貓須草無菌短枝組織培養(yǎng)與快速繁殖體系的建立

李佳慧，葉維雁，朱鵬錦*，龐新華，張 繼，唐毓瑋，韋俏宇

貓須草無菌短枝組織培養(yǎng)與快速繁殖體系的建立

李佳慧1，葉維雁1，朱鵬錦1*，龐新華1，張 繼1，唐毓瑋1，韋俏宇2

1. 廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西南寧 530001；2. 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，廣西南寧 530000

貓須草又稱作“腎茶”，是一種生長在熱帶和亞熱帶地區(qū)的多年生草本植物，有一定的藥用價值和觀賞價值。在東南亞，貓須草作為一種傳統(tǒng)的茶飲而深受人們喜愛，在我國則更多是作為一種中草藥用于治療腎臟疾病。然而貓須草野生藥材資源日趨枯竭，傳統(tǒng)生產繁殖方式難以滿足市場需求，因此采用植物組織培養(yǎng)快速繁殖技術，為貓須草大規(guī)模種植提供種苗已成為急需解決的問題。為了研究適合貓須草的無菌短枝組織培養(yǎng)快速繁殖體系，本研究以帶一對腋芽的貓須草幼嫩莖段為外植體，探究不同消毒方法、激素類型與濃度及培養(yǎng)基配方對貓須草無菌短枝組織培養(yǎng)的影響。結果表明，貓須草無菌短枝組織培養(yǎng)的最佳消毒方法為75%酒精浸泡10 s或15 s+0.1%升汞浸泡6 min，當0.1%升汞消毒時間為8 min時，貓須草無菌短枝的萌芽率顯著下降，當0.1%升汞消毒時間為4 min時，貓須草無菌短枝的污染率顯著提高。最佳初代培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L或MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；但當6-BA的濃度達2.0 mg/L時，組培苗長勢細弱，葉片發(fā)黃，并有玻璃化發(fā)生。最佳繼代培養(yǎng)基配方為MS+TDZ 0.05 mg/L+IBA 0.2 mg/L；與添加6-BA相比，添加TDZ更有利于貓須草無菌短枝繼代組培苗的生長。最佳生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+NAA 1.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L+活性炭3 g/L，組培苗生根率可達95%。培養(yǎng)基配方及不同激素組合均會影響貓須草無菌短枝組培苗的生根，1/2MS培養(yǎng)基明顯優(yōu)于MS培養(yǎng)基，同時添加NAA和IBA比單獨添加NAA的效果好。將組培苗移栽至珍珠巖、細河沙、泥炭土的體積比為1∶1∶1的混合基質中，植株生長良好，成活率高。研究結果可為貓須草大規(guī)模工廠化生產提供科學可行的技術支持。

貓須草；無菌短枝；組織培養(yǎng)；快速繁殖

貓須草是唇形科腎茶屬多年生草本植物，莖直立，具四棱，花冠淺紫或白色，在東南亞地區(qū)廣泛種植，我國主要分布于廣東、海南、廣西南部、云南南部、臺灣及福建等地[1]；喜溫暖濕潤的氣候，常生于海拔700～1000 m的林下潮濕處，對光照要求不嚴，在全光照下或一定蔭蔽的環(huán)境下均可較好生長[2]。貓須草作為一種傳統(tǒng)中草藥，其地上部分入藥，能治療急慢性腎炎、膀胱炎、尿路結石，對風濕性關節(jié)炎也有一定療效[3]。在許多東南亞國家，如馬來西亞、菲律賓、印度尼西亞，人們常把貓須草當作日常茶飲。現代醫(yī)學研究表明，貓須草主要含有萜類、黃酮類和酚酸類等化學成分[4-5]，具有利尿、排石、抗菌、消炎、健腎、改善慢性腎功能衰竭和提高免疫力等醫(yī)療保健作用[6-7]。因貓須草具有重要的藥理作用，發(fā)展前景廣闊，其市場需求日益擴大。

