乙型肝炎肝硬化失代償期并發(fā)自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎患者臨床分離菌的分布特點及耐藥情況分析*

張 旺,王國充,張 甜,李伯安△

1.中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心檢驗科，北京100039；2.河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，河北張家口 075132

世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示，截至2015年，全球約有2.57億人感染乙型肝炎病毒(HBV)[1]，目前我國慢性乙型肝炎(CHB)患者有20 000 000～30 000 000例[2]。自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎(SBP)為乙型肝炎肝硬化失代償期常見的嚴(yán)重并發(fā)癥[3-4]，能導(dǎo)致患者發(fā)生膿毒癥休克、肝性腦病、肝腎綜合征等。若患者未得到有效治療，病死率達(dá)20%～30%[5]，廣譜抗菌藥物對乙型肝炎肝硬化失代償期腹腔感染有一定的效果，但由于近年來抗菌藥物的濫用，細(xì)菌耐藥性明顯增強，抗菌效果不理想。因此，了解乙型肝炎肝硬化失代償期腹腔感染患者病原菌的分布情況并及時使用針對性抗菌藥物十分關(guān)鍵。本研究分析了乙型肝炎肝硬化失代償期腹腔感染患者腹水培養(yǎng)臨床分離菌的流行病學(xué)特點，并進(jìn)行藥敏分析，進(jìn)一步闡述細(xì)菌的耐藥性特點，為臨床合理使用抗菌藥物提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月至2021年12月中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心收治的腹腔積液培養(yǎng)陽性乙型肝炎肝硬化失代償期并發(fā)SBP患者187例為研究對象，其中男150例，女37例；年齡 31～87歲，平均(56.35±11.39)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)乙型肝炎肝硬化失代償期患者診斷均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[6]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)SBP患者診斷均符合《肝硬化腹水及相關(guān)并發(fā)癥的診療指南》[7]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除腫瘤性腹腔積液或者繼發(fā)性腹膜炎患者。

1.2儀器與試劑 法國梅里埃BacT/ALERT 3D120全自動血培養(yǎng)儀，德國布魯克MALDI-TOF-MS基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜儀，法國梅里埃 VITEK 2 Compact 全自動細(xì)菌鑒定和藥敏分析系統(tǒng)，英國Oxoid Limited藥敏試驗紙片，賽默飛世爾生物公司生產(chǎn)的玫紅酸中國藍(lán)乳糖瓊脂平板、哥倫比亞血平板、念珠菌顯色平板、Mueller-Hinton(MH)平板等。

1.3方法 對入組研究對象行腹腔穿刺，分別抽取10 mL腹腔積液置于需氧和厭氧血培養(yǎng)瓶中，所有入組患者均采集雙瓶送檢，患者采集腹腔積液前均未使用任何抗菌藥物。所有操作嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進(jìn)行。本研究采取回顧性分析方法，不存在為試驗?zāi)康膶θ虢M患者行任何侵入性操作，已通過倫理審批，獲得受試者知情同意。

1.4細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏試驗 腹腔積液采用梅里埃BacT/ALERT 3D120全自動血培養(yǎng)儀進(jìn)行增菌培養(yǎng)，陽性培養(yǎng)液選用玫紅酸中國藍(lán)乳糖瓊脂平板、哥倫比亞血平板或念珠菌顯色平板轉(zhuǎn)種獲取純菌落，使用布魯克MALDI-TOF-MS基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜儀進(jìn)行菌種分析鑒定[8]。使用梅里埃 VITEK 2 Compact 全自動細(xì)菌鑒定和藥敏分析系統(tǒng)對培養(yǎng)所得的陽性菌株進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)合紙片擴(kuò)散法和E-test最小抑菌濃度(MIC)法進(jìn)行補充藥敏試驗，藥敏培養(yǎng)基選擇MH平板，配套使用相關(guān)藥敏試驗紙片，藥敏執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)參照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)M100 ED30[9]。質(zhì)控菌株：陰溝腸桿菌ATCC700323、肺炎克雷伯菌ATCC700603、大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、糞腸球菌ATCC29212。

