過(guò)敏性紫癜患兒TLR4、LTB4、SOCS5表達(dá)與Th1和Th2的關(guān)系*

黃翠影，李 軍，張 菂，蔡 花，幺 鑫，王彩芳△

1.河北省唐山市婦幼保健院兒內(nèi)科，河北唐山 063000；2.開(kāi)灤總醫(yī)院麻醉科，河北唐山 063000；3.開(kāi)灤總醫(yī)院兒科，河北唐山 063000

過(guò)敏性紫癜(HSP)屬于系統(tǒng)性血管炎的一種，主要是由免疫復(fù)合物介導(dǎo)的出血性疾病[1]。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為HSP是由免疫蛋白A介導(dǎo)的免疫復(fù)合物沉積在血管壁所誘發(fā)的免疫損傷，擴(kuò)增血管壁的通透性，血液與淋巴液從其中滲出，最終導(dǎo)致體內(nèi)多部位發(fā)生病變[2]。同時(shí)，HSP也會(huì)受細(xì)胞免疫功能紊亂、細(xì)胞因子等影響[3]。HSP發(fā)病的關(guān)鍵就是感染，而Toll樣受體(TLR)則能夠?qū)Σ≡嚓P(guān)分子模式進(jìn)行識(shí)別，且在輔助型T細(xì)胞1(Th1)/輔助型T細(xì)胞2(Th2)免疫應(yīng)答失衡期間，TLR也會(huì)參與其中[4]。而在過(guò)敏性炎癥遲發(fā)階段，白三烯B4(LTB4)為具有大量表達(dá)的炎癥介質(zhì)參與炎性反應(yīng)過(guò)程[5]，細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白(SOCS)是一類由多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生，對(duì)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有抑制作用的負(fù)調(diào)節(jié)因子，SOCS5正向調(diào)控Th1分化，負(fù)向調(diào)控Th2分化[6]，但其與Th1和Th2關(guān)系的研究較少，因此本研究通過(guò)對(duì)HSP患兒的TLR4、LTB4、SOCS5和Th1/Th2表達(dá)及關(guān)系進(jìn)行分析，旨在為臨床HSP患兒的診斷和治療提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究選取2018年6月至2021年6月河北省唐山市婦幼保健院和開(kāi)灤總醫(yī)院接診的86例HSP患兒作為研究組，選取同期河北省唐山市婦幼保健院和開(kāi)灤總醫(yī)院體檢健康兒童90例作為對(duì)照組，回顧性收集病歷資料和實(shí)驗(yàn)室檢查資料。研究組男46例，女40例；年齡3～12歲，平均(8.57±1.65)歲；分型：?jiǎn)渭冃?0例，混合型66例，根據(jù)是否伴有腎損害將混合型HSP患兒分為伴有腎損害組(23例)和未伴有腎損害組(43例)。對(duì)照組男51例，女39例；年齡3～12歲，平均(8.51±1.71)歲。兩組患兒性別、年齡等一般資料差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)(第7版)》[7]兒童HSP診療規(guī)范，符合HSP的診斷標(biāo)準(zhǔn)且需具備HSP診療依據(jù)；(2)入組前1個(gè)月內(nèi)未接受相關(guān)糖皮質(zhì)激素治療；(3)HSP和健康兒童臨床資料均齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床病歷資料不完整；(2)入組前1個(gè)月內(nèi)存在感染史或過(guò)敏性疾病史；(3)患兒入組前1個(gè)月內(nèi)接受糖皮質(zhì)激素或其他免疫制劑的治療；(4)患兒合并先天性遺傳性疾??；(5)患兒合并免疫性疾病、惡性腫瘤或其他慢性疾?。?6)患兒凝血功能異常。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。均與兒童家屬取得聯(lián)系，獲得家屬知情同意。

1.2方法

1.2.1資料收集 研究組：(1)入院前已經(jīng)確診，需要對(duì)患兒的病例資料完整收集，并進(jìn)行核對(duì)和檢查；(2)入院前未經(jīng)確診，于入院時(shí)抽取靜脈血2 mL，采集血液標(biāo)本后，將血液在3 h內(nèi)分離血清，以3 500 r/min離心15 min后取其上清液，并將其置于-20 ℃的環(huán)境中保存?zhèn)錂z。對(duì)照組：收集所有健康兒童體檢時(shí)臨床資料和實(shí)驗(yàn)室檢查資料。