貓須草的繁殖方式有扦插繁殖、種子繁殖以及組培繁殖等方法。但貓須草結實率低，且種子壽命只有15 d，發(fā)芽率僅為40%[8]，種子繁殖難以滿足市場需求。扦插繁殖是目前貓須草應用最廣泛的繁殖方式，操作簡單且成本較低，但扦插繁殖存在所需材料多、繁殖速度慢、繁殖系數低、對外界環(huán)境要求高等問題。組培繁殖技術具有所需繁殖材料少、繁殖系數高、能保持母株的優(yōu)良特性、不受季節(jié)限制等優(yōu)點，已廣泛應用于生物學和農業(yè)科學，在生產上發(fā)揮重要作用[9]。因此利用植物組織培養(yǎng)技術快速繁殖貓須草，對促進貓須草大規(guī)模種植、滿足市場需求具有重要意義。

近年來國內已有關于貓須草組織培養(yǎng)的研究（如莫昭展等[10]，王連翠等[11]，李綱[12]，李任珠等[13]），但通常是通過愈傷組織發(fā)生或叢生芽發(fā)生途徑再生植株這一技術路線，而采用無菌短枝快繁技術進行貓須草離體快速繁殖的研究尚未報道。無菌短枝快繁技術類似于微型扦插，指外植體攜帶的帶腋芽莖段，在人工培養(yǎng)基和合適的條件下進行離體培養(yǎng)，使其長出新的枝條，再將其剪成帶腋芽莖段，繼代再生根成苗的繁殖方法[14]。無菌短枝快繁技術成苗快，不經過愈傷組織誘導階段，遺傳性狀穩(wěn)定，培養(yǎng)過程簡單，移裁容易成活，因此可能更適合大規(guī)模工廠化生產。本研究以帶一對腋芽的貓須草幼嫩莖段為外植體，進行貓須草無菌短枝組織培養(yǎng)研究，建立較完善的貓須草無菌短枝快速繁殖體系，旨在為貓須草大規(guī)模工廠化育苗提供科學可行的技術支持，以滿足市場需求。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為2019年種植于廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所第三科研基地資源圃的野生貓須草，外植體材料為經過預處理培育的貓須草幼嫩枝條。

1.2 方法

1.2.1 材料預處理 預處理方法如下：選取健壯無病蟲害的貓須草，小心挖起，抖掉根部的土壤并用清水沖洗，在枝條離根部3～4 cm處修剪及剪去老葉保留葉柄，將修剪好的枝條用0.4%咪酰胺或者0.2%代森錳鋅藥液浸泡消毒1～2 h；浸泡后移栽到裝有50%水溶代森銨350倍液消毒基質的花盆里（花盆規(guī)格16 cm×14 cm×12 cm），并移入密閉塑料大棚中（塑料大棚提前用0.4%咪酰胺和0.2%代森錳鋅消毒地面和四周）；移栽苗定植后，每隔7 d交替使用0.4%咪酰胺和0.2%代森錳鋅或單用0.4%咪酰胺或單用0.2%代森錳鋅藥液噴灑植株、地面以及塑料大棚四周一次。當貓須草頂部新抽出幼嫩芽段長至8～10 cm時，將其從基部剪斷，作為無菌短枝快速繁殖的外植體材料，參照朱鵬錦等[15]的方法。

1.2.2 外植體處理及消毒 將通過預處理培養(yǎng)得到的貓須草外植體帶回實驗室，剪去葉片，剪成2～3 cm帶有一對腋芽的莖段，用洗潔精洗凈表面灰塵，浸泡15 min，流水沖洗20 min?？馗伤趾笱b進已滅菌的空瓶中，放入超凈工作臺備用。在超凈工作臺中，將外植體轉移至已滅菌的空瓶中，倒入75%酒精，浸泡外植體，浸泡外植體10 s或15 s，用滅菌水沖洗；后用0.1%升汞溶液浸泡，期間不斷搖動，用無菌水沖洗，用滅菌紙吸干后接種。

1.2.3 接種方法及培養(yǎng)條件 在超凈工作臺中將已消毒的無菌短枝用接種刀切掉外部邊緣部分，用鑷子接種于不同種類的培養(yǎng)基中，每瓶接種1～2個無菌短枝莖段，于培養(yǎng)室中培養(yǎng)20～30 d。培養(yǎng)基在121℃條件下滅菌20 min，高溫滅菌前pH調至5.8左右；接種后組培苗培養(yǎng)條件均為培養(yǎng)溫度為25～28℃，光照強度為2000～2500 Lx，每天連續(xù)光照12 h。