1.5觀察指標(biāo) (1)分析腹腔積液培養(yǎng)陽性乙型肝炎肝硬化失代償期并發(fā)SBP患者臨床分離菌分布情況；(2)分析主要臨床分離菌對抗菌藥物的耐藥性。

2 結(jié) 果

2.1菌株分布特點 187例腹腔積液培養(yǎng)陽性乙型肝炎肝硬化失代償期并發(fā)SBP患者送檢的腹腔積液標(biāo)本共檢測出220株臨床分離菌，其中分離出單一菌患者159例，分離出兩種菌患者23例，分離出3種菌患者5例。革蘭陽性需氧及兼性厭氧球菌120株(占54.54%)，革蘭陽性需氧及兼性厭氧桿菌21株(占9.54%)，革蘭陰性需氧及兼性厭氧桿菌72株(占32.73%)，厭氧菌1株(占0.46%)，真菌6株(占2.73%)。主要臨床分離菌包括凝固酶陰性葡萄球菌(CoNS)73株，腸桿菌科細(xì)菌58株，分別占33.18%和26.36%。220株臨床分離菌菌種分布及在陽性瓶中的檢出情況見表1。

表1 220株臨床分離菌菌種分布及在陽性瓶中的檢出情況

2.2主要臨床分離菌對抗菌藥物的耐藥性

2.2.1革蘭陽性需氧及兼性厭氧球菌

2.2.1.1葡萄球菌屬細(xì)菌 187例腹腔積液培養(yǎng)陽性乙型肝炎肝硬化失代償期并發(fā)SBP患者檢測出葡萄球菌屬細(xì)菌共78株，包括5株凝固酶陽性葡萄球菌(均為金黃色葡萄球菌)和73株CoNS，其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)2株，耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(MRCoNS)58株。葡萄球菌屬對青霉素的耐藥率超過90.00%，CoNS對紅霉素的耐藥率為65.75%，對左氧氟沙星、克林霉素、復(fù)方磺胺甲噁唑和環(huán)丙沙星的耐藥率均大于30.00%。未檢測出對喹奴普汀/達(dá)福普汀、替加環(huán)素、利奈唑胺和萬古霉素耐藥菌株。主要葡萄球菌屬細(xì)菌對臨床常用抗菌藥物的耐藥性分布見表2。

表2 主要葡萄球菌屬細(xì)菌對臨床常用抗菌藥物的耐藥性分布

2.2.1.2腸球菌屬細(xì)菌 187例腹腔積液培養(yǎng)陽性乙型肝炎肝硬化失代償期并發(fā)SBP患者檢測出腸球菌屬細(xì)菌共16株，包括15株屎腸球菌和1株糞腸球菌。15株屎腸球菌對青霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和紅霉素有很高的耐藥率，耐藥率達(dá)80.00%及以上，對高水平慶大霉素協(xié)同、高水平鏈霉素協(xié)同、四環(huán)素有較高的耐藥率，耐藥率均在50.00%左右。僅檢出1株對萬古霉素耐藥屎腸球菌和1株對喹奴普汀/達(dá)福普汀耐藥屎腸球菌，未檢出對替加環(huán)素和利奈唑胺耐藥菌株。主要腸球菌屬細(xì)菌對臨床常用抗菌藥物的耐藥性分布見表3。