1.2.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 送檢測(cè)定LTB4和Th1、Th2水平[選取兩個(gè)代表性指標(biāo)白細(xì)胞介素(IL)-4和γ干擾素(IFN-γ)]采用ELISA測(cè)定，試劑盒購(gòu)自上海邦景實(shí)業(yè)有限公司，根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行嚴(yán)格操作。

1.2.3外周血檢測(cè) 外周血單核細(xì)胞：使用肝素鈉抗凝管收集所有納入研究?jī)和庵莒o脈血5 mL，將其外周血單核細(xì)胞進(jìn)行分離，應(yīng)用RNA提取并懸浮，完成后將其置于-80 ℃冰箱，待測(cè)TLR4和SOCS5 mRNA水平。采用TLR4和SOCS5分離試劑盒(上海瑞番生物科技)提取所需總RNA，詳細(xì)步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行，再使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將cDNA合成PCR引物，以GAPDH作為內(nèi)參基因，引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

1.2.4基因檢測(cè) SOCS5基因表達(dá)：反應(yīng)體系為每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，循環(huán)條件為95 ℃。反應(yīng)條件為95 ℃和60 ℃下分別循環(huán)30 s、95 ℃下預(yù)變性3 min，并將60 ℃的溫度下時(shí)間延長(zhǎng)至30 s退火，并將72 ℃延伸至60 s，共計(jì)39個(gè)循環(huán)。TLR4基因表達(dá)檢測(cè)：反應(yīng)體系為每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，循環(huán)條件為95 ℃ 5 min，95 ℃和60 ℃下分別循環(huán)30 s、72 ℃下循環(huán)30 s，共對(duì)其進(jìn)行循環(huán)40次，并將60 ℃的溫度下時(shí)間延長(zhǎng)至5 min。

2 結(jié) 果

2.1研究組和對(duì)照組TLR4、SOCS5 mRNA表達(dá)水平比較 研究組TLR4 mRNA和SOCS5 mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 研究組和對(duì)照組TLR4和SOCS5 mRNA表達(dá)水平比較

2.2研究組和對(duì)照組LTB4、Th1和Th2表達(dá)水平比較 研究組LTB4和IL-4表達(dá)水平均高于對(duì)照組，IFN-γ表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 研究組和對(duì)照組LTB4、Th1和Th2表達(dá)水平比較

2.3不同分型HSP患兒TLR4、SOCS5 mRNA表達(dá)水平比較 混合型HSP患兒TLR4 mRNA和SOCS5 mRNA表達(dá)水平均高于單純型HSP患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 不同分型HSP患兒TLR4、SOCS5 mRNA表達(dá)水平比較

2.4不同分型HSP患兒LTB4、Th1和Th2表達(dá)水平比較 混合型HSP患兒LTB4和IL-4表達(dá)水平均高于單純型HSP患兒，IFN-γ表達(dá)水平低于單純型HSP患兒，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表5 不同分型HSP患兒LTB4、Th1和Th2表達(dá)水平比較

2.5是否伴有腎損害HSP患兒TLR4、SOCS5 mRNA表達(dá)水平比較 HSP混合型組中伴有腎損害患兒TLR4 mRNA和SOCS5 mRNA表達(dá)水平均高于未伴有腎損害患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表6。

表6 是否伴有腎損害HSP患兒TLR4和SOCS5 mRNA表達(dá)水平比較

2.6是否伴有腎損害HSP患兒LTB4、Th1和Th2表達(dá)水平比較 HSP混合型組中伴有腎損害患兒LTB4和IL-4表達(dá)水平均高于未伴有腎損害患兒，IFN-γ表達(dá)水平低于未伴有腎損害患兒，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表7。

表7 是否伴有腎損害HSP患兒LTB4、Th1和Th2表達(dá)水平比較

2.7TLR4、LTB4和SOCS5表達(dá)水平與IFN-γ和IL-4表達(dá)水平的相關(guān)性 TLR4、LTB4和SOCS5表達(dá)水平與IFN-γ均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.920、-0.935、-0.970，P<0.05)；TLR4、LTB4和SOCS5表達(dá)水平與IL-4均呈正相關(guān)(r=0.991、0.975、0.973，P<0.05)。

