鏈霉菌揮發(fā)性化合物提高植物抗病能力的研究進展

郭紋余，郭金英，賀羽茜，彭杰麗，王占武，胡棟*

（1.河北工程大學，河北 邯鄲 056000；2.河北省農(nóng)林科學院農(nóng)業(yè)資源環(huán)境研究所，河北 石家莊 050051）

不合理使用化學農(nóng)藥會破壞生態(tài)環(huán)境，威脅人類健康。植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）為一種生防劑，具有安全、環(huán)保、高效的特點，逐漸成為農(nóng)業(yè)綠色高質(zhì)量發(fā)展關注的熱點。鏈霉菌是PGPR 的一類，廣泛分布于土壤、水體等生態(tài)系統(tǒng)中，大多具有抗菌活性和能產(chǎn)生天然次級代謝產(chǎn)物的能力。鏈霉菌不但可以通過溶磷、固氮、產(chǎn)鐵和調(diào)節(jié)植物激素等方式[1，2]促進植物生長，而且其產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物（volatile organic compounds，VOCs）也具有較高的抗菌活性，對細菌和真菌引起的各種植物病害具有防治作用。對鏈霉菌VOCs 的分類、VOCs 常用分離鑒定技術、VOCs 對常見植物病原菌的抑制作用以及作用機制研究進展等進行總結(jié)，旨為鏈霉菌VOCs 的深入研究和產(chǎn)品定向開發(fā)提供參考。

1 微生物的VOCs

VOCs 是一類小分子、易揮發(fā)的化合物，主要包括烯烴、烷烴、醇、酮、萜類、苯類、醛、吡嗪、酸、酯和含硫化合物[3]。VOCs 檢測在生物學、環(huán)境科學、醫(yī)學、食品工業(yè)等領域應用廣泛。微生物產(chǎn)生的VOCs 具有調(diào)節(jié)植物生長、刺激植物產(chǎn)生激素、誘導植物系統(tǒng)免疫抗性等功能。VOCs 通過與細胞之間的相互作用[4]，參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、抑制病原菌侵染的過程。合理利用微生物產(chǎn)生的VOCs，在未來具有很大的應用潛力。不同細菌的代謝途徑不完全一樣，因此微生物產(chǎn)生的VOCs 也表現(xiàn)出復雜的多樣性。多數(shù)微生物產(chǎn)生的VOCs 種類和數(shù)量與培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)條件有關[5]。此外，生長溫度以及O2和CO2水平也對菌株的VOCs 產(chǎn)量具有一定影響。Anna-Lena Sunesson等[6]認為，溫度升高，O2和CO2濃度越高，會提高大部分VOCs 的產(chǎn)率。人們越來越認識到VOCs 在微生物群落中扮演的不同角色，雖然微生物VOCs 的生物學功能尚不完全清楚，但其作為重要的化學物質(zhì)，影響著微生物的行為、基因表達和群體行為。

2 常用的微生物VOCs 分離鑒定技術

微生物資源十分豐富，可采取相應的技術分離出有價值的次生代謝產(chǎn)物，并且根據(jù)具體情況選出最合適的技術來鑒定分離出的化合物，從而使我們更好地了解和應用微生物，使其利用價值得到最大化。目前，常用的分離鑒定技術主要包括氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS）、頂空固相微萃?。℉S-SPME）、攪拌棒吸附萃?。⊿BSE）等。

2.1 GC-MS

GC-MS 是鑒別VOCs 最基本的技術手段，是一種結(jié)合氣相色譜強分離能力和質(zhì)譜高鑒別能力的方法，能從復雜的組分中對未知化合物進行鑒別，目前已廣泛應用于揮發(fā)性、半揮發(fā)性樣品的分析。GC-MS 的頂空收集材料一般使用的是一些活性炭等材料，但這些材料對揮發(fā)性化合物的吸附存在一定偏好，可能會造成某些化合物不能檢測到或者鑒定不出來。

