PCOS患者血清miR-320a、miR-145表達(dá)水平及其與雌孕激素的關(guān)系探討

鄒玥，劉穎

(吉林省婦幼保健院中心實驗室，長春 130000)

多囊卵巢綜合征(PCOS)多出現(xiàn)無排卵性不孕，是一種生殖內(nèi)分泌紊亂性疾病，臨床多表現(xiàn)為卵巢多囊性改變、月經(jīng)失調(diào)、高雄激素血癥和持續(xù)性排卵障礙等，其病理特征主要是性激素分泌紊亂、胰島素抵抗[1]。雌、孕激素是影響子宮內(nèi)膜生長發(fā)育、維持正常月經(jīng)周期的重要性激素[2]。目前臨床大多以補充外源性雌、孕激素來改善PCOS患者月經(jīng)失調(diào)、不孕等癥狀[3]；但其作用的有效靶點尚不明確，尋找雌、孕激素作用的內(nèi)源性靶點可能為PCOS的臨床診療提供新的思路和參考。

微小RNAs(miRNAs)作為內(nèi)源性小分子單鏈RNA，由19～24個核苷酸構(gòu)成，參與人體內(nèi)分泌、代謝、生長發(fā)育以及多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，并且其數(shù)量和種類也隨疾病狀況和生理狀況而改變[4]。研究發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞發(fā)育與miR-320a表達(dá)水平顯著相關(guān)，而miR-145可以通過調(diào)控巨噬細(xì)胞的增殖和凋亡，在胚胎著床過程中發(fā)揮免疫耐受作用[5-6]，二者均可能與PCOS具有一定關(guān)系。目前，尚未有研究報道PCOS患者血清miR-320a、miR-145的表達(dá)情況，及其與PCOS患者雌孕激素水平是否相關(guān)。因此，本研究擬采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測PCOS患者血清miR-320a、miR-145的表達(dá)水平，并分析其與雌孕激素的關(guān)系，以期為臨床治療提供參考和借鑒。

資料與方法

一、研究對象

采用前瞻性研究，選取2019年5月至2021年7月于本院就診的92例PCOS患者作為PCOS組，另招募同期在本院健康體檢的90例育齡期女性作為對照組。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥20歲；(2)對照組經(jīng)B超檢查卵巢形態(tài)正常，排除PCOS；(3)PCOS組符合PCOS的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；(4)患者均簽訂知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并子宮肌瘤、卵巢囊腫等生殖器官器質(zhì)性疾??；(2)合并糖尿病等內(nèi)分泌疾病或自身免疫性疾病；(3)合并惡性腫瘤及嚴(yán)重臟器功能障礙；(4)合并精神障礙；(5)近6個月內(nèi)使用過激素類藥物。

二、研究方法

1.樣本采集：抽取空腹靜脈血6 ml(對月經(jīng)不規(guī)律者于B超檢查未見優(yōu)勢卵泡時抽取肘靜脈血，對于月經(jīng)規(guī)律者在月經(jīng)周期3～5 d抽取肘靜脈血)，靜置2 h后放入離心機，以3 500 rpm離心5 min，吸取上層血清，將其均勻分為兩份，置于離心管中，放入-80℃冰箱中保存。

2.Real-time PCR：使用Trizol試劑盒(Invitrogen，美國)提取血清中總RNA，用cDNA合成試劑盒(北京天根)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，最后采用Real-time PCR法檢測血清miR-320a和miR-145相對表達(dá)量。miR-320a采用定量PCR試劑盒(FP411，Cell Signaling Technology，美國)進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃ 15 min，94℃ 20 s，65℃ 30 s，72℃ 34 s，5個循環(huán)，94℃ 20 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)。miR-145亦采用定量PCR試劑盒(FP401，北京天根)進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：94℃ 10 min，94℃ 15 s、60℃ 30 s，45個循環(huán)，72℃ 5 min。均以U6為內(nèi)參。采用2-ΔΔCt計算miR-320a和miR-145相對表達(dá)情況。引物序列見表1。

