miRNA 序列及其靶基因結合位點的單核苷酸多態(tài)性對畜禽生產(chǎn)性狀調控的研究進展

郭思瑋，張馨心，張聰聰，張珈溯，尹寶珍，張洛萌，夏廣軍

（延邊大學農學院，吉林延吉 133002）

畜禽的產(chǎn)仔量、精液品質、肌內脂肪沉積能力等生產(chǎn)性狀受多基因遺傳因素影響。microRNA（miRNA）是基因表達的關鍵調控因子，幾乎參與調控生物整個生命過程，包括胚胎發(fā)育、染色體結構、細胞增殖、凋亡、應激抵抗、脂肪代謝和干細胞修復。單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）是基因組水平上的突變所引起的DNA 序列多態(tài)性，而miRNA 與靶基因結合位點單核苷酸多態(tài)性已引起研究者的關注。在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，SNP 廣泛用于篩選對畜禽有利的主效基因以改善相關性狀，當miRNA 序列或其靶位點存在SNP，會影響miRNA 表達或其與靶基因的相互作用。營養(yǎng)調控和分子育種是改良畜禽品種品質的兩大手段，在分子育種方面，目前研究較多的遺傳標記技術包括限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、隨機擴增DNA 多態(tài)性（RAPD）、擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）、單核苷酸多態(tài)性（SNP）、單鏈構象多態(tài)性（SSCP）等，但利用miRNA 的調控作用來提高畜禽產(chǎn)品品質方面研究相對較少。本文總結了近年來與miRNA 相關SNP 對畜禽生產(chǎn)性狀影響的研究進展并對其未來發(fā)展進行展望，為培育具有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的畜禽品種提供理論基礎。

1 miRNA 生理特性

miRNA 是一類長度約為23 個核苷酸的非編碼RNA，廣泛分布于病毒、植物、原生生物和動物中，其功能是介導轉錄后基因沉默。1993 年，Lee 在秀麗隱桿線蟲中首次發(fā)現(xiàn)miRNA，其在動植物基因表達中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。miRNA 的生物發(fā)生是通過RNA 聚合酶II 轉錄啟動開始的，首先轉錄生成miRNA 的原始轉錄產(chǎn)物pri-miRNA，pri-miRNA 在核內經(jīng)Drosha 酶及其輔因子DGCR8 形成的復合體作用下，生成長度為60～70 bp 的發(fā)夾狀miRNA 前體，最后形成長度約22 個核苷酸的雙鏈RNA，雙鏈解旋生成成熟的miRNA。miRNA 與mRNA 結合對調控mRNA和蛋白表達水平至關重要，大量的蛋白質編碼基因是由miRNA 調節(jié)，由此可見與miRNA 相關的SNP 在調控各種生物功能方面起著重要作用。

2 miRNA 序列及其靶基因結合位點SNP

SNP 是指由于基因中單個堿基發(fā)生轉換、缺失、插入或者顛換引起基因組DNA 序列的多態(tài)性，普遍存在于各種生物基因中。近10 年來，DNA 分子標記的研究和應用飛速發(fā)展，一系列DNA 分子標記系統(tǒng)相繼形成。在眾多分子標記中，SNP 標記是當前遺傳標記研究中應用最多，也是最有前景的分子標記。miRNA 調控途徑中的多態(tài)性是動物基因組中存在的一類新型功能性多態(tài)，但由于miRNA 生物發(fā)生的復雜性和miRNA 全基因組的功能效應，miRNA SNPs 的生物學作用仍然難以確定。

與miRNA 相關的多態(tài)性可分為兩類：miRNA轉錄過程中的SNP（初始miRNA 和miRNA 前體的SNP）和miRNA 靶基因結合位點的多態(tài)性。一般來說，在miRNA 轉錄過程中，包括初始miRNA（pri-miRNA）、miRNA 前體（pre-miRNA）和成熟的miRNA 在內都有可能發(fā)生序列變化，這種多態(tài)性可能影響數(shù)百個基因和通路的表達，并且廣泛影響miRNA 功能以及miRNA的加工或靶位點的選擇。根據(jù)miRNA 序列中的SNPs，有3 種干擾miRNA 功能的渠道：pri-miRNA 或pre-miRNA 的突變可能會影響miRNA 穩(wěn)定性或轉錄效率；在pri-miRNA 啟動子區(qū)域的突變可能會影響轉錄速率；成熟miRNA 序列改變會破壞其與mRNA 靶位點的互相作用。與miRNA 轉錄過程中的多態(tài)性相比，靶基因3'UTR 區(qū)的序列變化在人類基因組中更為豐富。3'UTR 區(qū)是一個關鍵的控制區(qū)域，具有調節(jié)mRNA 穩(wěn)定性、翻譯和定位的能力。而miRNA 靶位點內的SNP僅影響靶mRNA 及其下游效應物，因此更具特異性。