2.2 HS-SPME

HS-SPME 是一種快速無溶劑分離技術，具有萃取物純度高、易操作、靈敏度高、可與GC-MS 聯(lián)用等優(yōu)勢，特別適合于低含量揮發(fā)性成分的測定，近年來該技術廣泛應用于食品，藥品等氣味分析中。但該技術也存在一些問題亟待解決，如在檢測中，萃取頭涂層容易影響萃取結(jié)果，且對脂肪酸類物質(zhì)的萃取效果較差。

2.3 SBSE

SBSE 是將一個有聚合物涂層的攪拌棒置于頂空瓶中進行攪拌和萃取的方法，可以消除非揮發(fā)性物質(zhì)的干擾[7]。攪拌棒涂層體積大，萃取效率高，對半揮發(fā)性物質(zhì)靈敏度高，是一種分析異味物質(zhì)的好方法。但SBSE 的萃取時間通常較SPME 長。

3 鏈霉菌的VOCs 種類

鏈霉菌可以產(chǎn)生烷烴、烯烴、酯類、醇類、酮類等120 多種VOCs[8]。目前，已有很多鏈霉菌的VOCs被發(fā)掘出來，如常見的VOCs 有2-甲基異冰片（Mib）[9，10]、反式-1（trans-1）[11，12]、土臭素（geosmin）[6]，它們跟潮濕土壤的霉味或土味有關[13]。2014 年Marzieh Danaei等[14]發(fā)現(xiàn)灰鏈霉菌（Streptomyces griseus）的VOCs中，含量豐富的化合物有苯酚（phenol）、2-甲基-5-甲基乙基（2-methyl-5-1methylethyl）。2020 年Daniel 等[15]對4 株鏈霉菌的VOCs 進行研究后發(fā)現(xiàn)，這4 株鏈霉菌并不是每株都會產(chǎn)生土臭素和2-甲基異冰片。2020年Xuewei Li 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，淡紫鏈霉菌SPS-33（Streptomyces lavendulae） 產(chǎn)生的主要醇類揮發(fā)物為3-甲基-1-丁醇（3-methyl-1-butanol）、2-甲基-1-丁醇（2-methyl-1-butanol）和苯乙醇（phenylethyl alcohol）3 種[17]。除淡紫鏈霉菌外，糞生鏈霉菌（Streptomyces fimicarius）BWL-H1[18]、綠針假單胞菌致金色假單胞菌亞種（Pseudomo-nas chlororaphissubsp.Aureofaciens）SPS-4[19]等微生物也均可產(chǎn)生這3 種VOCs，并且具有良好的抗菌活性。淡紫鏈霉菌SPS-33 產(chǎn)生的酯類化合物為癸酸乙酯（ethyl decanoate）、十二酸乙酯（ethyl dodecanoate） 和辛酸乙酯（ethyl octanoate），這些酯類物質(zhì)具有優(yōu)異的香氣，常作為添加劑應用于食品工業(yè)。

4 鏈霉菌VOCs 對幾種常見植物病原菌的抑制作用

病原菌為害著農(nóng)作物的生長發(fā)育，嚴重時會導致重大經(jīng)濟損失。人們普遍使用化學農(nóng)藥進行病原菌防治，但是長期使用化學農(nóng)藥會造成環(huán)境生態(tài)失衡，增加植物病害的耐藥性和發(fā)病率。因此，尋找綠色、高效、環(huán)保的防控措施迫在眉睫。微生物VOCs 的最大優(yōu)點是它們不直接接觸農(nóng)產(chǎn)品，特別適用于表面不能用水溶劑處理的水果和蔬菜?？蓪OCs 作為一種微生物熏蒸劑[20]，采用熏蒸的方式防治水果、谷物、堅果等作物采收后感染的病害。研究表明，VOCs 在一定濃度時可抑制其他微生物的生長或新陳代謝活動[21]。鏈霉菌VOCs 在防治植物病害方面發(fā)揮著重要作用，對灰霉菌、尖孢鐮刀菌、辣椒炭疽病菌、黃曲霉菌、辣椒疫霉病菌、稻立枯絲核菌等病原菌均具有顯著的抑制作用。

