CD4+/CD8+和自噬蛋白Beclin-1與子宮內(nèi)膜容受性改變和不孕發(fā)生相關(guān)性探究

鞏海鳳 俄洛吉（青海省人民醫(yī)院產(chǎn)科，西寧 810007）

不孕癥指夫妻正常性生活中未避孕，1年后仍未受孕［1］。研究顯示，我國不孕癥發(fā)病率達(dá)15%，且呈逐漸上升趨勢［2］。子宮內(nèi)膜容受性指子宮內(nèi)膜允許囊胚吸附、入侵并改變其間質(zhì)，使胚胎著床［3］。子宮內(nèi)膜容受性改變是不孕癥的發(fā)病機(jī)制，并影響其治療效果，免疫性不孕為常見不孕癥類型，體內(nèi)有關(guān)抗體異常增加、促炎因子水平上升而加重生殖系統(tǒng)損傷，導(dǎo)致不孕癥發(fā)生［4］。子宮內(nèi)膜可維持女性正常月經(jīng)與生育功能，其容受性為在一段時(shí)間內(nèi)子宮內(nèi)膜接受囊胚與胚胎著床的能力［5］。子宮內(nèi)膜容受性異?？蓪?dǎo)致機(jī)體受孕率降低，是影響不孕癥發(fā)生的主要因素。如何診斷、評估不孕是目前臨床研究重點(diǎn)。CD4+、CD8+是T細(xì)胞亞群指標(biāo)，可調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能，是反映免疫功能的有效指標(biāo)。免疫細(xì)胞水平和子宮內(nèi)膜容受性異常是不孕癥發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素，臨床上兩者的關(guān)系尚無明確結(jié)論［6］。另外，自噬是機(jī)體對壓力的反應(yīng)，自噬相關(guān)蛋白Beclin-1在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但其與不孕癥關(guān)系的報(bào)道較少［7］。本研究通過檢測不孕癥患者外周血細(xì)胞與自噬蛋白Beclin-1表達(dá)，探究其與子宮內(nèi)膜容受性的相關(guān)性，為不孕癥臨床評估與診治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象選取2019年2月至2021年4月青海省人民醫(yī)院收治的137例不孕癥患者作為研究對象，年齡26～38歲，平均年齡（30.64±3.48）歲；平均體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為（22.19±2.36）kg/m2；不孕時(shí)間為1～5年，平均（3.81±1.13）年。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《不明原因不孕癥診斷與治療中國專家共識》標(biāo)準(zhǔn)［8］，且經(jīng)影像學(xué)與血清檢查確診為不孕；②育齡女性；③臨床資料完整，患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①因男方原因?qū)е虏辉姓?；②合并惡性腫瘤患者；③子宮畸形患者；④生殖器類疾病患者；⑤輸卵管造影異?；颊?；⑥精神系統(tǒng)疾病患者。另選60例健康女性作為對照，納入標(biāo)準(zhǔn)：育齡期已生育，且無婦科疾病，年齡25～38歲，平均年齡（30.17±3.54）歲，平均BMI為（22.25±2.24）kg/m2。健康組與不孕組一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.1.2 主要試劑與儀器兔抗Beclin-1（ab62557，Abcam公司）；流式細(xì)胞儀（美國貝克曼公司，型號CytoFLEX）；高倍顯微鏡（Leica公司）；陰道彩色多普勒超聲診斷儀（GE公司，型號Voluson E8）。

1.2 方法

1.2.1 外周血細(xì)胞水平檢測抽取研究對象外周靜脈血置于抗凝管，離心，分離血細(xì)胞與血漿，流式細(xì)胞儀檢測CD4+、CD8+含量，計(jì)算CD4+/CD8+。