1.2.4 外植體消毒試驗 以MS+1.0 mg/L 6-BA+ 0.5 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖為貓須草無菌短枝培養(yǎng)基，按下列方法進行外植體消毒處理：（1）75%酒精10 s+0.1%升汞4 min；（2）75%酒精10 s+0.1%升汞6 min；（3）75%酒精10 s+0.1%升汞8 min；（4）75%酒精15 s+0.1%升汞4 min；（5）75%酒精15 s+0.1%升汞6 min；（6）75%酒精15 s+0.1%升汞8 min。每個處理在75%酒精處理后用無菌水沖洗2次，每次1 min，在0.1%升汞處理后用無菌水沖洗3次，每次1 min，后放滅菌紙上吸干水分，接入培養(yǎng)基中。每組處理接種30瓶，每瓶1個無菌短枝莖段。每隔5 d觀察1次，30 d后統(tǒng)計結果，期間觀察記錄每個處理的細菌污染情況。

1.2.5 初代培養(yǎng)試驗 初代培養(yǎng)基以MS+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）和NAA（0.2、0.5 mg/L），將經過消毒處理的外植體切掉外部邊緣褐變部分，接種于不同類型初代培養(yǎng)基中，每個處理接種20瓶，每瓶接種1個無菌短枝莖段，共接種20個無菌短枝莖段。每隔5 d觀察1次，25 d后統(tǒng)計無菌短枝生長情況。

1.2.6 繼代培養(yǎng)試驗 繼代培養(yǎng)基以MS+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的TDZ（0.02、0.05 mg/L）、6-BA（0.2、0.5 mg/L）、IBA（0.1、0.2 mg/L）、NAA（0.1、0.2 mg/L），將經過初代培養(yǎng)的組培苗剪成帶有一對腋芽的無菌短枝莖段，接種于不同類型的繼代培養(yǎng)基中，每個處理接種20瓶，每瓶接種1個無菌短枝莖段，共接種20個無菌短枝莖段。每隔5 d觀察1次，20 d后統(tǒng)計結果。

1.2.7 生根培養(yǎng)試驗 生根培養(yǎng)基以MS+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+活性炭3 g/L或1/2MS+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+活性炭3 g/L為基本培養(yǎng)基，附加NAA（0.5、1.0、1.5 mg/L）、IBA（0.5、1.0、1.5 mg/L）。將繼代培養(yǎng)組培苗從基部剪下，移入不同類型的生根培養(yǎng)基中，每個處理接種20瓶，每瓶接入1棵無菌短枝組培苗。每隔5 d觀察1次，30 d后統(tǒng)計結果。

1.2.8 練苗與移栽 待組培苗根長達3 cm，苗高3～5 cm時，將其移至頂部覆蓋有遮陰網的溫室大棚中，自然光下練苗7 d左右；將其從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈其底部培養(yǎng)基，置于多菌靈溶液中浸泡5～7 min，后移栽至已消毒培養(yǎng)基質中，觀察幼苗生長情況?；|預先使用50%水溶代森銨350倍液，按每平方米培養(yǎng)基質用3 kg稀釋液噴灑均勻進行消毒處理。

1.3 數據處理

利用以下公式計算相關指標，污染率=（污染數/接種數）×100%；萌芽率=（萌芽數/接種數）×100%；增殖倍數=（成苗數/接種數）×100%；生根率=（生根數/接種數）×100%。

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0軟件對試驗數據進行處理與統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同消毒方法下貓須草無菌短枝組織培養(yǎng)特性

用0.1%升汞和75%酒精不同消毒方法處理貓須草無菌短枝外植體。結果如表1所示，0.1%升汞消毒4～8 min可對貓須草無菌短枝的萌芽率或污染率產生顯著影響，而75%酒精消毒10 s或15 s對貓須草無菌短枝的污染率無顯著影響，對萌芽率產生顯著影響。當75%酒精消毒10 s或15 s，0.1%升汞消毒4 min或6 min（處理1、2、4、5）時，貓須草無菌短枝的萌芽率均是100%，無顯著差異；75%酒精消毒10 s或15 s，0.1%升汞消毒8 min（處理3、6）時，貓須草無菌短枝萌芽率分別為87.3%和83.3%，顯著低于0.1%升汞消毒4 min或6 min時的萌芽率。當75%酒精消毒10 s或15 s時，0.1%升汞消毒4 min（處理1、4）時貓須草無菌短枝污染率最高，分別為16.7%、13.3%，顯著高于0.1%升汞消毒6 min或8 min時；而75%酒精消毒10 s或15 s，0.1%升汞消毒6 min或8 min（處理2、3、5、6）時，貓須草無菌短枝的污染率無顯著差異。因此，處理5（75%酒精15 s+0.1%升汞6 min）和處理2（75%酒精10 s+0.1%升汞6 min）為最適合貓須草無菌短枝快速繁殖最的消毒方法，即用75%酒精消毒10 s或15 s，用0.1%升汞消毒6 min。當0.1%升汞消毒時間為8 min時，貓須草無菌短枝的萌芽率顯著下降，當0.1%升汞消毒時間為4 min時，貓須草無菌短枝的污染率顯著升高。

