LncRNA FTH1P3通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和遷移能力*

周永興，譚觀橋，周大為，楊 釗

1.湖南省郴州市第四人民醫(yī)院普外科,湖南郴州 423000;2.湖南省郴州市第一人民醫(yī)院胃腸外科，湖南郴州 423000

胃癌是全球第五大常見惡性腫瘤和第三大腫瘤相關(guān)死亡原因，其中死亡率最高的地區(qū)是東亞，包括中國(guó)[1]。盡管采用了包括手術(shù)、放療、化療和生物治療在內(nèi)的綜合療法，但由于轉(zhuǎn)移引起的癌癥復(fù)發(fā)，胃癌患者5年生存率仍然很差[2]。同時(shí)目前仍然缺乏對(duì)胃癌進(jìn)展機(jī)制的了解，因此，闡明參與胃癌增殖和遷移進(jìn)展的分子機(jī)制對(duì)發(fā)現(xiàn)更有效的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，以改善患者生存和預(yù)后是必要的。多種長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)失調(diào)并在許多惡性腫瘤中發(fā)揮致癌基因或抑癌基因的作用[3]，長(zhǎng)鏈非編碼RNA鐵蛋白重鏈1偽基因3(LncRNA FTH1P3)是新近發(fā)現(xiàn)的LncRNA之一，位于染色體 2p23.3上，長(zhǎng)度為 954 個(gè)核苷酸。有研究報(bào)道，LncRNA FTH1P3在宮頸癌、乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌等常見惡性腫瘤中高表達(dá)，均為促癌分子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和化療耐藥等腫瘤不良生物學(xué)行為[4-6]，并調(diào)控磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、SP1/NF-κB等信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤進(jìn)展的作用[7-8]。然而，LncRNA FTH1P3在胃癌中的作用尚未闡明。本研究旨在驗(yàn)證LncRNA FTH1P3在胃癌組織中的表達(dá)，評(píng)估其在胃癌進(jìn)展中的臨床意義，并在細(xì)胞水平研究其在胃癌中的生物學(xué)功能和發(fā)揮作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 2014年1月至2015年10月，前瞻性地納入本院96例確診為胃癌的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前評(píng)估原發(fā)性胃癌可切除，未懷疑遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；(2)行根治性胃切除術(shù)并充分清掃淋巴結(jié)；(3)術(shù)后病理明確為胃癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)同時(shí)患有另一種惡性腫瘤；(2)伴有嚴(yán)重心肺功能障礙、肺結(jié)核、克羅恩病或精神病等基礎(chǔ)疾??；(3)有除幽門螺桿菌感染外未控制的感染。手術(shù)室分離的胃癌組織和距離腫瘤3 cm的正常胃組織，立即用液氮冷凍并儲(chǔ)存在-80 °C環(huán)境中。同時(shí)本課題按照美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)胃癌指南進(jìn)行研究，獲得本院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，并根據(jù)赫爾辛基宣言獲得所有受試者書面知情同意。

1.2試劑和儀器 TRIzol 試劑、LncRNA FTH1P3和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物、Lipofectamine 2000 試劑，美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國(guó)Promega公司；SYBR Green PCR Master Mix PCR試劑盒，美國(guó)Applied Biosystems公司；胃癌細(xì)胞株 MGC-803，中國(guó)上海醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、青霉素和鏈霉素，Thermo Fisher Scientific公司；LncRNA FTH1P3 siRNA和陰性對(duì)照 siRNA，中國(guó)上海Obio Technology公司；CCK8試劑購(gòu)自南京BestBio公司；Transwell小室，美國(guó)Corning公司；4周齡、28 g左右的BALB/c-nu雌性裸鼠，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；細(xì)胞裂解緩沖液、增強(qiáng)型 BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒和增強(qiáng)型 ECLTM檢測(cè)試劑盒，中國(guó)南京KeyGene公司；BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒，美國(guó)Thermo試劑公司；PVDF膜，美國(guó)BioRad公司；PI3K、AKT、磷酸化PI3K(pPI3K)、磷酸化AKT(pAKT)、GAPDH和二抗，英國(guó)Abcam公司。