miRNA 通常通過靶向mRNA3'UTR 區(qū)的部分互補序列來抑制基因表達，然而這種結合可能受到miRNA靶位點的SNP 影響，SNP 會破壞或產(chǎn)生新的結合位點。Luo 等證明位于基因3'UTR 區(qū)microRNA-7結合位點內的單核苷酸多態(tài)性（1010A/G），主要通過microRNA-7 的差異結合活性和與單核苷酸多態(tài)性相關的mRNA 穩(wěn)定性影響基因在膀胱癌中的表達。hsa-miR-422a 靶基因在其靶位點3'UTR 的SNP rs12607853 與海洛因成癮顯著相關，hsa-miR-1270以等位基因特異性方式與SNP 位點的等位基因結合來抑制熒光素酶活性、與該基因3'UTR 中的SNP 結合來抑制基因的產(chǎn)生，還可通過靶向包含rs241456的T 等位基因的認知序列來調節(jié)基因的表達。探索與miRNA 相關的SNP 及其與表型性狀間的關聯(lián)有助于深入了解miRNA 的調控機制與功能。

3 miRNA 靶基因結合位點SNP 對畜禽生產(chǎn)性狀的影響

3.1 miRNA 靶基因結合位點SNP 對肉質性狀的調控 氧化低密度脂蛋白1（OLR1）是一類可以結合氧化低密度脂蛋白的受體，1997 年，Sawamura在牛主動脈內皮細胞中首次發(fā)現(xiàn)基因，屬于C 型血凝素家族。有研究表明，基因參與脂質代謝與牛肉品質調控。張傳生等研究發(fā)現(xiàn)bta-miR-370 靶標基因3'UTR 區(qū)存在1 個SNP 位點（A8232C），在奶?；?'UTR 發(fā)現(xiàn)bta-miR-370 因堿基不能互補配對而導致靶標缺失。李托研究發(fā)現(xiàn)秦川?；駻>C 的突變導致bta-miR-370 的靶標缺失，抑制了其與基因mRNA 3'UTR 區(qū)結合且引起眼肌面積等肉質性狀的變異。

3.2 miRNA 靶基因結合位點SNP 對產(chǎn)仔量的調控 干細胞因子（KITLG）是基因的配體，在原始生殖細胞的生長發(fā)育過程中起關鍵作用?；蛲ㄟ^觸發(fā)其受體酪氨酸激酶，在生物的發(fā)育過程中具有多種生物學功能。An 等通過DNA 測序在山羊基因3'UTR 中發(fā)現(xiàn)3 個SNP 位點（c.1389C>T、c.1457A>C 和c.1520G>A），其中c.1457A >C 與山羊產(chǎn)仔數(shù)顯著相關。熒光素酶檢測結果證實chi-miR-204-5p 和chi-miR-211 與基因存在靶向關系，當?shù)任换駽 存在時，chi-miR-204-5p 和chi-miR-211與基因結合被抑制，進而影響表達水平，這一發(fā)現(xiàn)有助于了解基因在山羊中的表達調節(jié)機制。

CDC42 是Rho GTPases 家族的一員，在控制細胞功能方面起著關鍵的調節(jié)作用。Liu 等發(fā)現(xiàn)豬基因3'UTR 區(qū)存在一個SNP 位點rs55618224（T>C），PCR-MnII-RFLP 檢測顯示在母豬胎盤中，CC 基因型基因mRNA 表達水平顯著高于TT基因型。熒光素酶結果證實該位點是基因與miR-18a 結合位點，rs55618224 不僅影響miR-18a 與基因結合且與豬窩產(chǎn)仔數(shù)相關，這一研究結果為探索豬胎盤發(fā)育與改良母豬繁殖性狀提供了新的思路。

