引物為5’-GAACATGTCTGCGTATCTC-3’；U6上游引物為：5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGCAGC-3’，下游引物為5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。

4. 子宮內(nèi)膜容受性檢查：采用子宮內(nèi)膜胞飲突檢測(cè)以反映子宮內(nèi)膜容受性。PCOS組患者于排卵后第7～9天采用一次性宮腔組織吸引管抽取子宮內(nèi)膜組織，生理鹽水沖洗干凈后采用戊二醛溶液固定，制作鏡檢標(biāo)本，在電子顯微鏡下觀察子宮內(nèi)膜胞飲突發(fā)育情況，并在高倍鏡下統(tǒng)計(jì)成熟胞飲突的數(shù)量；每份標(biāo)本至少選擇3個(gè)視野取平均值。根據(jù)胞飲突占子宮內(nèi)膜面積的百分比將其數(shù)量分成3個(gè)等級(jí)：<20%為數(shù)量稀少，20%～≤50%為數(shù)量中等，>50%為數(shù)量充足；數(shù)量充足者判斷為子宮內(nèi)膜容受性良好。

又根據(jù)檢測(cè)結(jié)果將PCOS組患者分為子宮內(nèi)膜容受性良好組(容受性良好組，46例)和容受性不良組(102例)。

5. 性激素水平檢測(cè)和陰道超聲檢查：采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)血清E2和孕酮(P)水平。所有納入對(duì)象均于非經(jīng)期由本院經(jīng)驗(yàn)豐富的超聲科醫(yī)生進(jìn)行B超檢查，檢測(cè)子宮內(nèi)膜厚度(Em)、子宮內(nèi)膜螺旋動(dòng)脈舒張末期血流速度(EDV)和收縮峰值血流速度(PSV)，計(jì)算搏動(dòng)指數(shù)(PI)[PI=(PSV-EDV)/平均流速]和阻力指數(shù)(RI)[RI=(PSV-EDV)/PSV]。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩組一般資料比較

PCOS組(148例)患者年齡22～38歲，平均年齡(28.25±4.25)歲；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)19～27 kg/m2，平均BMI(23.16±3.72)kg/m2；不孕時(shí)間3～10年，平均(4.05±0.75)年；PCOS病程2～7年，平均PCOS確診時(shí)間(4.64±0.75)年；原發(fā)不孕癥68例，繼發(fā)不孕癥80例。對(duì)照組(135例)女性年齡20～39歲，平均年齡(29.56±4.63)歲；BMI 20～26 kg/m2，平均BMI(22.78±3.18)kg/m2。PCOS組和對(duì)照組年齡、BMI比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

二、兩組子宮內(nèi)膜組織miR-21、miR-155表達(dá)水平比較

qRT-PCR結(jié)果顯示，PCOS組miR-21、miR-155表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(P均<0.05)(表1)。

表1 兩組子宮內(nèi)膜組織miR-21、miR-155相對(duì)表達(dá)水平比較(-±s)

三、容受性良好組和不良組子宮內(nèi)膜組織miR-21、miR-155表達(dá)水平比較

PCOS組中子宮內(nèi)膜容受性良好組46例，容受性不良組102例。qRT-PCR結(jié)果顯示，容受性不良組miR-21、miR-155表達(dá)水平均顯著高于容受性良好組(P均<0.05)(表2)。

表2 容受性良好組和不良組內(nèi)膜組織miR-21、miR-155相對(duì)表達(dá)水平比較(-±s)

四、PCOS不孕癥患者子宮內(nèi)膜容受性的影響因素分析

子宮內(nèi)膜容受性不良組的年齡、BMI、不孕年限、PCOS病程及不孕癥類型與容受性良好組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；容受性不良組的PI、RI均顯著高于容受性良好組(P<0.05)，而Em及P、E2水平均顯著低于良好組(P<0.05)(表3)。將表2及表3中存在顯著性差異的指標(biāo)納入多因素Logistic回歸分析后結(jié)果顯示，miR-21、miR-155表達(dá)水平和PI、RI、Em、P、E2均是PCOS不孕癥患者子宮內(nèi)膜容受性的影響因素(P<0.05)(表4)。

表3 容受性良好組和不良組一般資料及相關(guān)參數(shù)比較[(-±s)，n(%)]