1.3qRT-PCR TRIzol試劑提取胃癌患者腫瘤和鄰近的正常組織總的RNA，并根據(jù)說(shuō)明采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA至cDNA的合成。以cDNA為模板使用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒配制PCR反應(yīng)體系，采用Applied Biosystems 7900HT 序列檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量LncRNA FTH1P3和內(nèi)參GAPDH的表達(dá)。使用2-ΔΔCt方法評(píng)估LncRNA FTH1P3相對(duì)蛋白表達(dá)。引物序列：LncRNA FTH1P3 正向引物：5′-CTACGCCTCCTCCATTTA-3′，反向引物：5′-GCCACCTCGTTGGTTCTA-3′;GAPDH 正向引物：5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCA-3′，反向引物：5′-AGGTGGAGGAGTGGGTGT-3′。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 胃癌細(xì)胞MGC-803在含有10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 mg/mL)的RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，放置在 37 ℃含有5% CO2的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中。及時(shí)更換細(xì)胞培養(yǎng)基并在細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)采用胰酶消化并傳代。2×105個(gè)MGC-803細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)，隨機(jī)分為對(duì)照組si-NC組和實(shí)驗(yàn)組si-LncRNA FTH1P3-1組、si-LncRNA FTH1P3-2組。細(xì)胞貼壁后，按照說(shuō)明書使用Lipofectamine 2000 試劑用4 μg siRNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，即5 μL Lipofectamine 2000與4 μg 陰性對(duì)照siRNA 轉(zhuǎn)染si-NC組、5 μL Lipofectamine 2000與4 μg LncRNA FTH1P3 siRNA-1轉(zhuǎn)染si-LncRNA FTH1P3-1組、5 μL Lipofectamine 2000與4 μg LncRNA FTH1P3 siRNA-2轉(zhuǎn)染si-LncRNA FTH1P3-2組。放置在37 ℃含有5% CO2的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染48 h，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)LncRNA FTH1P3 siRNA的干擾效果。

1.5CCK8實(shí)驗(yàn) 采用96孔板和CCK8試劑進(jìn)行細(xì)胞增殖能力的測(cè)定。收集各組細(xì)胞，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗1次后，將2×103個(gè)各組MGC-803細(xì)胞懸浮在150 μL含有10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，并加至96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)平行復(fù)孔，放置在37 ℃含有5% CO2的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞貼壁計(jì)為第0 h，以及每隔24 h計(jì)為24 h、48 h和72 h。分別在對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)更換100 μL 培養(yǎng)基，并加入10 μL CCK8試劑混勻并繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各細(xì)胞在450 nm處測(cè)定吸光度值。

1.6Transwell實(shí)驗(yàn) 采用24孔板和8 μm孔徑的Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞遷移能力的測(cè)定。收集各組細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)基洗3次后，將1×105個(gè)各組MGC-803細(xì)胞懸浮在100 μL 的無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，并加至上室中培養(yǎng)。將含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(500 μL)添加到24孔板的下室中，每組設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，放置在37 ℃含有5% CO2的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。用棉簽去除殘留在Transwell小室上側(cè)的細(xì)胞。將遷移到Transwell小室下側(cè)的細(xì)胞固定在甲醇中，在室溫下用結(jié)晶紫染色30 min，在顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。

1.7裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 采用BALB/c-nu裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力。裸鼠隨機(jī)分為si-NC組和實(shí)驗(yàn)組si-LncRNA FTH1P3-1組、si-LncRNA FTH1P3-2組，每組6只。收集各組細(xì)胞，PBS洗3次后，將2×106個(gè)各組MGC-803細(xì)胞懸浮在100 μL的PBS中，接種至裸鼠右腋窩皮下。每周采用游標(biāo)卡尺測(cè)量一次皮下腫瘤的最大徑(a)和最小徑(b)，按體積 =(a×b)/2的公式計(jì)算腫瘤體積。培養(yǎng)4周左右處死裸鼠，將瘤體解剖并稱重。

1.8Western blot實(shí)驗(yàn) 采用細(xì)胞裂解緩沖液從各組細(xì)胞中提取細(xì)胞總蛋白，并使用增強(qiáng)型 BCA蛋白檢測(cè)試劑盒定量蛋白質(zhì)水平。蛋白質(zhì)煮沸變性后，通過(guò)8%～10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并電轉(zhuǎn)移到PVDF上，并將帶有沉積蛋白的PVDF膜在Tris緩沖鹽水Tween(TBST)中封閉1 h。用待檢測(cè)一抗與PVDF膜孵育，在4 ℃下過(guò)夜，TBST洗3次后，與二抗常溫孵育1 h。通過(guò)增強(qiáng)型ECLTM檢測(cè)試劑盒可視化蛋白質(zhì)條帶。

2 結(jié) 果

2.1LncRNA FTH1P3在胃癌組織中表達(dá)上調(diào) qRT-PCR檢測(cè)LncRNA FTH1P3在胃癌組織中的表達(dá)(1.51±0.74)顯著高于在鄰近的正常組織中的表達(dá)(0.94±0.55)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.128,P<0.05)。見圖1。