An 等在山羊基因中發(fā)現(xiàn)g.151435C>T、g.151454A>G、g.173057T>C 3 個SNP 位點，g.151435C>T和g.173057T>C 與山羊產(chǎn)仔數(shù)顯著相關。此外，g.173057T>C 多態(tài)位點可調控bta-miR-302a 與基因的結合活性，熒光素酶結果也證實該位點突變破壞了bta-miR-302a 與基因的結合。g.151435C>T與g.173057T>C 位點均可作為遺傳標記，對山羊的遺傳育種具有潛在應用價值。

3.3 miRNA 靶基因結合位點SNP 對產(chǎn)奶性狀的調控 5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）是一種來自氧化還原酶類的酶，參與調節(jié)同型半胱氨酸濃度，MTHFR 是同型半胱氨酸再甲基化為蛋氨酸的必要原料。Hou以山羊為研究對象，在基因3'UTR區(qū)檢測到2 個SNP 位點（g.2244A>G；g.2264A>G），這兩處多態(tài)性與山羊的產(chǎn)奶性狀相關。生物信息學分析與熒光素酶結果表明，hsa-miR-1266、hsa-miR-1289、hsa-miR-505 和hsa-miR-616 可以與基因3'UTR區(qū)結合，且2244A →G 突變可增加hsa-miR-1266 與基因3'UTR 的結合活性；2264A →G 突變可降低hsa-miR-616 與基因3'UTR 的結合活性。

Mahmoudi 等通過測序發(fā)現(xiàn)基因3'UTR 存在T14280C 突變。對3'UTR 區(qū)進行PCR 擴增和SSCP 檢測后發(fā)現(xiàn)，該位點顯著提高奶牛產(chǎn)后第5 天-羥基丁酸水平、體況評分以及牛奶中蛋白質含量。生物信息學分析顯示，基因3'UTR 區(qū)存在mir-423-5p 靶位點，T14280C 突變使mir-423-5p 的靶標失活，而mi-423-5p 是在牛乳腺、肝臟和腎臟中表達最高的microRNA 之一，這一發(fā)現(xiàn)為mi-423-5p 在調節(jié)荷斯坦奶牛細胞代謝、代謝紊亂和牛奶品質方面有重要作用提供了科學依據(jù)。

脂肪酸去飽和酶2（FADS2）是參與長鏈多不飽和脂肪酸合成的限速酶。Li 等發(fā)現(xiàn)SNP 位點 c.1571G>A 通過破壞miR-744 與基因的結合能力，提高ω-6 長鏈多不飽和脂肪酸的合成，該位點是改善牛奶品質的潛在遺傳標記。

3.4 miRNA 靶基因結合位點SNP 對精液品質的調控編碼轉化蛋白2（TNP2）與精子活力與精液品質相關，參與精子發(fā)生過程中核糖體的清除與精子細胞核的初始凝結。Gao 等在中國荷斯坦?；虬l(fā)現(xiàn)3個SNP 位 點（g.269 G.A,g.480 C.T,g.1536 C.T），關聯(lián)分析表明3 個SNP 位點與中國荷斯坦牛精液品質性狀顯著相關。生物信息學分析預測，基因3'UTR中的g.1536 C.T 位點位于bta-miR-154 結合區(qū)域。熒光素酶檢測進一步證實，bta-miR-154 靶向調節(jié)基因，而基因3'UTR 中的SNP（g.1536 C.T）破壞了基因與bta-miR-154 的結合，可作為哺乳動物精液質量與生育能力的輔助標記選擇。

過渡核蛋白（TNPs）是濃縮精子細胞染色質中的主要蛋白質，Zhang 等發(fā)現(xiàn)基因3'UTR 區(qū)發(fā)現(xiàn)中2 個SNP 位點（g.442 A.G、g.528 G.A）與中國荷斯坦牛精液品質顯著相關，生物信息學分析顯示兩個位點分別位于bta-miR-204 和bta-miR-532 與TNP1 結合區(qū)，熒光素酶結果進一步證實其靶向關系，這一發(fā)現(xiàn)對中國荷斯坦牛精液品質性狀的選擇有重要意義。

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（PCK1）是一種多功能酶，在生殖生理過程中發(fā)揮重要作用。Huang 等研究發(fā)現(xiàn)基因的miRNA 結合位點上的SNP（c.+2183 G>T）與荷斯坦牛射精量、新鮮精子活力、壽命的基因組估計育種值、綜合指數(shù)和產(chǎn)犢難易度的下降有關。熒光素酶檢測結果顯示，bta-miR-26a 抑制?；虻谋磉_，證實了bta-miR-26a 與的靶向關系，而多態(tài)位點可能通過破壞二者的結合對荷斯坦牛的精液質量產(chǎn)生影響。