4.1 灰霉病

灰霉病菌（Botrytis cinerea） 可為害植物地上部位的所有器官，對果實為害最嚴重，受害果實表面會出現(xiàn)淺褐色水漬狀斑點，進而形成褐色病斑。2010 年LI 等[22]發(fā)現(xiàn)，球孢鏈霉菌（Streptomyces globisporus）JK-1 產(chǎn)生的VOCs 二甲基二硫醚（dimethyl disulfide）、二甲基三硫醚（dimethyl trisulfide） 和苯乙酮（acetophenone）能有效抑制灰霉菌[11，23]。2012 年李其利等[5]發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌產(chǎn)生的VOCs 會引起灰霉菌菌絲和孢子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，經(jīng)過VOCs 處理后，菌絲出現(xiàn)質(zhì)壁分離，孢子的細胞壁變厚，液泡明顯增多、增大。

4.2 辣椒炭疽病

辣椒炭疽?。–apsicum anthracnose）可引起辣椒落葉、爛果、幼苗死亡，嚴重時會造成辣椒減產(chǎn)和品質(zhì)降低。Sawai Boukaew 等[24]研究了甜葉鏈霉菌（Streptomyces Philanthi） RM-1-138 和沙門鏈霉菌[25]（Streptomyces salmonis）PSRDC-09 的揮發(fā)物對辣椒炭疽病的抑菌效果，結(jié)果表明，受到菌株RM-1-138 的揮發(fā)物影響后，病原真菌菌絲的扭曲形態(tài)表現(xiàn)為獨特的淚液狀，菌絲上形成孔；菌株PSRDC-09 對辣椒炭疽病菌的抗病最佳孢子濃度為107CFU/mL。在生物防治中，鏈霉菌RM-1-138 的VOCs 對作物采收后感染的辣椒炭疽病具有很強的防控潛力，且防控效果優(yōu)于化學殺菌劑。因此，利用微生物中的VOCs 進行農(nóng)產(chǎn)品采后病害防治是一種可提倡的生防措施。

4.3 尖孢鐮刀菌

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum） 是一類既可侵染植物，又可在土壤內(nèi)生存的寄生真菌。2015 年Yuncheng Wu 等[26]發(fā)現(xiàn)，白鏈霉菌（Streptomyces albulus）NJZJSA2 產(chǎn)生的VOCs 能完全抑制尖孢鐮刀菌的分生孢子萌發(fā)，其中揮發(fā)性化合物4-甲氧基苯乙烯（4-methox-ystyrene） 對菌核病菌的抑制率達到91.32%。Tamreihao 等[27]也發(fā)現(xiàn)鏈霉菌的VOCs 對尖孢鐮刀菌有一定的抑制作用。

4.4 黃曲霉菌

黃曲霉[28]（A spergillus flavus）是食品和農(nóng)產(chǎn)品儲藏中常見的64 種腐敗真菌之一，能夠產(chǎn)生對人類和其他動物具有高度致癌的黃曲霉毒素，其屬于一類致癌物。Boukaew S 等[25]研究表明，鏈霉菌（Streptomyces philanthi）RL-1-178 產(chǎn)生的VOCs 對黃曲霉菌絲生長有100%的抑制作用，其中L-芳樟醇（Llinalool）、2-巰基乙醇（2-mercapt-oethanol）、土臭味素（geosmin）和二十烷（heneicosane）可能起著重要作用。Lyu Ang 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，楊林鏈霉菌（Streptomyces yanglinensis） 產(chǎn) 生 的2 - 甲 基 丁 酸 甲 酯（methyl 2-methylbut-yrate）對黃曲霉抑制效果最佳，還能減少貯藏時黃曲霉對花生仁的污染以及黃曲霉毒素的產(chǎn)生。Mengyu Xing 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，糞生鏈霉菌（Streptomyces fimicarius）BWL-H1 產(chǎn)生的VOCs 對黃曲霉的內(nèi)膜系統(tǒng)和細胞壁造成了嚴重損傷，并能抑制黃曲霉菌絲生長、產(chǎn)孢，但對孢子囊萌發(fā)無明顯影響。目前多數(shù)研究表明，鏈霉菌產(chǎn)生的VOCs 對黃曲霉毒素具有良好的抑制作用[39]。