注：胃癌組織與鄰近的正常組織相比，*P<0.05。

2.2LncRNA FTH1P3表達(dá)與胃癌患者病理參數(shù)的關(guān)系 高表達(dá)LncRNA FTH1P3與胃癌患者年齡、性別無(wú)關(guān)(P>0.05)，與患者腫瘤最大徑、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和TNM分期有關(guān)(P<0.05)，見表1。

表1 LncRNA FTH1P3蛋白在胃癌組織中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

2.3LncRNA FTH1P3表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系 Log-rank檢驗(yàn)顯示，與低表達(dá)LncRNA FTH1P3的胃癌患者相比，高表達(dá)LncRNA FTH1P3的胃癌患者預(yù)后較差(χ2=4.811，P=0.028)，見圖2。

圖2 Log-Rank檢驗(yàn)分析LncRNA FTH1P3表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.4LncRNA FTH1P3 siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞效果 LncRNA FTH1P3在si-LncRNA FTH1P3-1組(0.40±0.07)、si-LncRNA FTH1P3-2組(0.47±0.08)MGC-803細(xì)胞中的表達(dá)均低于在si-NC組MGC-803細(xì)胞中的表達(dá)(1.00±0.06)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.081，P<0.05；t=9.731，P<0.05)，見圖3。

注：與si-NC組相比，*P<0.05。

2.5細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 與si-NC組相比，si-LncRNA FTH1P3-1組和si-LncRNA FTH1P3-2組胃癌細(xì)胞MGC-803的增殖能力均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

注：與si-NC組相比，*P<0.05。

2.6細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 與si-NC組[遷移細(xì)胞數(shù)目(52.33±7.53)個(gè)]相比，si-LncRNA FTH1P3-1組[遷移細(xì)胞數(shù)目(19.67±4.28)個(gè)]和si-LncRNA FTH1P3-2組[遷移細(xì)胞數(shù)目(33.67±5.81)個(gè)]胃癌細(xì)胞MGC-803的遷移能力均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.531，P<0.05；t=3.398，P<0.05)，見圖5。

2.7細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力檢測(cè) 與si-NC組相比，si-LncRNA FTH1P3-1組和si-LncRNA FTH1P3-2組胃癌細(xì)胞MGC-803的體內(nèi)成瘤體積均減小(P<0.05)，見圖6A。與si-NC組相比，si-LncRNA FTH1P3-1組和si-LncRNA FTH1P3-2組胃癌細(xì)胞MGC-803的體內(nèi)成瘤體質(zhì)量均減少(P<0.05)，見圖6B。

注：A為3組成瘤體積的對(duì)比；B為3組成瘤體質(zhì)量的對(duì)比；與si-NC組相比，*P<0.05。

2.8PI3K/AKT信號(hào)通路檢測(cè) 與si-NC組相比，si-LncRNA FTH1P3-1組和si-LncRNA FTH1P3-2組胃癌細(xì)胞MGC-803中PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白pPI3K和pAKT的表達(dá)減少(P<0.05)，PI3K和AKT蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖7。

圖7 PI3K/AKT信號(hào)通路檢測(cè)

3 討 論

LncRNA 被定義為大于200個(gè)核苷酸且不能被翻譯成蛋白質(zhì)的RNA轉(zhuǎn)錄本，其作為參與正常發(fā)育和腫瘤發(fā)生的重要分子而受到廣泛關(guān)注。越來(lái)越多的研究表明，LncRNA在細(xì)胞增殖、分化、遷移、細(xì)胞周期和凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[3]。胃癌中異常表達(dá)的LncRNA有希望成為腫瘤生物標(biāo)志物和抗腫瘤治療的分子靶點(diǎn)[9]。目前盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量 LncRNA，但 LncRNA 在胃癌進(jìn)展中的潛在功能仍需要進(jìn)一步研究。FTH1P3 屬于LncRNA，是鐵蛋白重鏈(FHC)基因家族的成員之一。LncRNA FTH1P3在不同的人類細(xì)胞系和組織中廣泛表達(dá)，并在細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用[10]。LncRNA FTH1P3在腫瘤中的作用也逐漸被重視，具有成為腫瘤治療潛在分子靶點(diǎn)的潛力[4-8]。