表1 不同消毒方法下貓須草無菌短枝組織培養(yǎng)特性

注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著（<0.05）。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference between treatments (<0.05).

2.2 不同激素處理下貓須草無菌短枝初代培養(yǎng)特性

為了確定適合貓須草無菌短枝初代培養(yǎng)的激素配方，將經過消毒的貓須草無菌短枝接種到不同激素配比的MS培養(yǎng)基中。無菌短枝在培養(yǎng)基中生長7 d左右時即可萌發(fā)出腋芽（圖1A），且接種在不同激素配比培養(yǎng)基上的無菌短枝均能萌發(fā)腋芽。如表2所示，培養(yǎng)25 d后貓須草無菌短枝在處理6（添加6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L）及處理1（添加6-BA 0.5 mg/L、NAA 0.2 mg/L）的初代培養(yǎng)基上培養(yǎng)效果較好，總成苗數分別為63和60，增殖倍數分別為3.15和3.00，顯著高于接種于其他激素配比培養(yǎng)基中的成苗數及增值倍數，且貓須草組培苗生長情況良好、無玻璃化、葉片綠色（圖1B，圖1C）。另外，6-BA的濃度對貓須草無菌短枝組織培養(yǎng)存在較大影響，當NAA濃度為0.2 mg/L或0.5 mg/L時，貓須草無菌短枝在添加不同濃度6-BA的初代培養(yǎng)基中成苗數及增值倍數差異顯著（表2），且當6-BA的濃度達2.0 mg/L時，貓須草無菌短枝組培苗長勢細弱，葉片發(fā)黃，并有玻璃化發(fā)生。因此，MS+6- BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L或MS+6-BA 0.5 mg/ L+NAA 0.2 mg/L為最適合貓須草無菌短枝快速繁殖的初代培養(yǎng)基。

A：初代培養(yǎng)萌發(fā)的腋芽；B、C：初代培養(yǎng)組培苗。

表2 不同激素處理下貓須草無菌短枝初代培養(yǎng)特性

注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著（<0.05）。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference between treatments (<0.05).

2.3 不同激素處理下貓須草無菌短枝繼代培養(yǎng)特性

如表3所示，培養(yǎng)20 d后，不同激素處理對貓須草無菌短枝繼代組培苗的成苗數及增值倍數影響不大，但對繼代組培苗的莖長及生長狀態(tài)存在較大影響。貓須草無菌短枝繼代培養(yǎng)在處理7（TDZ 0.05 mg/L、IBA 0.2 mg/L）培養(yǎng)基中的增值倍數顯著高于處理4（6-BA 0.5 mg/L、NAA 0.2 mg/L），且組培苗生長情況最好，莖長較長，無玻璃化，葉片綠色（圖2）。其他激素組合處理下貓須草無菌短枝繼代組培苗雖然增值倍數與處理7無顯著性差異，但其組培苗整體生長狀態(tài)比處理7的差。此外，由表3還可看出，與6-BA相比，TDZ更有利于貓須草無菌短枝繼代組培苗的生長，在添加TDZ的培養(yǎng)基中，繼代組培苗的莖長及生長狀態(tài)較好。因此，本研究中MS+TDZ 0.05 mg/L+IBA 0.2 mg/L為貓須草無菌短枝的最佳繼代培養(yǎng)基。

圖2 貓須草無菌短枝繼代培養(yǎng)組培苗

表3 不同激素處理下貓須草無菌短枝繼代培養(yǎng)特性

注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著（<0.05）。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference between treatments (<0.05).