4.5 立枯絲核菌

立枯絲核菌（Rhizoctonia solani） 是一種常見的土傳病原菌，宿主植物種類繁多，主要為害幼芽、莖基部和塊莖，造成農(nóng)作物嚴重減產(chǎn)和品質(zhì)低下。K Tamreihao 等[30]和Viviane 等[12]發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌的VOCs能夠抑制病菌立枯絲核菌的菌絲生長。雖然有關鏈霉菌VOCs 對立枯絲核菌的研究較少，但是已有報道的溶菌桿菌[31]（Lysobacter）、芽孢桿菌[32]（Bacillus）、野油菜黃單胞菌[33]（Xanthomonas campestris）等菌株產(chǎn)生的VOCs 均對立枯絲核菌具有較好的抑制作用。

5 鏈霉菌VOCs 提高植物抗病性的作用機制

5.1 VOCs 誘導植物系統(tǒng)抗性的作用機制

誘導植物抗病性能的作用機制主要有植物系統(tǒng)獲得抗性（system acquired resistance，SAR） 和誘導植物系統(tǒng)抗性（induced system resistance，ISR） 2 種。SAR 主要發(fā)生在植物受到病原菌感染后，需要一定的時間積累致病相關蛋白（幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶）和水楊酸[34]。VOCs 主要通過ISR 誘導植物抗病[35，36]。

ISR 具有一種廣泛和保守的特性，ISR 對3 個主要群體（病毒、細菌和真菌）都有效，主要受水楊酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）和乙烯（ethy-lene，ET）等植物激素的調(diào)控。ISR 需要內(nèi)源信號分子JA 和ET 的表達，以積累相關防御酶和相關物質(zhì)（如過氧化物酶、多酚氧化酶、查爾酮合酶、植物抗毒素、酚類化合物等），形成結(jié)構(gòu)和化學屏障抵御病原體[37]。目前ISR 通路的初步研究主要集中在PR 蛋白的作用，ISR 中的信號傳輸復雜，ISR 通路被認為是PR 蛋白的核心作用，PR 蛋白濃度的增加與植物抗病狀態(tài)呈正相關[38]。同時激活JA/ET 依賴的ISR 通路和SA 依賴的SAR 通路可提高疾病保護水平。茉莉酸（JA）信號途徑[39]，這種途徑是植物抵御病原菌侵染和害蟲啃食必不可少的一部分，在植物感染病害或昆蟲攝食的反應中，亞麻酸從膜脂中釋放出來，然后酶作用轉(zhuǎn)化為JA，JA 反過來促使編碼蛋白酶抑制劑（PIs）基因的轉(zhuǎn)錄激活，以及參與VOCs 或二級化合（如尼古丁和許多酚類化合物）和其他防御相關化合物生產(chǎn)的酶[40]。

