干漆乙醇提取物通過調(diào)控HOXA-AS3/miR-29b分子軸抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲誘導(dǎo)凋亡*

董秋月,吳立春，劉妍喬，何進偉△

1.四川省樂山市市中區(qū)腫瘤醫(yī)院檢驗科，四川樂山 614000；2.四川省腫瘤醫(yī)院檢驗科，四川成都 610041

2020年全球女性乳腺癌新發(fā)病例2 260 000例，死亡病例680 000例，已超越肺癌成為全球第一大癌癥[1-2]。乳腺癌病例發(fā)現(xiàn)時多數(shù)已經(jīng)是中晚期，且復(fù)發(fā)率高、五年生存期短，給患者及其家庭帶來巨大的經(jīng)濟壓力和精神負擔(dān)[3-4]。因此，尋找高效、低毒的抗乳腺癌藥物是當(dāng)前亟待解決的重大課題。

干漆是我國傳統(tǒng)中藥之一。近年研究顯示，干漆乙醇提取物可抑制乳腺癌實體腫瘤生長及其相關(guān)的肺轉(zhuǎn)移[5]，但其抗腫瘤機制目前尚未完全闡明。微小RNA(miR)-29b是一種抑癌基因，與肝癌、膽管癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6-9]；同時miR-29b在乳腺癌中表達下調(diào)，高表達miR-29b能抑制乳腺癌增殖，誘導(dǎo)凋亡等生物學(xué)進程[10]。生物信息學(xué)分析顯示長鏈非編碼RNA(lncRNA)同源盒基因A反義轉(zhuǎn)錄3(HOXA-AS3)和miR-29b之間存在相互作用。HOXA-AS3高表達能促進肺癌[11]、膠質(zhì)瘤[12]的進展，但干漆乙醇提取物能否調(diào)控HOXA-AS3/miR-29b分子軸進而影響乳腺癌細胞的生物學(xué)行為尚不清楚。本研究擬通過觀察不同水平的干漆乙醇提取物對乳腺癌細胞T47D增殖、遷移、侵襲、凋亡以及HOXA-AS3和miR-29b表達的影響，初步探討干漆乙醇提取物調(diào)控乳腺癌生物學(xué)行為的分子機制，為干漆乙醇提取物防治乳腺癌提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細胞和試劑 人乳腺癌細胞T47D購于美國模式培養(yǎng)物集存庫；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國Gibco公司；干漆購于中藥材批發(fā)市場；細胞轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000、TRIzol試劑盒購于美國Ivitrogen公司；微小RNA(miRNA)抑制物陰性對照(anti-miR-NC)、miR-29b抑制物(anti-miR-29b)、空載體(pcDNA)、HOXA-AS3過表達載體(pcDNA-HOXA-AS3)、HOXA-AS3小干擾RNA(si-HOXA-AS3)、HOXA-AS3小干擾RNA陰性對照(si-NC)由上海生工生物工程有限公司提供；miR cDNA第一鏈合成試劑盒、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒購于大連Takara公司；Transwell小室和基質(zhì)膠購于美國BD公司；CCK-8試劑盒、膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)雙染細胞凋亡檢測試劑盒購于杭州貝博生物技術(shù)公司；兔源P21、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、上皮細胞鈣黏蛋白(E-cadherin)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體購于美國CST公司；山羊抗兔二抗購于南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1干漆乙醇提取物的制備[13]將100 g干燥的干漆粉碎為粗粉，置于容器內(nèi)，以料液比1∶3比例加入95%乙醇冷浸72 h，用紗布過濾，得濾液。重復(fù)冷浸提取3次，合并濾液，在40 ℃下減壓濃縮并收回乙醇至無醇味，冷凍干燥，得干漆乙醇提取物，-20 ℃保存?zhèn)溆?。提取率?0.5%。