3.5 miRNA 靶基因結合位點SNP 對其他生產(chǎn)性狀的調控 胰島素樣生長因子結合蛋白2（IGFBP2）屬于IGFBPs 家族。基因在肝臟、脂肪細胞、生殖系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達，對動物脂肪細胞的發(fā)育和脂質代謝有顯著影響。Leng 等發(fā)現(xiàn)雞體內基因3'UTR 區(qū)存在1 個SNP 位點（1196C>A）。于瑩瑩等通過實驗證實雞體內基因是gga-miR-456-3p 的靶基因，其3'UTR區(qū)的SNP（1196C>A）影響gga-miR-456-3p 對基因表達的調控。

熱休克轉錄因子1（）基因在熱應激反應中起關鍵作用。Li 等在中國荷斯坦奶?；?'UTR 區(qū)發(fā)現(xiàn)了1 個SNP 位點（g.4693G>T），該突變位點與中國荷斯坦奶牛的耐熱性相關。熒光素酶分析表明，bta-miR-484 靶向調節(jié)基因，但由于多態(tài)性的存在與bta-miR-484 的結合活性受到抑制且對荷斯坦奶牛的耐熱性產(chǎn)生影響。

綜上所述，畜禽體內microRNA 靶基因結合位點的SNP 通過使其靶標缺失，靶基因不再受miRNA 調控，進而對各種生產(chǎn)性狀產(chǎn)生影響。

4 miRNA 轉錄過程中的多態(tài)性對畜禽生產(chǎn)性狀的影響

Wu 等通過Sanger 測序在3 個雞品種的PCR 產(chǎn)物上發(fā)現(xiàn)初級miR-26a-5p 中的10 個SNP 位點，其中rs316365438（C>T）位點與首次卵齡和32 周產(chǎn)蛋總數(shù)相關。Wang 等發(fā)現(xiàn)位于miR-1666 前體區(qū)域內的突變位點rs14120863（C>G）與雞8 周齡的胴體重、內臟重、胸肌重、腿部肌肉重顯著相關，對成熟miR-1666 的生成也有顯著影響。Li 等鑒定了位于雞miRNA-1606前體的1 個SNP 位點，該位點與雞第10 周、第12 周體重以及第8 周雞腿長度、胸深以及體斜長顯著相關，且改變了pre-mir-1606 的第二結構，成熟miRNA 在CA 基因型和AA 基因型之間的相對表達量在腿肌中也發(fā)生顯著變化。

Cardoso 等在Nelore 牛不同miRNA 序列中（btamiR-2419-3p、bta-miR-193a-2 和bta-miR-1291）鑒定了3 個與脂肪酸組成顯著相關的SNP 位點，其中位于bta-miR-1291 序列的多態(tài)位點與不同ω6 脂肪酸、多不飽和脂肪酸以及多不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比值相關，另外2 個miR-SNPs 分別與月桂酸、順式11-油酸以及6 亞麻酸、脂肪酸6/3 相關。

綜上所述，miRNA 轉錄過程中的SNP 也會對畜禽的生產(chǎn)性狀產(chǎn)生影響，可能成為動物育種中潛在的遺傳標記用于分子輔助選擇。

4 總結與展望

利用分子遺傳標記技術改良畜禽生產(chǎn)性狀已成為畜禽種質提升的重要手段，但目前對于miRNA 及其靶基因結合位點多態(tài)性的研究大多集中在醫(yī)學方面，關于miRNA 序列及其靶基因結合位點對畜禽生產(chǎn)性狀影響的研究也尚處起步階段?，F(xiàn)有對miRNA 及其靶位點的多態(tài)性與畜禽生產(chǎn)性狀的研究局限在多態(tài)位點與生產(chǎn)性狀的關聯(lián)性分析及其與miRNA 相互作用，在今后的研究中應深入探索miRNA 及其靶位點多態(tài)性的調控網(wǎng)絡和其復雜的轉錄后調控機制，找到與改進生產(chǎn)性狀相關的分子機理，為培育具有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的畜禽品種提供科學依據(jù)。