2.4 不同培養(yǎng)基及激素處理下貓須草無菌短枝生根培養(yǎng)特性

將繼代培養(yǎng)獲得的組培苗移栽到添加有活性炭及不同激素、不同培養(yǎng)基配方的生根培養(yǎng)基中。接種5 d后，部分幼苗開始生根，且根系呈黃白色輻射狀（圖3）。如表4所示，接種30 d后，處理6（1/2MS++NAA 1.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L）的貓須草無菌短枝生根率最高，達到95%，顯著高于其他處理的生根率，且其生根數較多（6～10條），根長較長（4～6 cm）。此外，由表4還可看出，培養(yǎng)基的類型對生根率、平均生根數、平均根長存在較大影響，1/2MS培養(yǎng)基明顯優(yōu)于MS培養(yǎng)基。1/2MS培養(yǎng)基中貓須草無菌短枝的生根率顯著高于MS培養(yǎng)基。不同激素處理對貓須草無菌短枝生根也存在較大影響，同時添加NAA和IBA比單獨添加NAA的效果好。因此，最適合貓須草無菌短枝生根的培養(yǎng)基是1/2MS+NAA1.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L+活性炭3 g/L。

圖3 貓須草無菌短枝的組培苗生根培養(yǎng)

表4 不同培養(yǎng)基及激素處理下貓須草無菌短枝生根培養(yǎng)特性

注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著（<0.05）。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference between treatments (<0.05).

2.5 組培苗的練苗與移栽

待苗高3 cm左右時，將生根組培苗打開瓶蓋練苗7 d，后移栽到珍珠巖、細河沙、泥炭土的體積比為1∶1∶1的混合基質上。移栽30 d后，貓須草無菌短枝幼苗毛葉片舒展，并有新葉長出，表明移栽成活（圖4）。

3 討論

植物組織培養(yǎng)是指在無菌條件下，將離體的植物器官、組織、細胞、胚胎、原生質體培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘發(fā)產生愈傷組織或潛伏芽等，或長成完整的植株的過程[16]，可用于植物體規(guī)?；?、企業(yè)化的脫毒及離體快速繁殖。無菌短枝扦插途徑是植物組織培養(yǎng)的一種，它是在無菌條件下對帶芽的外植體材料進行培養(yǎng)，施加適量植物生長調節(jié)物質使芽萌發(fā)長出，再進一步培養(yǎng)使芽增殖，最后對增殖獲得的芽進行生根培養(yǎng)。無菌短枝扦插途徑不經過愈傷組織誘導階段，操作相對簡單，可在短時間內得到大量的無菌幼苗，因此本研究采用無菌短枝扦插的方法建立貓須草快速繁殖體系。結果表明，外植體消毒方法、激素濃度及類型、培養(yǎng)基配方是建立貓須草無菌短枝快速繁殖體系的關鍵技術環(huán)節(jié)。

圖4 貓須草無菌短枝移栽成活

植物組織培養(yǎng)過程中，造成污染的原因很多，其中外植體帶菌是培養(yǎng)過程中污染的主要原因之一[17]。建立無菌外植體，獲得無菌材料是植物組織培養(yǎng)成敗的第一步。本研究中在貓須草外植體生長階段，就對其生長的溫室大棚、移栽基質及植株本身進行了消毒預處理，降低了外植體的污染概率。在外植體消毒試驗中，本研究發(fā)現0.1%升汞消毒時間4～8 min可對貓須草無菌短枝的萌芽率或污染率產生顯著影響，當0.1%升汞消毒時間為8 min時，貓須草無菌短枝的萌芽率顯著下降，當0.1%升汞消毒時間為4 min時，貓須草無菌短枝的污染率顯著升高。而75%酒精消毒時間為10 s或15 s對貓須草無菌短枝的萌芽率產生顯著影響，對污染率無顯著影響。