1.2.2細胞培養(yǎng)和分組 乳腺癌細胞T47D采用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用不同水平(0、25、50、75 μg/mL)的干漆乙醇提取物處理T47D細胞48 h，檢測細胞增殖抑制率、克隆形成、遷移、侵襲、凋亡以及HOXA-AS3和miR-29b表達的變化，確定后續(xù)實驗干漆乙醇提取物使用水平。為驗證干漆乙醇提取物是通過調(diào)控HOXA-AS3/miR-29b分子軸進而影響乳腺癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲，利用LipofectamineTM 2000將pcDNA3.1、pcDNA3.1-HOXA-AS3、anti-miR-NC、anti-miR-29b分別轉(zhuǎn)染T47D細胞，轉(zhuǎn)染成功的T47D細胞用75 μg/mL的干漆乙醇提取物干預(yù)48 h，依次記為干漆75 μg/mL+pcDNA3.1組、干漆75 μg/mL+pcDNA3.1-HOXA-AS3組、75 μg/mL+anti-miR-NC組、干漆75 μg/mL+anti-miR-29b組，檢測T47D細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡變化。

1.2.3CCK-8法檢測細胞活力 將1×104個T47D細胞鋪于96孔板，根據(jù)實驗分組進行相應(yīng)細胞處理后，向各孔內(nèi)加入10 μL的CCK-8試劑，繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處各孔的吸光度值，計算細胞增殖抑制率。

1.2.4克隆形成實驗檢測細胞克隆能力 細胞按照上述分組進行干預(yù)后，用胰酶消化細胞，取2×103個細胞接種于6孔板，將細胞均勻分散后，置于細胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)7 d，當(dāng)看到肉眼可見的集落時，棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞1次，分別加入多聚甲醛和結(jié)晶紫染液進行固定和染色，PBS沖洗3次，常溫晾干后，顯微鏡下統(tǒng)計>50個細胞的集落數(shù)。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測凋亡 收集上述各組細胞，PBS洗滌細胞2次，離心后加入適量結(jié)合緩沖液調(diào)整為1×106cells/mL的單細胞懸液。取100 μL細胞懸液加入到流式管，按照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒分別加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI，避光孵育15 min，加入400 μL結(jié)合緩沖液混勻，采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況。

1.2.6Transwell實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力 侵襲實驗：在小室內(nèi)鋪上用PBS 1∶8稀釋的Matrigel(50 mg/L)基質(zhì)膠備用。收集上述各組細胞，采用不含血清的培養(yǎng)基調(diào)整細胞水平為3×106cells/mL。將Transwell小室放入24孔板，向上室內(nèi)加入300 μL的細胞懸液，下室加入含20%血清的細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱孵育24 h，小心擦去未過膜細胞，4%的多聚甲醛固定10 min，0.1%的結(jié)晶紫染色5 min，PBS洗滌后，將Transwell小室倒置于顯微鏡下拍照，隨機選取3個視野拍照，記錄過膜細胞數(shù)，其平均值即為細胞侵襲數(shù)目。遷移實驗采用未包被基質(zhì)膠的Transwell小室，其他步驟同上。

1.2.7qRT-PCR檢測HOXA-AS3和miR-29b的表達 TRIzol試劑盒提取各組的細胞總RNA，并分別應(yīng)用miR cDNA第一鏈合成試劑盒和PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒合成cDNA模板，采用SYBR?Premix Ex TaqTM進行qRT-PCR檢測。分別以U6和GAPDH為內(nèi)參照檢測miR-29b和HOXA-AS3的表達。應(yīng)用2-ΔΔCt法計算miR-29b和靶標(biāo)HOXA-AS3的表達量。引物由北京華大基因公司合成，序列如下。HOXA-AS3上游5′-GCTGAATTAACGGTGGCTCC-3′，HOXA-AS3下游5′-ATGGCGAGCGAAGGGAAG-3′；GAPDH上游5′-TTAAAAGCAGCCCTGGTGAC-3′，GAPDH下游5′-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3′；miR-29b上游5′-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3′；miR-29b下游5′-CACUGAUUUCAAAUGGUGUUAUU-3′；U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6下游5′-AACGCTTCTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.8Western blot檢測P21、Caspase-3、E-cadherin和MMP-2蛋白的表達 各組細胞進行相應(yīng)處理后棄去細胞培養(yǎng)液，加入4 ℃預(yù)冷的細胞裂解液，冰上裂解30 min后提取細胞總蛋白。BCA試劑盒測定細胞蛋白水平。煮沸3 min變性細胞蛋白。配制分離膠和濃縮膠，每孔上樣30 μg，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，分別加入稀釋的P21、Caspase-3、E-cadherin、MMP-2和GAPDH抗體后，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次后，加入稀釋的二抗溶液，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次后，用增強型化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色。以GAPDH為內(nèi)參，采用圖像處理軟件ImageJ分析目的條帶灰度值。