ISR 是一種具有長期性和有效性的途徑，在病原體感染前，通過VOCs 誘導植物產(chǎn)生抗性，可以降低疾病的嚴重程度。

5.2 鏈霉菌VOCs 誘導抗病機制的研究現(xiàn)狀

生防劑通過多種機制作用于植物，生防鏈霉菌通過不同的分子途徑在轉(zhuǎn)錄水平上刺激植物防御系統(tǒng)，可以用來保護植物免受病原體的侵害，也可以間接誘導ISR。鏈霉菌VOCs 對病原真菌有不同程度上的抑制作用，多數(shù)表現(xiàn)為在受到VOCs 的影響后，病原菌菌絲出現(xiàn)扭曲、蜷縮、細胞壁產(chǎn)生變異，從而抑制病原菌的生長、產(chǎn)孢能力。Rouhallah Sharifi 等[41]表示VOCs 主要通過一種間接機制激活植物ISR 中SA 和JA 信號通路，提高植物的抗病能力，免受病原體侵染，在對真菌病原體的生物防治中發(fā)揮重要作用。關于細菌VOCs 誘導植物抗性的機制研究則相對較多，但是關于鏈霉菌VOCs 誘導植物系統(tǒng)抗性的機制尚不清楚，報道的較少，因此鏈霉菌VOCs 與植物互作的機理值得進一步研究。Yi H S 等[42]研究表明，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）產(chǎn)生的VOCs 2，3-丁二醇激活了植物根系中的防御，主要通過激活JA 和ET信號通路，能保護細菌細胞免受植物根系分泌物和低pH 值的傷害。而Choi Hye Kyung 等[43]發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）釋放的VOCs 3-戊醇（3-pentanol）通過激活SA 和JA 信號通路來誘導ISR。目前已知的微生物VOCs 誘導植物抗病機制的案例較少，值得今后進一步研究。

6 問題和展望

大量使用化學農(nóng)藥會造成環(huán)境污染，在殺死害蟲的同時，也會殺死其它捕食害蟲的益鳥、益獸，進而破壞生態(tài)平衡。化學藥劑對環(huán)境造成的污染，經(jīng)食物鏈的逐步富集，最后進入人體，引起慢性中毒，對人體造成危害。因此，我們提倡使用綠色、環(huán)保、安全的微生物生防措施來幫助植物抵御病害侵染并提高作物產(chǎn)量。微生物VOCs 具有既環(huán)保又安全的特性，發(fā)展前景廣闊。目前已證實鏈霉菌產(chǎn)生的部分VOCs 對真菌性病原菌有不同程度的抑制作用，可以有效抑制植物病害，并且對采收后的果蔬作物有很好的保護作用。VOCs 能夠在不直接接觸農(nóng)作物的情況下保護農(nóng)作物免受病原菌的侵害，值得我們在原有研究基礎上創(chuàng)新VOCs 研究的新路徑、新方法、新思維。

鏈霉菌被廣泛應用于醫(yī)藥開發(fā)以及農(nóng)業(yè)發(fā)展中，但是目前對其產(chǎn)生的VOCs 研究較少，有諸多問題亟待解決。主要包括以下問題：（1）隨著微生物次生代謝產(chǎn)物研究的深入，發(fā)現(xiàn)新的生物活性次生代謝產(chǎn)物的難度將越來越大[40]；（2）影響細菌產(chǎn)生VOCs的環(huán)境因子不清楚，應考慮如何提高微生物產(chǎn)生VOCs的能力和效率；（3）有大量未知的VOCs 有待探索，鑒定VOCs 結(jié)構(gòu)的技術有待提高； （4） 如何解決VOCs 釋放的持續(xù)性問題； （5）細菌產(chǎn)生的VOCs 作用機制尚不明確，需進一步探索其作用位點和分子機制；（6）鏈霉菌VOCs 促進植物生長和誘導植物產(chǎn)生抗性等作用機制研究有待深入。

針對上述問題，為了提高微生物次生代謝產(chǎn)物的多樣性，為新農(nóng)藥、新醫(yī)藥的篩選提供高質(zhì)量的化合物，未來應加強以下幾方面的研究： （1）結(jié)合分子生物學技術開展深入研究，整合多種分離純化技術，破解含量很低、罕見、難分離的化合物信息； （2）確保農(nóng)民和相關工作人員在分離VOCs 時的安全性；（3）加強不同學科的交叉融合，如食品、化學、植保等，取長補短，共同探索VOCs 誘導植物抗病的機制。Geun Cheol Song 等[33]在2019 年研制出一種新型溫室，將菌株放置在新建立的溫室中，使其產(chǎn)生的VOCs 能夠緩慢釋放，并影響植物。這一技術有利于我們更好地控制VOCs 的釋放，但是仍然要注意是否存在其它氣體混入的情況。如何更好地利用VOCs，并將其作用到植物中，還需要不斷更新和完善技術。相信在信息技術和分子生物學技術等多種技術的結(jié)合運用下，更多鏈霉菌的VOCs 將被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)與應用，從而改善、提高農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)水平。