植物激素的選擇和用量對植物組織培養(yǎng)的成敗具有決定性的影響，植物組織培養(yǎng)中常用的植物激素主要有細胞分裂素類和生長素類[18]，細胞分裂素類包括6-BA、TDZ等，生長素類包括NAA、IBA、2,4-D等。本研究的不同激素處理試驗表明，貓須草無菌短枝初代培養(yǎng)在添加6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L或添加6-BA 0.5 mg/L、NAA 0.2 mg/L的MS培養(yǎng)基中組培苗生長狀況較好，當培養(yǎng)基中6-BA的濃度達2.0 mg/L時，貓須草無菌短枝組培苗長勢細弱，葉片發(fā)黃，且有玻璃化發(fā)生。莫昭展等[10]也研究發(fā)現在貓須草組織培養(yǎng)中隨著6-BA濃度的增加，萌發(fā)腋芽的數量反而減少，當6-BA的濃度大于2.5 mg/L時，莖段便不再長出腋芽，而是在其頂端出現愈傷組織。另外在本研究中，貓須草無菌短枝在添加TDZ 0.05 mg/L、IBA 0.2 mg/L的MS繼代培養(yǎng)基中生長情況最好，并且與6-BA相比，添加TDZ更有利于貓須草無菌短枝繼代組培苗的生長。而莫昭展等[10]認為適宜貓須草的組培誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，繼代增殖培養(yǎng)基為MS+2，4-D 2.0 mg/L。王連翠等[11]認為適合貓須草組培初代誘導芽和繼代增殖的培養(yǎng)基均為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。在本研究中同樣選擇了6-BA和NAA作為貓須草無菌短枝初代誘導培養(yǎng)基中的添加激素，但繼代培養(yǎng)激素種類卻有所不同，可能與本研究的培養(yǎng)方式不同有關。

一般來講，無機鹽濃度高，有利于植株的莖葉生長，無機鹽濃度低，有利于根的生長[19]。本研究中的生根試驗表明，基本培養(yǎng)基類型是影響貓須草無菌短枝生根的重要因素，1/2MS培養(yǎng)基中無菌短枝的生根率、生根數及根長明顯優(yōu)于MS培養(yǎng)基，這可能是因為基本培養(yǎng)基中無機鹽濃度不同造成的。李任珠等[13]也研究表明，不同無機鹽濃度對誘導腎茶根的分化有不同的影響，1/2MS誘導出的根最長，且重復間較穩(wěn)定。此外在本研究中激素種類及濃度也會影響貓須草無菌短枝生根，同時添加NAA和IBA比單獨添加NAA的效果好，在同時添加NAA 1.0 mg/L、IBA 1.0 mg/L的1/2MS培養(yǎng)基中貓須草無菌短枝組織培養(yǎng)的生根率最高。

綜上所述，本研究篩選了適合貓須草無菌短枝組織培養(yǎng)的消毒時間、激素類型及濃度、培養(yǎng)基類型，建立了貓須草無菌短枝快速繁殖體系，為貓須草大規(guī)模工廠化生產提供理論基礎和技術支持。具體研究結果如下：最佳消毒方法為75%酒精浸泡10 s或15 s+0.1%升汞浸泡6 min，當0.1%升汞消毒時間為8 min時，貓須草無菌短枝的萌芽率顯著下降，當0.1%升汞消毒時間為4 min時，貓須草無菌短枝的污染率顯著升高；最佳初代培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L或MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；但當6-BA濃度達2.0 mg/L時，組培苗長勢細弱，葉片發(fā)黃，并有玻璃化發(fā)生；最佳繼代培養(yǎng)基配方為MS+TDZ 0.05 mg/L+IBA 0.2 mg/L；與添加6-BA相比，添加TDZ更有利于貓須草無菌短枝繼代組培苗的生長；最佳生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+NAA 1.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L+活性炭3 g/L，在1/2MS培養(yǎng)基上貓須草無菌短枝的生根效果優(yōu)于MS培養(yǎng)基，且同時添加NAA和IBA比單獨添加NAA的效果好。

[1] 許 娜, 許旭東, 楊峻山. 貓須草的研究進展[J]. 中草藥, 2010, 41(5): 848-852.

XU N, XU X D, YANG J S. Advances in studies on(Thunb.) C. Y. Wu[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2010, 41(5): 848-852. (in Chinese)

[2] 羅 燦. 87份腎荼屬植物種質資源親緣關系研究[D]. ?？? 海南大學, 2015.

LUO C. Analysis of relationships 87germplasm resources[D]. Haikou: Hainan University, 2015. (in Chinese)

[3] 姜 帥, 鄒德志, 徐建平, 白小榮, 趙冬冬, 李旻輝, 和彥苓, 肖培根. 腎茶的傳統(tǒng)應用調查與研究進展[J].中國現代中藥, 2015, 17(09):980-987.