表3 主要腸球菌屬細(xì)菌對臨床常用抗菌藥物的耐藥性分布

2.2.2革蘭陰性需氧及兼性厭氧桿菌

2.2.2.1腸桿菌科細(xì)菌 187例腹腔積液培養(yǎng)陽性乙型肝炎肝硬化失代償期并發(fā)SBP患者檢測出腸桿菌科細(xì)菌共58株，包括31株大腸埃希菌，13株肺炎克雷伯菌，8株陰溝腸桿菌和6株其他腸桿菌科細(xì)菌，其中產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)腸桿菌共20株，占分離腸桿菌的34.48%。31株大腸埃希菌對氨芐西林的耐藥率很高，達(dá)74.19%，對其他青霉素類，第一、二、三代頭孢菌素，喹諾酮類，磺胺類和氨曲南藥物有較高的耐藥率，耐藥率均超過30.00%，而對哌拉西林/他唑巴坦復(fù)合制劑，第四代及半合成廣譜第二、三代頭孢菌素(如頭孢替坦和頭孢他啶)，碳青霉烯類，氨基糖苷類藥物的耐藥率較低，耐藥率均低于20.00%。13株肺炎克雷伯菌對哌拉西林表現(xiàn)出較高的耐藥率，達(dá)61.54%，對其他常用抗菌藥物的耐藥率都較低。8株陰溝腸桿菌對第一、二代頭孢菌素有很高的耐藥率，達(dá)75.00%及以上，對哌拉西林，第三、四代頭孢菌素和氨曲南有較高的耐藥率，均超過30.00%。主要腸桿菌科細(xì)菌對臨床常用抗菌藥物的耐藥性分布見表4。

表4 主要腸桿菌科細(xì)菌對臨床常用抗菌藥物的耐藥性分布

2.2.2.2非發(fā)酵菌 187例腹腔積液培養(yǎng)陽性乙型肝炎肝硬化失代償期并發(fā)SBP患者檢測出非發(fā)酵菌共11株，包括4株鮑曼不動桿菌和7株其他非發(fā)酵菌。4株鮑曼不動桿菌均表現(xiàn)出多重耐藥性，除2株對復(fù)方磺胺甲噁唑敏感，1株對妥布霉素敏感外，其余對臨床常用抗菌藥物均耐藥。主要非發(fā)酵菌(鮑曼不動桿菌)對臨床常用抗菌藥物的耐藥性見表5。

表5 主要非發(fā)酵菌(鮑曼不動桿菌)對臨床常用抗菌藥物的耐藥性

3 討 論

乙型肝炎病毒相關(guān)慢性肝病患者普遍存在能量代謝異常，SBP發(fā)生風(fēng)險較高[10]，SBP是乙型肝炎肝硬化失代償期患者死亡的重要原因[11-12]。腹腔積液培養(yǎng)為SBP患者的明確診斷和合理治療提供了金標(biāo)準(zhǔn)，而準(zhǔn)確甄別腹腔積液培養(yǎng)陽性結(jié)果中的臨床致病菌和可疑污染菌也是臨床工作的關(guān)鍵和難點。腹腔穿刺過程中由皮膚定植菌引起的污染是造成腹腔積液培養(yǎng)假陽性的主要因素之一[13]。本研究中，共分離出11株棒桿菌屬細(xì)菌和5株芽孢桿菌屬細(xì)菌，陽性報警時間均>48 h，68.75%(11/16)為單瓶報陽，初步推斷，以芽孢桿菌屬和棒桿菌屬為主的革蘭陽性需氧及兼性厭氧桿菌，很可能是造成乙型肝炎肝硬化失代償期患者腹腔積液培養(yǎng)假陽性的主要菌群；CoNS方面，54.79%(40/73)為雙瓶報陽，76.71%(56/73)陽性報警時間<48 h，當(dāng)培養(yǎng)出該類細(xì)菌時，應(yīng)結(jié)合患者降鈣素原(PCT)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、腹水多核細(xì)胞數(shù)量、腹水蛋白等檢驗指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，或許能一定程度避免污染菌對臨床診斷的干擾；腸桿菌科方面，75.86%(44/58)為雙瓶報陽，98.28%(57/58)陽性報警時間<48 h，或可推斷分離到以腸桿菌科為主的革蘭陰性需氧及兼性厭氧桿菌對SBP患者的病原學(xué)確診意義更大。本研究入組的187例研究對象中，分離出單一菌的病例占85.03%(159/187)，說明乙型肝炎肝硬化失代償期合并SBP主要由單一致病菌感染引起，CoNS(占33.18%)和腸桿菌科細(xì)菌(占26.36%)是主要致病菌。

