卡格列凈通過Sirt1/Claudin-1/β-catenin/Snail 信號通路對糖尿病腎病模型小鼠腎臟的保護作用

劉愷遠 牟 新 周迪夷 陳麗君

糖尿病腎臟疾病（diabetes kidney disease，DKD）是最嚴重的糖尿病微血管并發(fā)癥之一，最終進展為終末期腎病[1]?？ǜ窳袃羰禽^早應用于臨床的鈉－葡萄糖同向轉運蛋白2（sodium-glucose cotransporter 2，SGLT-2）抑制劑之一。研究發(fā)現，卡格列凈具有不依賴于降血糖的腎臟保護作用，明顯減少DKD 患者的尿蛋白及肌酐水平，能夠延緩DKD 的進展[2]。本研究旨在探究卡格列凈對DKD 模型小鼠腎臟的保護作用及其分子機制。

1 實驗材料

1.1 動 物 SPF 級T2DM 模型6 周齡db/db 雄性小鼠12 只，C57BL/KsJ-+/db 雄性小鼠6 只，購買自杭州杭斯生物有限公司，生產許可證號：SYXK（浙）2018-0012。飼養(yǎng)繁殖環(huán)境：飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心，單籠鼠料喂養(yǎng)。飼養(yǎng)室溫度控制在（23±2）℃并保持60%濕度。本研究獲浙江動物倫理委員會審核（批件編號：20200803-03）。

1.2 試驗藥品 高脂飼料（江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司，批號1019004）；卡格列凈（Merck公司，100 mg，批號KCL5000）。

1.3 試劑與儀器 RIPA 裂解液（上海碧云天生物有限公司，批號P0013B）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物有限公司，批號082820201207）；PMSF（上海碧云天生物有限公司，批號ST506）；PVDF 膜（Millipore 公司，批號ISEQ00010）；SDSPAGE 凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物有限公司，批號111420201123）；脫脂奶粉（上海源葉生物科技有限公司，批號S30865）；Tween20（上海源葉生物科技有限公司，批號S15016）；超敏ECL 化學發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物有限公司，批號0820201116）；小鼠胰島素ELISA 試劑盒（鈺博生物有限公司，批號ED202012224）；小鼠C 肽ELISA 試劑盒（鈺博生物有限公司，批號ED202012224）；一抗：SIRT1（美國abcam 公司，批號ab 189474；）Claudin1（美國abcam公司，批號ab180158）；β-catenin（美國abcam 公司，批號ab32572）；Snail（美國cst 公司，批號3879S；）βactin（杭州寶科生物科技有限公司，批號BK7018）；二抗：Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody（美國cst 公司，批號7074S）；血糖儀（羅氏ACCU-CHEK performa，型號79530618328）；恒溫水浴箱（賽默飛，型號TSCIR35）；低溫高速離心機（Sigma 貝克曼（Beckman），型號B30142）；電泳儀（Bio-RAD，型號E1100）；顯影儀（勤翔，型號610020-9Q）；全自動生化分析儀（雅培公司；型號C16000）。

2 實驗方法

2.1 造模及分組 適應性喂養(yǎng)1 周后，6 只C57BL/KsJ-+/db 雄性小鼠給予普通飼料，作為正常對照組（NC 組）；12 只SPF 級T2DM 模型db/db 雄性小鼠給予高脂飼料2 周造模并復制DKD 模型[3]，造模成功后，DKD 模型小鼠按照隨機數字表法分為DKD 組和卡格列凈（Canagliflozin）干預組（DKD+Can 組），每組6 只。

2.2 給 藥 NC 組、DKD 組分別予生理鹽水10 mL/kg，灌胃，1 次/d；卡格列凈給藥劑量依據文獻檢索得出，干預組予卡格列凈10 mg/（kg·d），灌胃，1次/d，灌胃12 周[4]。

2.3 觀察指標

2.3.1 生化代謝檢測 每周測定小鼠體質量尾靜脈測小鼠空腹血糖和隨機血糖；全自動化分析儀測血清胰島素、C 肽、血肌酐、尿素氮。代謝籠收集各組小鼠24 h 尿液標本取上清液檢測尿蛋白。

2.3.2 腎組織病理 實驗結束時，取出腎臟組織，稱重后，部分于Bouin 液中固定，行PAS 染色，光鏡下觀察各組觀察腎單位形態(tài)結構。

2.3.3 Western blot 技術檢測腎臟組織沉默信息調節(jié)因子1（Sirt1）、緊密連接蛋白-1（Claudin-1）、β 連接素（β-catenin）、鋅指轉錄因子（Snail）水平 裂解液提取細胞蛋白，搖勻后取上清液，BCA 法測蛋白濃度，上樣電泳，轉移PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉搖床室溫封閉2 h，依次加入相應特異性一抗、二抗。放入ECL 發(fā)光試劑應用圖像分析系統(tǒng)顯影并分析灰度值并分析，結果用目的蛋白與β-actin 相對表達量來表示。