JIANG S, ZOU D Z, XU J P, BAI X R, ZHAO D D, LI Y H, HE Y L, XIAO P G. Ethnopharmacological investigation and research progress of(Thunb.) C. Y. Wu[J]. Modern Chinese Medicine, 2015, 17(9): 980-987. (in Chinese)

[4] 李小珍, 晏永明, 程永現. 腎茶化學成分研究[J]. 天然產物研究與開發(fā), 2017, 29(2): 183-189.

LI X Z, YAN Y M, CHENG Y X. Compounds from[J]Natural Product Research and Development, 2017, 29(2): 183-189. (in Chinese)

[5] YAM M F, BASIR R, ASMAWI M Z, ISMAIL Z. Antioxidant and hepatoprotective effects ofBenth. standardized extract[J]. The American Journal of Chinese Medicine, 2007, 35(1): 115-126.

[6] NANCY D Y, AIF I K, ANNE M L, ADRIAAN P I, ZAKARIA F R, YONG H C, ROBERT V. Adenosine A1 receptor binding activity of methoxy flavonoids from[J]. Planta Medica, 2009, 75(2): 132-136.

[7] ZHONG Y S, YU C H, YING H Z, WANG Z Y, FANG H C. Prophylactic effects ofBenth. extracts on experimental induction of calcium oxalate nephrolithiasis in rats[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2012, 144(3): 761-767.

[8] 李金雨, 康龍泉. 貓須草的研究和開發(fā)利用進展[J]. 江西農業(yè)學報, 2010, 22(3): 99-104.

LI J Y, KANG L Q. Research progress in exploitation and utilization of[J]Acta Agriculturae Jiangxi, 2010, 22(3): 99-104. (in Chinese)

[9] 李青林, 鄒永田, 劉廣林, 黃曉光. 木本觀賞植物組織培養(yǎng)技術[J]. 河北農業(yè)科學, 2010, 14(6): 38-41.

LI Q L, ZOU Y T, LIU G L, HUANG X G. Tissue culture technology of woody ornamental plants[J]. Journal of Hebei Agricultural Sciences, 2010, 14(6): 38-41. (in Chinese)

[10] 莫昭展, 梁海清, 馬華材, 韋江萍. 貓須草組織培養(yǎng)研究[J]. 安徽農業(yè)科學, 2007, 35(32): 10348-10349.

MO Z Z, LIANG H Q, MA H C, WEI J P. Study on tissue culture of[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2007, 35(32): 10348- 10349. (in Chinese)

[11] 王連翠, 張玉翠. 貓須草的組織培養(yǎng)與植株再生[J]. 中國農村小康科技, 2005(12): 32.

WANG L C, ZHANG Y C. Tissue culture and plantlet regeneration of[J]. Journal of Agriculture, 2005(12): 32. (in Chinese)

[12] 李 綱. 貓須草的組織培養(yǎng)及添加物研究[J]. 吉林農業(yè), 2019(20): 60-61.

LI G. Study on tissue culture and additives of[J]Agriculture of Jilin, 2019(20): 60-61. (in Chinese)

[13] 李任珠, 丁之福, 林 培. 組織培養(yǎng)快速繁殖腎茶的研究[J]. 海南大學學報自然科學版, 1998, 16(3): 239-246.

LI R Z, DING Z F, LIN P. Study on rapid propagation ofthrough tissue culture[J]. Natural Science Journal of Hainan University, 1998, 16(3): 239-246. (in Chinese)

[14] 李 勝. 植物組織培養(yǎng)原理與技術[M]. 北京: 化學工業(yè)出版社, 2009.

LI S. Theory and techniques of plant tissue culture[M]. Beijing: Chemical Industry Press, 2009. (in Chinese)

[15] 朱鵬錦, 龐新華, 韋俏宇, 梁 春, 嚴 霖, 呂 平, 周全光, 王麗萍. 一種貓須草無菌短枝快速繁殖前的外植體預處理方法: CN109496706B[P]. 2021-06-01.

ZHU P J, PANG X H,WEI Q Y, LIANG C, YAN L, LV P, ZHOU Q G, WANG L P. The present invention relates to a method of explants pretreatment before rapid propagation of aseptic short twigs of: CN109496706B[P]. 2021-06-01. (in Chinese)

[16] 梁茂廠. 桂花組織培養(yǎng)快繁技術的研究[D]. 長沙: 中南林業(yè)科技大學, 2008.