1.2.9雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?采用Targetscan數(shù)據(jù)庫進行靶基因預(yù)測顯示，HOXA-AS3與miR-29b之間存在部分連續(xù)結(jié)合的核苷酸序列，并采用雙熒光酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-29b和HOXA-AS3的靶向關(guān)系。含有miR-29b結(jié)合位點的野生型熒光素酶報告基因載體WT-HOXA-AS3和突變型熒光素酶報告基因載體MUT-HOXA-AS3的構(gòu)建由上海吉凱基因提供。將WT-HOXA-AS3、MUT-HOXA-AS3分別與miR-con、miR-29b mimics共轉(zhuǎn)染至T47D細胞，轉(zhuǎn)染48 h，檢測各組細胞的熒光素酶活性。為進一步驗證HOXA-AS3對miR-29b的調(diào)控關(guān)系，將pcDNA3.1、pcDNA3.1-HOXA-AS3、si-NC、si-HOXA-AS3分別轉(zhuǎn)染至T47D細胞，轉(zhuǎn)染48 h，采用qRT-PCR檢測miR-29b的表達。

2 結(jié) 果

2.1干漆乙醇提取物對細胞T47D增殖、凋亡的影響 與空白對照組比較，干漆乙醇提取物處理組T47D細胞P21和Caspase-3蛋白的表達顯著升高，細胞抑制率顯著升高，克隆形成數(shù)顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1。

注：A為干漆乙醇提取物對細胞T47D凋亡的影響；B為干漆乙醇提取物對細胞T47D中P21、Caspase-3蛋白表達的影響；a為0 μg/mL干漆乙醇提取物組，b為25 μg/mL干漆乙醇提取物組，c為50 μg/mL干漆乙醇提取物組，d為75 μg/mL干漆乙醇提取物組。

表1 干漆乙醇提取物對細胞T47D增殖、凋亡的影響

2.2干漆乙醇提取物對細胞T47D遷移、侵襲的影響 與空白對照組比較，干漆乙醇提取物處理組T47D細胞E-cadherin蛋白的表達顯著升高，MMP-2蛋白的表達顯著降低，遷移和侵襲細胞數(shù)目顯著減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著干漆乙醇提取物水平的逐漸增加，其對T47D細胞遷移、侵襲的抑制作用逐漸增強。見圖2、表2。

注：A為干漆乙醇提取物對細胞T47D遷移、侵襲能力的影響；B為干漆乙醇提取物對細胞T47D中E-cadherin、MMP-2蛋白表達的影響；a為0 μg/mL干漆乙醇提取物組，b為25 μg/mL干漆乙醇提取物組，c為50 μg/mL干漆乙醇提取物組，d為75 μg/mL干漆乙醇提取物組。

表2 干漆乙醇提取物對細胞T47D遷移、侵襲的影響

2.3干漆乙醇提取物對細胞T47D中HOXA-AS3、miR-29b表達的影響 與空白對照組比較，干漆乙醇提取物處理組T47D細胞HOXA-AS3的表達顯著降低(P<0.05)，miR-29b的表達顯著升高(P<0.05)。隨著干漆乙醇提取物水平的逐漸升高，其對T47D細胞中HOXA-AS3和miR-29b表達的影響逐漸增強。見表3。

表3 干漆乙醇提取物對細胞T47D中HOXA-AS3、miR-29b表達的影響

2.4過表達HOXA-AS3能逆轉(zhuǎn)干漆乙醇提取物對細胞T47D增殖、凋亡的影響 與干漆75 μg/mL+pcDNA3.1組比較，干漆75 μg/mL+pcDNA3.1-HOXA-AS3組T47D細胞P21和Caspase-3蛋白的表達顯著降低，細胞抑制率顯著降低，克隆形成數(shù)顯著增多，細胞凋亡率顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表4。