表1 Real-time PCR反應(yīng)引物序列

3.雌孕激素檢測：采用電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測，使用全自動化學(xué)發(fā)光儀(Cobas e411，羅氏，德國)檢測血清E2、孕酮水平，檢測中所需的試劑盒均由德國羅氏公司提供。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩組患者的臨床資料比較

兩組患者的年齡和體質(zhì)量指數(shù)(BMI)比較均無顯著性差異(P>0.05)；電化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)果顯示，PCOS組患者血清E2和孕酮水平均顯著低于對照組(P<0.05)(表2)。

表2 兩組患者臨床資料比較[(-±s)，M(Q1，Q3)]

二、兩組患者血清miR-320a、miR-145表達(dá)水平比較

Real-time PCR結(jié)果顯示，PCOS組血清miR-320a和miR-145表達(dá)水平均顯著低于對照組(P<0.05)(圖1)。

與對照組比較，*P<0.05。圖1 兩組患者血清miR-320a和miR-145表達(dá)水平比較

三、PCOS患者血清miR-320a、miR-145表達(dá)水平與雌孕激素水平的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，PCOS患者血清miR-320a、miR-145表達(dá)與E2和孕酮水平均呈顯著性正相關(guān)(P<0.05)(表3，圖2、3)。

表3 PCOS患者血清miR-320a、miR-145表達(dá)水平與E2、孕酮水平的相關(guān)性分析

A：血清miR-320a與E2的相關(guān)性分析；B：血清miR-320a與孕酮的相關(guān)性分析。圖2 血清miR-320a與E2、孕酮的相關(guān)性分析

A：血清miR-145與E2相關(guān)性分析；B：血清miR-145與孕酮相關(guān)性分析。圖3 血清miR-145與E2、孕酮相關(guān)性分析

討 論

隨著人民生活方式的轉(zhuǎn)變和生活壓力的增加，女性PCOS發(fā)病率為5%～21%，并呈現(xiàn)上升趨勢[8]。PCOS患者多伴有閉經(jīng)、不孕、多毛及肥胖等癥狀，增加了并發(fā)心血管疾病和2型糖尿病的風(fēng)險，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)自然流產(chǎn)現(xiàn)象，影響患者的遠(yuǎn)期健康及生育問題[9]，故需引起臨床的高度重視。PCOS的發(fā)生與非酒精性脂肪肝病、環(huán)境因素、血脂異常、代謝綜合征及遺傳等有關(guān)，但PCOS的具體病因或發(fā)病機制尚未明確，且徹底治愈較難。目前，藥物治療是PCOS患者臨床治療的首選方式，通過外源性激素調(diào)節(jié)體內(nèi)雌、孕激素水平，雖然能在一定程度上改善臨床癥狀，但并未能從根本上解決問題，且易引發(fā)患者代謝紊亂[10]。因此，亟需尋找可以調(diào)節(jié)雌、孕激素的內(nèi)在靶點，以期為治療PCOS提供新方向。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCOS患者血清miR-320a、miR-145表達(dá)水平顯著低于對照組(P<0.05)，推測miR-320a、miR-145可能參與PCOS的病理過程。PCOS患者月經(jīng)周期不穩(wěn)定以及不孕的重要因素是卵泡生長受抑制導(dǎo)致其發(fā)育異常。miRANs是內(nèi)源性非編碼小分子RNA，作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的關(guān)鍵因子，其可以調(diào)控多種生物過程，并參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。miR-320a具有抗炎、調(diào)控細(xì)胞增殖和抗氧化的作用，其表達(dá)水平與卵母細(xì)胞發(fā)育情況聯(lián)系密切。既往研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者外周血miR-320a表達(dá)水平顯著低于正常女性[11]，本研究結(jié)果與之相符。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-320a通過直接靶向SF-1和E2F-1調(diào)節(jié)卵巢顆粒細(xì)胞增殖，維持卵泡生長發(fā)育，miR-320a與PCOS的發(fā)生密切相關(guān)[12]。另有研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者血清miR-145可以通過激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶來抑制顆粒細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡進(jìn)而參與PCOS的發(fā)生發(fā)展；與對照組比較，PCOS患者血清miR-145表達(dá)水平呈現(xiàn)顯著下降的趨勢[13]。此外，胰島素受體底物(IRSI)作為miR-145的靶基因，其蛋白表達(dá)受到miR-145的抑制，進(jìn)而miR-145抑制了PCOS患者顆粒細(xì)胞的增殖。