1.2.2 免疫組化染色石蠟包埋、切片，烘烤，脫蠟水化，修復(fù)抗原，加入過氧化氫阻斷過氧化物酶活性，磷酸緩沖液沖洗3次，室溫下采用血清封閉，加入兔抗Beclin-1 4℃孵育過夜，洗滌，加入二抗，室溫孵育、洗滌，加入鏈霉親和素室溫放置30 min，洗滌3次，逐步滴加聯(lián)苯胺染色液，觀察免疫標(biāo)記，洗滌，蘇木精復(fù)染，脫水，密封，高倍顯微鏡下觀察［9］。切片經(jīng)兩位病理科醫(yī)師雙盲法審片，高倍視野下選取5個視野，計(jì)100個細(xì)胞，觀察顯色程度以評估陽性細(xì)胞比例與染色強(qiáng)度。陽性細(xì)胞計(jì)分：陽性細(xì)胞數(shù)占比不超過10%記為1分，陽性細(xì)胞數(shù)占比11%～50%記為2分；陽性細(xì)胞數(shù)占比51%～75%記為3分；陽性細(xì)胞數(shù)占比超過75%記為4分。染色強(qiáng)度：未染色記為0分；淡黃色記為1分；黃色記為2分；深黃色或褐色記為3分?？偡譃閮烧哂?jì)分乘積，總分超過3分表示陽性，反之為陰性［10］。

1.2.3 子宮內(nèi)膜容受性檢測陰道彩色多普勒超聲診斷儀檢測血流阻力指數(shù)、搏動指數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度與容積［11］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS20.0軟件分析數(shù)據(jù)，免疫細(xì)胞水平、子宮內(nèi)膜容受性指標(biāo)以±s表示，行t檢驗(yàn)；Beclin-1陽性率以百分比（%）表示，行χ2檢驗(yàn)；Spearman相關(guān)性分析探討CD4+/CD8+和Beclin-1陽性表達(dá)與子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健康組與不孕組免疫細(xì)胞水平比較不孕組CD4+水平、CD4+/CD8+高于健康組，CD8+水平低于健康組（P＜0.05，表1）。

2.2 健康組與不孕組Beclin-1陽性表達(dá)比較健康組Beclin-1陽性表達(dá)58例，不孕組陽性表達(dá)101例（圖1），不孕組陽性率（73.72%）低于健康組（96.67%，P＜0.05，表2）。

2.3 健康組與不孕組子宮內(nèi)膜容受性指標(biāo)比較不孕組血流阻力指數(shù)、搏動指數(shù)高于健康組，子宮內(nèi)膜厚度與容積低于健康組（P＜0.05，表3）。

表1 健康組與不孕組免疫細(xì)胞水平比較（±s）Tab.1 Comparison of immune cell levels between healthy group and infertility group（±s）

表1 健康組與不孕組免疫細(xì)胞水平比較（±s）Tab.1 Comparison of immune cell levels between healthy group and infertility group（±s）

Groups Health Infertility t P n 60 137 CD4+（%）33.86±4.61 36.98±5.39 3.901＜0.001 CD8+（%）31.59±5.94 27.34±5.46 4.894＜0.001 CD4+/CD8+1.05±0.35 1.37±0.42 5.166＜0.001

圖1 免疫組化染色檢測Beclin-1表達(dá)（×400）Fig.1 Beclin-1 expression detected by immunohistochemical staining（×400）

表2 健康組與不孕組Beclin-1陽性表達(dá)比較［例（%）］Tab.2 Comparison of Beclin-1 positive expression between healthy group and infertility group［n（%）］

表3 健康組與不孕組子宮內(nèi)膜容受性指標(biāo)比較（±s）Tab.3 Comparison of endometrial receptivity indexes between healthy group and infertility group（±s）

表3 健康組與不孕組子宮內(nèi)膜容受性指標(biāo)比較（±s）Tab.3 Comparison of endometrial receptivity indexes between healthy group and infertility group（±s）

Groups Health Infertility t P n 60 137 Blood flow resistance index/（m·s-1）1.48±0.63 2.18±0.59 7.506＜0.001 Pulsatility index/（m·s-1）0.54±0.03 0.78±0.09 20.146＜0.001 Endometrial thickness/mm 9.86±1.29 7.53±1.51 10.402＜0.001 Endometrial volume/ml 3.98±0.76 3.01±0.62 9.416＜0.001