2.8TLR4、LTB4、SOCS5、IFN-γ和IL-4對(duì)HSP的診斷價(jià)值 TLR4、LTB4、SOCS5、IFN-γ和IL-4診斷HSP的ROC曲線下面積(AUC)均在0.750以上，均具有較高的特異度和靈敏度，其中聯(lián)合檢測(cè)的AUC為0.977，顯著高于各項(xiàng)單獨(dú)檢測(cè)，見(jiàn)表8、圖1。

表8 TLR4、LTB4、SOCS5、IFN-γ和IL-4對(duì)HSP的診斷價(jià)值

圖1 TLR4、LTB4、SOCS5、IFN-γ和IL-4診斷HSP的ROC曲線

3 討 論

兒童HSP屬于兒科常見(jiàn)疾病，其發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，目前臨床認(rèn)為該疾病是由多種因素所作用，并非單一因素所致[8]，發(fā)病機(jī)制可能為：(1)受環(huán)境因素影響，可刺激T淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致免疫功能發(fā)生紊亂，并促使T淋巴細(xì)胞不斷擴(kuò)增，最終使得免疫球蛋白A介導(dǎo)廣泛白細(xì)胞碎裂，形成小血管炎；(2)機(jī)體內(nèi)炎癥細(xì)胞因子水平的提高；(3)凝血因素也會(huì)產(chǎn)生影響，可見(jiàn)機(jī)體內(nèi)小血管存在局部血栓[9]。近幾年有學(xué)者針對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群展開(kāi)研究，研究結(jié)果卻并不統(tǒng)一，但其中關(guān)于HSP患兒存在輔助型T細(xì)胞(Th)免疫功能紊亂的觀點(diǎn)卻比較一致[10]。在疾病急性發(fā)作期，患兒體內(nèi)還存在Th1/Th2失衡的情況，在機(jī)體免疫反應(yīng)中，Th是重要的調(diào)控/效應(yīng)細(xì)胞，若Th1/Th2失衡，則會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)免疫功能出現(xiàn)失衡的情況，同時(shí)在其他因子協(xié)同作用下發(fā)生免疫性疾病[11]。

IFN-γ是機(jī)體Th1分泌的主要細(xì)胞因子，在細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)過(guò)程中參與介導(dǎo)，IL-4是由機(jī)體Th2分泌的細(xì)胞因子，主要在機(jī)體體液免疫過(guò)程中參與介導(dǎo)[12]。有學(xué)者指出，在HSP的發(fā)病過(guò)程中，機(jī)體體液免疫應(yīng)答過(guò)程逐漸增強(qiáng)，通過(guò)Th2對(duì)抗原的識(shí)別功能可以促進(jìn)B細(xì)胞的克隆活化，從而為機(jī)體提供抗原和刺激信號(hào)，促進(jìn)機(jī)體循環(huán)[13]。在本研究中，研究組IL-4表達(dá)水平高于對(duì)照組，IFN-γ表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示HSP患兒體內(nèi)Th1/Th2紊亂，Th2活化程度過(guò)強(qiáng)，體液免疫功能增強(qiáng)。

TLR不僅表達(dá)于人體單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及樹(shù)突細(xì)胞等細(xì)胞表面，同時(shí)也在纖維細(xì)胞中有表達(dá)，目前已有相關(guān)研究指出TLR參與機(jī)體的免疫應(yīng)答過(guò)程，與機(jī)體炎性反應(yīng)存在密切關(guān)系，并可介導(dǎo)機(jī)體炎癥和免疫功能紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體免疫性疾病的發(fā)生[14]。TLR4是機(jī)體中最重要的TLR分子之一，本研究發(fā)現(xiàn)HSP患兒體內(nèi)TLR4分子呈高表達(dá)，且隨著患兒病情的加重和混合病型的出現(xiàn)，TLR4逐漸升高，分析其原因主要為當(dāng)機(jī)體外周血中TLR4高表達(dá)時(shí)，外源性配體對(duì)其產(chǎn)生一定刺激，從而參與疾病的發(fā)生，同時(shí)該分子可以在機(jī)體內(nèi)識(shí)別相關(guān)配體后對(duì)下游信號(hào)通路給予激活，從而調(diào)節(jié)機(jī)體多種細(xì)胞因子的合成[15]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)TLR4與IL-4呈正相關(guān)，與IFN-γ呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)在Th1和Th2生成過(guò)程中，TLR4在機(jī)體內(nèi)的高表達(dá)可能參與其調(diào)節(jié)機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Th1和Th2免疫應(yīng)答的調(diào)控。