表4 過表達HOXA-AS3能逆轉(zhuǎn)干漆乙醇提取物對細胞T47D增殖、凋亡的影響

注：A為過表達HOXA-AS3能逆轉(zhuǎn)干漆乙醇提取物對細胞T47D凋亡的影響；B為過表達HOXA-AS3能逆轉(zhuǎn)干漆乙醇提取物對細胞T47D中P21、Caspase-3蛋白表達的影響；a為干漆75 μg/mL+pcDNA3.1組，b為干漆75 μg/mL+pcDNA3.1-HOXA-AS3組。

2.5過表達HOXA-AS3能逆轉(zhuǎn)干漆乙醇提取物對細胞T47D遷移、侵襲的影響 與干漆75 μg/mL+pcDNA3.1組比較，干漆75 μg/mL+pcDNA3.1-HOXA-AS3組T47D細胞HOXA-AS3的表達顯著升高，E-cadherin蛋白的表達顯著降低，MMP-2蛋白的表達顯著升高，遷移和侵襲細胞數(shù)目顯著增多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4、表5。

注：A為過表達HOXA-AS3能逆轉(zhuǎn)干漆乙醇提取物對細胞T47D遷移、侵襲能力的影響；B為過表達HOXA-AS3能逆轉(zhuǎn)干漆乙醇提取物對細胞T47D中E-cadherin、MMP-2蛋白表達的影響；a為干漆75 μg/mL+pcDNA3.1組，b為干漆75 μg/mL+pcDNA3.1-HOXA-AS3組。

表5 過表達HOXA-AS3能逆轉(zhuǎn)干漆乙醇提取物對細胞T47D遷移、侵襲的影響

2.6抑制miR-29b能逆轉(zhuǎn)干漆乙醇提取物對細胞T47D增殖、凋亡的影響 與干漆75 μg/mL+anti-miR-NC組比較，干漆75 μg/mL+anti-miR-29b組T47D細胞P21和Caspase-3蛋白的表達顯著降低，細胞抑制率顯著降低，克隆形成數(shù)顯著增多，細胞凋亡率顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5、表6。

表6 抑制miR-29b能逆轉(zhuǎn)干漆乙醇提取物對細胞T47D增殖、凋亡的影響

注：A為抑制miR-29b能逆轉(zhuǎn)干漆乙醇提取物對細胞T47D凋亡的影響；B為抑制miR-29b能逆轉(zhuǎn)干漆乙醇提取物對細胞T47D中P21、Caspase-3蛋白表達的影響；a為干漆75 μg/mL+anti-miR-NC組，b為干漆75 μg/mL+anti-miR-29b組。

2.7抑制miR-29b能逆轉(zhuǎn)干漆乙醇提取物對細胞T47D遷移、侵襲的影響 與干漆75 μg/mL+anti-miR-NC組比較，干漆75 μg/mL+anti-miR-29b組T47D細胞miR-29b的表達顯著降低，E-cadherin蛋白的表達顯著降低，MMP-2蛋白的表達顯著升高，遷移和侵襲細胞數(shù)目顯著增多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖6、表7。

注：A為抑制miR-29b能逆轉(zhuǎn)干漆乙醇提取物對細胞T47D遷移、侵襲能力的影響；B為抑制miR-29b能逆轉(zhuǎn)干漆乙醇提取物對細胞T47D中E-cadherin、MMP-2蛋白表達的影響；a為干漆75 μg/mL+anti-miR-NC組，b為干漆75 μg/mL+anti-miR-29b組。