本研究結(jié)果顯示，PCOS患者血清孕酮和E2水平均顯著低于對照組(P<0.05)，說明PCOS患者雌激素、孕激素均低于健康育齡女性。雌孕激素作為影響子宮內(nèi)膜的重要因素之一，在其發(fā)揮調(diào)控作用后，會引起子宮內(nèi)膜出現(xiàn)周期性變化，從而形成月經(jīng)周期(規(guī)律的月經(jīng)出現(xiàn)是生殖功能成熟的標(biāo)志)[14]。E2作為由卵泡分泌的一種雌激素，可以促進(jìn)下丘腦-垂體系統(tǒng)促性腺激素釋放激素-垂體促性腺激素(GnRH-Gn)表達(dá)，發(fā)揮正反饋作用，進(jìn)而促進(jìn)排卵[15]，而PCOS患者由于下丘腦-垂體-卵巢軸功能異常，故E2水平也較低。另外，E2可以刺激輸卵管的發(fā)育及蠕動，促進(jìn)卵母細(xì)胞或受精卵著床。此外，雌激素還可以間接反應(yīng)卵母細(xì)胞的質(zhì)量，而卵母細(xì)胞的質(zhì)量則影響卵母細(xì)胞體外成熟，并影響PCOS患者生育及妊娠結(jié)局[16]。孕激素是由人體卵巢顆粒黃體細(xì)胞分泌產(chǎn)生，主要以孕酮為代表，作為一種天然孕激素，它是妊娠維持所必須的激素，具有抑制排卵，促進(jìn)子宮內(nèi)膜分泌的作用[17]。PCOS是一種常與無排卵相關(guān)的異質(zhì)性疾病，由于PCOS患者成熟卵泡發(fā)育少，無法排卵，導(dǎo)致雌激素保持在低水平的閾值范圍，并且卵巢不能分泌孕激素，因此PCOS患者雌孕激素水平較低，子宮內(nèi)膜發(fā)育遲緩，導(dǎo)致正常月經(jīng)周期和早期妊娠不能維持，影響生育。

Pearson相關(guān)性分析顯示，PCOS患者血清miR-320a、miR-145表達(dá)與E2和孕酮水平均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，提示臨床干預(yù)中可通過靶向調(diào)控miR-320a、miR-145的表達(dá)來調(diào)節(jié)PCOS患者雌孕激素水平，為臨床治療PCOS患者提供新方向。雌激素局部合成的主要場所是顆粒細(xì)胞，可以對卵泡的生長產(chǎn)生刺激，并給其它組織提供內(nèi)分泌信號[18]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，miR-320a靶向作用于轉(zhuǎn)錄因子E2F1和SF-A，促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖，促進(jìn)雌激素合成以及孕酮產(chǎn)生[19]。miR-145參與炎癥和免疫過程，以及細(xì)胞的分化、代謝、凋亡等，并在其中發(fā)揮重要作用，同時對IRS1具有靶向抑制作用，進(jìn)而起到抑制細(xì)胞增殖的效果。另外，miR-145可以通過顆粒細(xì)胞中的P13K/AKT信號通路，使細(xì)胞代謝中的胰島素水平得到調(diào)節(jié)，促使PCOS患者E2和孕酮表達(dá)水平升高。

綜上所述，PCOS患者血清miR-320a、miR-145的表達(dá)水平顯著低于正常育齡期女性，且血清miR-320a、miR-145表達(dá)水平與血清E2、孕酮水平呈正相關(guān)，提示臨床干預(yù)中可通過調(diào)控miR-320a、miR-145的表達(dá)來調(diào)節(jié)PCOS患者雌孕激素水平。但是，由于本研究納入的樣本量較少，研究結(jié)果可能存在一定的局限性，后續(xù)研究仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量加以驗證，以期為臨床干預(yù)提供一定參考和依據(jù)。