臨床可根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)及其藥敏試驗結(jié)果合理選用抗菌藥物治療，以提高其臨床療效。本研究結(jié)果顯示，主要革蘭陽性菌為CoNS，其中又以表皮葡萄球菌占比最大，90.00%以上的葡萄球菌屬和腸球菌屬細(xì)菌對青霉素耐藥；CoNS對甲氧西林和紅霉素耐藥率很高，分別為79.45%和65.75%；主要革蘭陽性菌對萬古霉素、喹奴普汀/達(dá)福普汀、替加環(huán)素和利奈唑胺的敏感性都很高。由此可知，對于革蘭陽性菌引起的感染，可采用萬古霉素、喹奴普汀/達(dá)福普汀、替加環(huán)素和利奈唑胺等治療，應(yīng)避免使用β-內(nèi)酰胺類(除外抗MRSA的頭孢菌素)、紅霉素類等抗菌藥物。主要革蘭陰性菌為腸桿菌科細(xì)菌，其中又以大腸埃希菌占比最大，有34.48%的腸桿菌科細(xì)菌為產(chǎn)ESBLs菌株；大腸埃希菌對氨芐西林的耐藥率很高，達(dá)74.19%；主要腸桿菌科細(xì)菌對哌拉西林/他唑巴坦復(fù)合制劑、碳青霉烯類、氨基糖苷類藥物的敏感性均較高。由此可知，對于由腸桿菌科細(xì)菌引起的感染，可采用哌拉西林/他唑巴坦復(fù)合制劑、碳青霉烯類、氨基糖苷類抗菌藥物治療，應(yīng)避免使用青霉素類抗菌藥物。

歐洲肝病學(xué)會和美國肝病學(xué)會指南[5,14]推薦一線抗菌藥物治療首選第三代頭孢菌素，替代方案包括阿莫西林/克拉維酸和環(huán)丙沙星或左氧氟沙星等喹諾酮類藥物。而在本研究中，大腸埃希菌對第三代頭孢菌素頭孢曲松的耐藥率達(dá)到了48.39%，CoNS、屎腸球菌和大腸埃希菌對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率均超過了30.00%，這無疑挑戰(zhàn)了喹諾酮類藥物在SBP抗感染經(jīng)驗性治療中的突出作用。大量使用喹諾酮類藥物進(jìn)行預(yù)防、侵入性操作及廣譜抗菌藥物的使用及重癥監(jiān)護(hù)病房住院標(biāo)準(zhǔn)的拓寬等因素，是引起SBP細(xì)菌學(xué)變化的重要原因[15]。有研究指出，針對院內(nèi)發(fā)生SBP的患者，給予碳青霉烯類抗菌藥物或替加環(huán)素是最有效的選擇，這與本研究結(jié)果較為一致[16]。一項來自于歐洲的研究表明，在肝硬化失代償期，由多重耐藥(MDR)細(xì)菌引起的感染發(fā)病率逐漸升高[17]。在本研究中，分離出了包括葡萄球菌屬、腸球菌屬、腸桿菌科及非發(fā)酵菌等在內(nèi)的多株MDR細(xì)菌，臨床醫(yī)生應(yīng)該引起高度重視。

乙型肝炎肝硬化失代償期患者存在嚴(yán)重的免疫功能障礙，表現(xiàn)為明顯的免疫抑制和持續(xù)的促炎狀態(tài)，因此，該類患者的真菌感染風(fēng)險增加[18-20]。本研究中也分離到了6株真菌，并且均為雙瓶檢出，真菌在該類患者中的感染風(fēng)險應(yīng)該引起臨床的高度重視。當(dāng)常規(guī)使用抗菌藥物治療SBP患者而臨床癥狀沒有明顯改善時，應(yīng)在抗菌藥物方案中加入抗真菌藥物進(jìn)行治療。因此，充分認(rèn)識臨床分離株的流行病學(xué)特點和其耐藥性分布，是指導(dǎo)乙型肝炎肝硬化失代償期并發(fā)SBP患者經(jīng)驗性抗菌藥物治療的關(guān)鍵，建議及早進(jìn)行經(jīng)驗性廣譜抗菌藥物治療，直至培養(yǎng)結(jié)果能夠指導(dǎo)抗菌藥物的靶向使用。