2.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數±標準差（）表示，組間多重比較采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組小鼠一般指標比較 干預治療12 周后，三組小鼠在進食量、血清C 肽、胰島素水平均無明顯差異（P＞0.05）。與NC 組小鼠比較，DKD 組及DKD+Can組小鼠12 周空腹血糖及HbA1c 明顯升高（P＜0.05），與NC 組比較，DKD 組及DKD+Can 組體質量明顯增加（P＜0.01），符合2 型糖尿病小鼠高血糖模型。見表1。

3.2 各組小鼠血清肌酐、尿素氮、尿蛋白/肌酐比值比較 三組小鼠在血肌酐、尿素氮無明顯差異（P＞0.05）。相對于NC 組，DKD 組尿蛋白/肌酐比值明顯升高（P＜0.01），經過卡格列凈干預后，與DKD 組小鼠比較，DKD+Can 組小鼠體質量及尿蛋白/肌酐比值明顯下降（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠生化指標比較（）

表1 各組小鼠生化指標比較（）

注：NC 組為正常對照組；DKD 組為糖尿病腎病組；DKD+Can 組為卡格列凈干預糖尿病腎病組；HbA1c 為糖化血紅蛋白；與NC 組比較，aP＜0.05；與DKD 組比較，bP＜0.05

3.3 Western blot 技術檢測小鼠腎臟Sirt1、Claudin-1、β-catenin、Snail 蛋白表達水平 Western blot 結果顯示，與NC 組比較，DKD 組Sirt1 蛋白表達水平下降（P＜0.01）；與DKD 組比較，DKD+Can 組Sirt1 蛋白表達水平上升（P ＜0.01）；DKD 組Claudin-1、βcatenin、Snail 表達較NC 組升高（P 均＜0.01）。DKD+Can 組Claudin-1、β-catenin 和Snail 表達水平較DKD 組下降（P 均＜0.01），見表2、圖1。

表2 各組小鼠腎組織Sirt1、Claudin-1、β-catenin、Snail 蛋白相對表達量比較（）

表2 各組小鼠腎組織Sirt1、Claudin-1、β-catenin、Snail 蛋白相對表達量比較（）

注：NC 組為正常對照組；DKD 組為糖尿病腎病組；DKD+Can 組為卡格列凈干預糖尿病腎病組；Sirt1 為沉默信息調節(jié)因子1；Claudin-1 為緊密連接蛋白-1；β-catenin 為連接素；Snail 為鋅指轉錄因子；β-actin 為內參；與NC 組比較，aP＜0.05；與DKD 組比較，bP＜0.01

3.4 腎臟病理 各組小鼠腎小球PAS 染色結果顯示，NC 組、DKD 組小鼠出現腎小球硬化，在使用卡格列凈12 周后DKD 小鼠腎小球損傷減輕。見圖2。

4 討論

卡格列凈作為SGLT2 抑制劑的一種，不同于以往降糖藥物，降血糖機制是降低腎糖閾，增加尿糖、尿鈉排泄及輕度滲透性利尿，因此帶走一部分熱量及水分，減低球內壓，能夠使血糖及血壓降低，體質量減輕[5]。除上述作用之外，CREDENC 研究表明，卡格列凈降低尿蛋白、血肌酐水平，延緩DKD 進展作用，可能與降低腎小球內濾過壓，改善腎臟氧合水平相關，但具體作用機制尚未完全明確[6]。

本研究發(fā)現，在高脂飲食誘導下，DKD 小鼠出現腎小球硬化，在使用卡格列凈12 周后DKD 小鼠尿蛋白明顯減少，腎小球損傷減輕，由此提示卡格列凈對DKD 小鼠腎臟的保護作用。Westren blot 顯示，DKD 小鼠中Sirt1 水平下降，Claudin-1、β-catenin/Snail 水平升高，而使用卡格列凈后，Sirt1 水平明顯上調，Claudin-1、β-catenin/Snail 下調，這表示卡格列凈能可能通過經過上調Sirt1，下調Claudin-1 水平對DKD 小鼠腎臟起保護作用。

Sirt1 與體內多種生理功能的調節(jié)密切相關，包括基因轉錄、能量代謝、腫瘤發(fā)生以及細胞衰老等，在糖代謝、脂代謝和胰島素分泌調節(jié)中發(fā)揮著更加重要的作用。研究表明，Sirt1 與DKD 發(fā)病過程密切相關，Sirt1 水平下降通過多個信號通路調節(jié)下游蛋白活性，參與DKD 生理病理過程[7]。Sirt1 激活劑在DKD 病程中起保護作用，有抗氧化、抗纖維化及抑制炎癥等作用，因此Sirt1 激活劑成為治療DKD 的候選藥物[8]。Hasegawa 等[9]研究發(fā)現，在DKD 小鼠模型中Sirt1 水平下降及Claudin-1 水平上調，與β-catenin和Snail 的表達增加有關，并且在培養(yǎng)的足細胞中減少突觸素、下調突觸足蛋白的表達，最終導致足細胞消失，引起蛋白尿。而在本研究中，卡格列凈能夠通過上調Sirt1 水平，下調Claudin-1、β-catenin、Snail 蛋白表達逆轉了這一過程。

綜上所述，本研究結果顯示，卡格列凈能減少DKD 小鼠模型尿蛋白，改善腎臟損傷，從而延緩DKD 進展，機制之一可能與激活Sirt1/Claudin-1/βcatenin/Snail 信號通路有關。