表7 抑制miR-29b能逆轉(zhuǎn)干漆乙醇提取物對細胞T47D遷移、侵襲的影響

2.8HOXA-AS3靶向調(diào)控miR-29b Starbase預(yù)測顯示HOXA-AS3與miR-29b之間存在本分連續(xù)結(jié)合位點，見圖7。雙熒光素酶報告實驗顯示，與miR-NC和WT-HOXA-AS3共轉(zhuǎn)染組比較，miR-29b和WT-HOXA-AS3共轉(zhuǎn)染組T47D細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；與miR-NC和MUT-HOXA-AS3共轉(zhuǎn)染組比較，miR-29b和MUT-HOXA-AS3共轉(zhuǎn)染組T47D細胞的熒光素酶活性變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表8。qRT-PCR檢測顯示，與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-HOXA-AS3組T47D細胞miR-29b的表達顯著降低(P<0.05)；與si-NC組比較，si-HOXA-AS3組T47D細胞miR-29b的表達顯著升高(P<0.05)，見表9。提示HOXA-AS3靶向miR-29b并負性調(diào)控其表達。

圖7 HOXA-AS3靶向miR-29b

表8 雙熒光素酶報告實驗

表9 HOXA-AS3調(diào)控miR-29b的表達

3 討 論

近年來乳腺癌的發(fā)病率和病死率不斷升高并呈現(xiàn)年輕化趨勢，雖然治療手段及其方案不斷完善，但臨床治療效果并不顯著。研究顯示，中藥輔助治療在提高乳腺癌患者5年生存率和延長生存期方面發(fā)揮重要作用[14]。

干漆又名漆渣、漆底、漆腳、續(xù)命筒、黑漆，歷版《中國藥典》均有收錄，具有破瘀血、消積、殺蟲等功效，主要用于治療婦女經(jīng)閉、瘀血、蟲積、肝臟疾病、胃病和傳染病等[15]?，F(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究表明，干漆乙醇提取物具有顯著的抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤和神經(jīng)保護作用[16-18]。研究證實，干漆乙醇提取物可抑制人肺癌細胞A549以及人慢性粒細胞白血病K562細胞的生長并誘導(dǎo)凋亡作用[19-20]，抑制胰腺癌細胞的遷移和侵襲[21]；與此同時，干漆乙醇提取物還可通過腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和p53途徑分別調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的存活和凋亡[22-23]。本研究結(jié)果顯示，干漆乙醇提取物呈劑量依賴性地抑制乳腺癌細胞T47D增殖，抑制MMP-2表達，促進P21、Caspase-3和E-cadherin表達，抑制其遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細胞凋亡，抑制乳腺癌細胞的惡性生物學(xué)行為。

miRNA廣泛參與腫瘤進展的多個生物學(xué)過程，近年來其被認為是中藥化合物抗腫瘤的潛在靶點[24]。miR-29b是miR-29家族成員之一，研究顯示乳腺癌等多種癌癥中miR-29b異常表達，與癌細胞增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移和藥物耐受相關(guān)[25]。本研究結(jié)果顯示，干漆乙醇提取物呈劑量依賴性地促進T47D細胞miR-29表達，抑制miR-29表達可逆轉(zhuǎn)干漆乙醇提取物對T47D細胞的凋亡誘導(dǎo)以及增殖、遷移、侵襲抑制的影響，提示miR-29b可能是干漆乙醇提取物抗乳腺癌的作用靶點。HOXA-AS3是一種新型的lncRNA，已有研究表明肝癌中HOXA-AS3表達上調(diào)，下調(diào)HOXA-AS3表達通過抑制絲裂原活化蛋白激酶/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(MEK/ERK)信號通路進而抑制肝癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)進程[26]。下調(diào)HOXA-AS3表達還可增強順鉑對非小細胞肺癌的體內(nèi)外療效[27]。本研究結(jié)果顯示，干漆乙醇提取物呈劑量依賴性地抑制T47D細胞HOXA-AS3表達；本研究還發(fā)現(xiàn)，過表達HOXA-AS3可逆轉(zhuǎn)干漆乙醇提取物對T47D細胞增殖、遷移、侵襲以及凋亡的影響。此外，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蚖estern blot證實，HOXA-AS3靶向miR-29b并負性調(diào)控miR-29b表達。因此，調(diào)控HOXA-AS3/miR-29b分子軸是干漆乙醇提取物調(diào)控乳腺癌細胞惡性生物學(xué)行為的重要機制。有研究報道，漆酚可能是干漆乙醇提取物的主要化學(xué)成分[28-29]，但漆酚是否是其發(fā)揮抗癌作用的主要成分還有待后續(xù)試驗進行深層次研究。