表4 影響PCOS不孕癥患者子宮內(nèi)膜容受性的多因素分析

討 論

PCOS是一種常見的婦科內(nèi)分泌、代謝紊亂性疾病，其準(zhǔn)確病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前大多認(rèn)為主要與遺傳因素和環(huán)境因素有關(guān)，病理變化為卵巢體積增大、卵泡增多和子宮內(nèi)膜增生[8]。子宮內(nèi)膜容受性指子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎的接受能力，是胚胎著床和發(fā)育的重要條件之一。PCOS患者子宮內(nèi)膜發(fā)育缺陷，易引起子宮內(nèi)膜容受性異常，導(dǎo)致受精卵著床障礙；且PCOS存在高雄激素血癥、胰島素抵抗等內(nèi)分泌和代謝異常，這些因素通過不同途徑影響子宮內(nèi)膜容受性，增加患者的不孕率和流產(chǎn)率[9-11]。因此，積極探索早期評(píng)估子宮內(nèi)膜容受性的方法，并及時(shí)給予對(duì)癥治療，對(duì)提高患者的妊娠率具有非常重要的意義。

miRNA廣泛存在于各種生物體內(nèi)，能夠調(diào)控細(xì)胞增殖分化、凋亡、發(fā)育及免疫功能等多種生物過程[12]。目前已有研究顯示，胚胎著床依賴于子宮內(nèi)膜容受性，miRNA已經(jīng)成為生育和與不育相關(guān)疾病中子宮內(nèi)膜容受性的關(guān)鍵基因調(diào)控因子[13]。有研究表明，miRNA在PCOS患者的血液、卵泡液及卵泡膜細(xì)胞中表達(dá)異常，其通過調(diào)節(jié)患者生殖和內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)來參與PCOS的發(fā)病過程[14]。miR-21、miR-155均是miRNA家族成員，參與多種疾病的生理病理過程，其水平升高時(shí)可加快PCOS患者的疾病發(fā)展。miR-21表達(dá)水平上調(diào)，通過靶基因調(diào)控相關(guān)纖維化因子的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮纖維化作用，導(dǎo)致患者出現(xiàn)卵巢功能損害、盆腔粘連嚴(yán)重及盆腔內(nèi)環(huán)境惡化等情況，最終影響子宮內(nèi)膜容受性，干擾精子和卵母細(xì)胞結(jié)合，造成受精失敗[15]。有研究報(bào)道，下調(diào)ssc-miR-21-5p表達(dá)水平可通過調(diào)節(jié)PDCD4/AKT通路來抑制子宮內(nèi)膜的可接受性[16]。miR-155是一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的多功能基因，機(jī)體受抗原刺激時(shí)，樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)其水平升高，能夠調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖和凋亡，并參與胎盤著床發(fā)育和內(nèi)膜蛻膜化等過程，而子宮內(nèi)膜容受性也需要免疫反應(yīng)的特異性適應(yīng)[17]。李偉偉等[18]研究報(bào)道m(xù)iR-155在反復(fù)植入失敗患者子宮內(nèi)膜中的表達(dá)上調(diào)，可能通過調(diào)控其靶基因MMP16的表達(dá)來影響子宮內(nèi)膜容受性。閆志強(qiáng)等[19]和廉紅梅等[20]研究報(bào)道血清miR-21、miR-155在PCOS患者中呈高表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，PCOS組miR-21、miR-155表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，提示miR-21、miR-155在PCOS不孕癥患者體內(nèi)高表達(dá)對(duì)PCOS不孕癥的發(fā)展具有促進(jìn)作用，證實(shí)了二者與PCOS不孕癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究進(jìn)一步經(jīng)多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)miR-21、miR-155表達(dá)水平是PCOS不孕癥患者子宮內(nèi)膜容受性的影響因素。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)PI、RI、Em、P、E2也是PCOS不孕癥患者子宮內(nèi)膜容受性的影響因素。PCOS不孕癥患者腎素-血管緊張素系統(tǒng)亢進(jìn)，激活血管平滑肌受體并刺激血管收縮，增加子宮螺旋動(dòng)脈阻力，減緩血流速度，使子宮內(nèi)膜血流量減少，營(yíng)養(yǎng)供給也隨之減少，進(jìn)而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性降低[21]。子宮內(nèi)膜變薄時(shí)，可出現(xiàn)供給營(yíng)養(yǎng)減少、粘附力下降、孕激素分泌不足以及黃體早衰等現(xiàn)象，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性下降[3]。P是由卵巢分泌的維持妊娠的孕激素，E2是由卵泡和黃體生成的雌激素，二者在妊娠維持中發(fā)揮協(xié)同作用；而PCOS不孕癥患者體內(nèi)P、E2分泌不足，可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)和功能改變，從而影響子宮內(nèi)膜容受性[22-23]。本研究結(jié)果與陶沙等[24]和黃昌萍等[25]的研究報(bào)道相似。

綜上所述，PCOS不孕癥患者子宮內(nèi)膜組織中miR-21、miR-155表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照人群；miR-21、miR-155表達(dá)、PI、RI、Em、P及E2水平均是子宮內(nèi)膜容受性的顯著影響因素。臨床工作中可根據(jù)上述影響因素進(jìn)行內(nèi)膜容受性的綜合評(píng)估，對(duì)相關(guān)危險(xiǎn)因素進(jìn)行早期有效干預(yù)，以期改善PCOS不孕癥患者的臨床妊娠結(jié)局。