LIANG M C. The research of tissue culture in fast breeding technology forLour[D]. Changsha: Central South University of Forestry and Technology, 2008. (in Chinese)

[17] 陳振光. 園藝植物離體培養(yǎng)學[M]. 北京: 中國農業(yè)出版社, 1996.

CHEN Z G.culture of horticultural plants[M]. Beijing: China Agriculture Press,1996. (in Chinese)

[18] 陳 毅. 藍雪花()植物組織培養(yǎng)技術研究[D]. 成都: 四川農業(yè)大學, 2013.

CHEN Y. Research of plant tissue culture technology of[D]. Chengdu: Sichuan Agriculture University, 2003. (in Chinese)

[19] 吳麗君. 木本植物組織培養(yǎng)技術在林業(yè)科研與生產中的應用與局限[J]. 福建林業(yè)科技, 2003, 30(1): 67-70.

WU L J. Application and limitation of woody plant tissue culture technology in forestry research and production[J]. Journal of Fujian Forestry Science and Technology, 2003, 30(1): 67-70. (in Chinese)

Establishment of a Sterile Short Shoot Tissue Culture and Rapid Propagation System for

LI Jiahui1, YE Weiyan1, ZHU Pengjin1*, PANG Xinhua1, ZHANG Ji1, TANG Yuwei1, WEI Qiaoyu2

1. Guangxi Subtropical Crops Research Institute, Nanning, Guangxi 530001, China; 2.The People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning, Guangxi 530000, China

also known as(Thunb.) C. Y. Wuis a perennial herb growing in tropical and subtropical regions, with certain medicinal and ornamental value. In Southeast Asia,is deeply loved by people as a traditional tea, but in China, it is more used as a Chinese herbal medicine to treat kidney diseases.However, the wild medicinal material resources ofare increasingly exhausted, and the traditional production and reproduction methods are difficult to meet the market demand. Therefore, it has become an urgent problem to adopt the rapid propagation technology of plant tissue culture to provide the seedlings needed for large-scale cultivation of. In order to study the suitable rapid propagation system of sterile short shoot tissue culture for, the tender stem segment with a pair of axillary buds was used as the explants to explore the effects of different disinfection methods, hormone types and concentrations and medium types on the sterile short shoot tissue culture ofThe results showed that the best disinfection method for the sterile short shoot tissue culture ofwas 75% alcohol immersion for 10 s or 15 s +0.1% mercury chloride immersion for 6 min. When the disinfection time of 0.1% mercuric chloride was 8 min, the germination rate of the sterile short shoot ofdecreased significantly, and when the disinfection time of 0.1% mercuric chloride was 4 min, the pollution rate ofthesterile short shoot ofincreased significantly. The best initial medium tissue culture was MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L orMS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L. However, when the concentration of 6-BA was 2.0 mg/L, the growth of the tissue cultured seedlings was weak, the leaves turned yellow and vitrification occurred. The optimal subculture medium was MS+TDZ 0.05 mg/L+IBA 0.2mg/L. Compared with the addition of 6-BA, the addition of TDZ was more beneficial to the growth of subcultured seedlings. The optimal rooting medium was 1/2MS+NAA 1.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L+ activated carbon 3 g/L, and the rooting rate of tissue culture seedlings was 95%. The type of culture medium and different hormone combinations would affect the rooting of the sterile short shoot tissue culture seedlings of. 1/2MS medium was obviously better than MS medium, and the effect of adding NAA and IBA at the same time was better than adding NAA alone. When the tissue culture seedlings were transplanted in the mixed matrix with the volume ratio of perlite, river sand and peat soil with a volume ratio of 1∶1∶1, the plants grew well and the survival rate was high. The results of this study could provide a scientific and feasible technical basis for the large-scale industrialized production of.

; sterile short shoot; tissue culture; rapid propagation

S31

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.10.012

2021-12-01；

2022-03-08

廣西重點研發(fā)計劃項目（桂科AB21220003）。

李佳慧（1991—），女，碩士，農藝師，研究方向：植物生理生化。*通信作者（Corresponding author）：朱鵬錦（ZHU Pengjin），E-mail：zhupengjin04@163.com。