而當(dāng)機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)時(shí)，花生四烯酸經(jīng)酶會(huì)產(chǎn)生一定的促炎性反應(yīng)作用，從而促進(jìn)LTB4的產(chǎn)生，LTB4在機(jī)體的多種疾病和反應(yīng)過(guò)程中均有參與，是對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈效應(yīng)的一種細(xì)胞催化劑[16]。在本研究中，研究組LTB4表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)，分析原因主要為L(zhǎng)TB4可以將機(jī)體內(nèi)參與免疫和炎性反應(yīng)的細(xì)胞進(jìn)行收集并激活，而該類細(xì)胞被激活后會(huì)反作用于LTB4的釋放，使其在機(jī)體內(nèi)形成放大效應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)發(fā)生多種炎性疾病[17]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)LTB4與IL-4呈正相關(guān)，與IFN-γ呈負(fù)相關(guān)，分析其機(jī)制主要為機(jī)體內(nèi)LTB4呈高表達(dá)時(shí)，體內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞等被激活，將細(xì)胞因子的顆粒致敏反應(yīng)給予提升，同時(shí)促進(jìn)血管內(nèi)炎性反應(yīng)，增強(qiáng)患兒局部血管通透性，而IFN-γ表達(dá)的降低會(huì)在一定程度上對(duì)患兒免疫調(diào)控功能進(jìn)行抑制，從而造成Th1/Th2平衡紊亂，進(jìn)而抑制機(jī)體免疫功能和T淋巴細(xì)胞的殺傷效用[18]。

SOCS5主要由細(xì)胞因子誘導(dǎo)而產(chǎn)生，對(duì)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有一定的抑制和調(diào)節(jié)作用，臨床研究以SOCS1、SOCS3更為深入，對(duì)于SOCS5的研究較少，但有文獻(xiàn)指出SOCS5正向調(diào)控Th1分化，負(fù)向調(diào)控Th2分化，且其主要表達(dá)在Th1[19]。在本研究中，研究組SOCS5 mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組，SOCS5表達(dá)水平與IL-4呈正相關(guān)，與IFN-γ呈負(fù)相關(guān)，分析其原因主要為SOCS5參與機(jī)體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)過(guò)程，是機(jī)體內(nèi)具有生理調(diào)節(jié)作用的固有免疫因子，通過(guò)對(duì)巨噬細(xì)胞或樹(shù)突細(xì)胞激活進(jìn)行負(fù)向調(diào)控，參與機(jī)體調(diào)控T細(xì)胞分化、成熟和凋亡的過(guò)程，主要作用是維持Thl和Th2的穩(wěn)定，在機(jī)體免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用，其中IL-4可以激活機(jī)體內(nèi)STAT3信號(hào)通路，上調(diào)SOCS5表達(dá)，而干擾IFN-γ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，主要參與調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的分化，使其共同參與HSP的發(fā)病[20]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)TLR4、LTB4、SOCS5、IFN-γ和IL-4診斷HSP的AUC均在0.750以上，均具有較高的特異度和靈敏度，其中聯(lián)合檢測(cè)診斷HSP的AUC為0.977，顯著高于各項(xiàng)單獨(dú)檢測(cè)，推測(cè)上述因子均參與患兒的發(fā)病過(guò)程，且臨床進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值較高，但具體機(jī)制尚未明確，在今后的研究中，可以通過(guò)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量和進(jìn)行基礎(chǔ)研究，分析TLR4 mRNA、LTB4、SOCS5 mRNA、IL-4和IFN-γ在伴有腎損害HSP患兒中的作用機(jī)制。

綜上所述，HSP患兒TLR4 mRNA、LTB4、SOCS5 mRNA及IL-4均呈高表達(dá)，IFN-γ呈低表達(dá)，TLR4、LTB4和SOCS5表達(dá)水平與IL-4呈正相關(guān)，與IFN-γ呈負(fù)相關(guān)，可以將其作為HSP患兒的診斷和治療參考依據(jù)，值得在臨床推廣應(yīng)用。