YUAN等[11]報(bào)道LncRNA FTH1P3在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)比在非腫瘤組織中的表達(dá)增加，并且LncRNA FTH1P3高表達(dá)與患者分化差、T分期高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性、臨床分期高呈正相關(guān)，高表達(dá)的LncRNA FTH1P3 預(yù)示著喉鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后不良。LncRNA微陣列分析顯示LncRNA FTH1P3在吉非替尼耐藥非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，LncRNA FTH1P3高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[6]。在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)的LncRNA FTH1P3與腫瘤T分期、N分期、TNM分期和不良預(yù)后有關(guān)，Cox回歸分析顯示LncRNA FTH1P3表達(dá)是口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的獨(dú)立預(yù)后預(yù)測(cè)因素[7]。而LncRNA FTH1P3在胃癌中的表達(dá)情況未知，本研究發(fā)現(xiàn)與鄰近正常組織相比，LncRNA FTH1P3在胃癌組織中的表達(dá)上調(diào)，統(tǒng)計(jì)分析顯示LncRNA FTH1P3的表達(dá)與胃癌患者腫瘤最大徑、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和TNM分期有關(guān)，高表達(dá)LncRNA FTH1P3的胃癌患者預(yù)后較差，具有重要的臨床意義，與LncRNA FTH1P3在喉鱗狀細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌和口腔鱗狀細(xì)胞癌中的研究一致[6-7,11]。表明LncRNA FTH1P3是胃癌患者預(yù)后不良的生物分子標(biāo)志物，可能是促進(jìn)胃癌惡性進(jìn)展的驅(qū)動(dòng)分子。

同時(shí)LYU等[4]報(bào)道LncRNA FTH1P3在宮頸癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)顯著上調(diào)，干擾LncRNA FTH1P3的表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡，作用機(jī)制是通過(guò)靶向微小RNA(miR)-145發(fā)揮促癌因子的作用。以及LncRNA FTH1P3表達(dá)升高會(huì)促進(jìn)喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并抑制細(xì)胞凋亡[11]。LncRNA FTH1P3在體外促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，LncRNA FTH1P3的敲低抑制體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)[6]。本研究結(jié)果提示LncRNA FTH1P3與胃癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移相關(guān)，本研究中采用LncRNA FTH1P3 siRNA的兩個(gè)干擾序列轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞研究LncRNA FTH1P3的生物學(xué)功能，結(jié)果兩個(gè)干擾序列均顯示，抑制LncRNA FTH1P3的表達(dá)后，胃癌細(xì)胞體外增殖和遷移能力降低，體內(nèi)成瘤能力降低，表明LncRNA FTH1P3促進(jìn)胃癌的惡性進(jìn)展。

但是LncRNA FTH1P3在胃癌中發(fā)揮促癌作用的機(jī)制仍需進(jìn)一步探討，有文獻(xiàn)報(bào)道，在非小細(xì)胞肺癌中LncRNA FTH1P3可以通過(guò)招募賴氨酸特異性脫甲基酶1(LSD1)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[6]。LncRNA FTH1P3通過(guò)調(diào)節(jié)口腔鱗狀細(xì)胞癌和葡萄膜黑色素瘤中的miR-224-5p增強(qiáng)細(xì)胞增殖和侵襲能力[12-13]。在口腔鱗狀細(xì)胞癌和食管鱗狀細(xì)胞癌中分別通過(guò)調(diào)控SP1/NF-κB、PI3K/AKT/GSK3β/Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮促癌作用，表明LncRNA FTH1P3在不同惡性腫瘤中發(fā)揮促癌因子的作用機(jī)制不同[7-8]。PI3K/AKT信號(hào)通路在胃癌中常處于激活狀態(tài)，在胃癌的惡性進(jìn)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用，在腫瘤信號(hào)的刺激作用下，PI3K蛋白發(fā)生磷酸化，pPI3K增多促使下游蛋白AKT蛋白的磷酸化，pAKT蛋白上調(diào)下游靶基因蛋白的表達(dá)促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[14-15]。本研究Western blot結(jié)果顯示，LncRNA FTH1P3兩個(gè)干擾序列均抑制胃癌細(xì)胞中pPI3K和pAKT蛋白的表達(dá)，表明LncRNA FTH1P3可能是通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和遷移。

綜上所述，LncRNA FTH1P3在胃癌中高表達(dá)，與患者不良病理參數(shù)和預(yù)后有關(guān)。干擾LncRNA FTH1P3的表達(dá)會(huì)抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮作用。本研究對(duì)理解LncRNA FTH1P3在胃癌中的重要作用邁出了重要一步，并提供了LncRNA FTH1P3在胃癌惡性進(jìn)展中的作用的新見解。