表4 相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis

2.4 不孕組CD4+/CD8+、Beclin-1與子宮內(nèi)膜容受性指標(biāo)相關(guān)性分析Spearman相關(guān)性分析顯示，CD4+/CD8+與血流阻力指數(shù)、搏動指數(shù)呈正相關(guān)，與子宮內(nèi)膜厚度與容積呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；Beclin-1陽性表達(dá)與血流阻力指數(shù)、搏動指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，與子宮內(nèi)膜厚度與容積呈正相關(guān)（P＜0.05，表4）。

3 討論

不孕癥是夫妻雙方同居超過1年且不采取避孕措施也未能生育［12］。研究顯示，我國目前不孕率達(dá)15%，且逐漸上升［13］。多囊卵巢綜合征等婦科疾病可導(dǎo)致女性不孕。子宮內(nèi)膜容受性為子宮內(nèi)膜對胚胎的接受度，可反映子宮內(nèi)膜形態(tài)與功能變化，臨床常從子宮內(nèi)膜形態(tài)、厚度與血管等指標(biāo)評估其容受性，進(jìn)而評估子宮環(huán)境與機(jī)體受孕能力［14-15］。本研究中不孕癥患者血流阻力指數(shù)與搏動指數(shù)高于健康組，子宮內(nèi)膜厚度與容積低于健康組，提示不孕癥患者子宮內(nèi)膜容受性低于健康女性。

免疫性不孕為抗卵巢抗體陽性等因素導(dǎo)致，免疫細(xì)胞在不孕中發(fā)揮重要作用［16］。機(jī)體正常下，T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞亞群水平處于平衡狀態(tài)，當(dāng)受到外界刺激，CD4+可調(diào)節(jié)抗體產(chǎn)生，參與免疫應(yīng)答過程，且CD8+T細(xì)胞可與CD4+產(chǎn)生拮抗，防止B細(xì)胞異?；罨瑑煞N細(xì)胞比例紊亂代表機(jī)體免疫功能異常［17-18］。本研究顯示，不孕組CD4+水平、CD4+/CD8+高于健康組，CD8+水平低于對照組，與梁楊煥等［19］結(jié)論相似，說明外周血CD4+/CD8+異常上升、CD8+水平下降可能與不孕發(fā)生有關(guān)，該過程對自身抗體、促炎因子等表達(dá)上調(diào)具有促進(jìn)作用，進(jìn)而引發(fā)不孕［20］。Th1、Th2細(xì)胞由CD4+分化而成，在細(xì)胞與體液免疫中發(fā)揮重要作用，CD4+平衡被證實(shí)參與輸卵管炎癥性不孕癥發(fā)生機(jī)制。

自噬為真核細(xì)胞常見自噬形式，以形成雙膜囊泡自噬體為主要特征，可吞沒自體細(xì)胞成分，降解入組織后被重新利用，該過程也稱Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡［21］。自噬為細(xì)胞動態(tài)平衡過程，于心血管疾病、癌癥、衰老中發(fā)揮重要作用。自噬相關(guān)蛋白可調(diào)控自噬體形成與成熟，Beclin-1為重要自噬因子。Beclin-1的編碼基因位于染色體，其分子量為60 kD，與酵母自噬基因細(xì)胞同源，可介導(dǎo)自噬起始，作為啟動自噬標(biāo)志物。Beclin-1可介導(dǎo)自噬體成核，機(jī)體若無Beclin-1，其自噬通量被阻斷，且異常Beclin-1結(jié)構(gòu)可使自噬體畸形。Beclin-1為單倍型較少腫瘤抑制因子，足量Beclin-1是啟動自噬的重要部分［23］。子宮內(nèi)膜異位癥血清、腹膜液中Beclin-1 mRNA表達(dá)比正常人群低。本研究中Beclin-1多數(shù)位于細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)，不孕組Beclin-1陽性率低于健康組，與丁瑩等［22］結(jié)論相符。Beclin-1介導(dǎo)子宮內(nèi)膜異位癥的機(jī)制可能為：①Beclin-1表達(dá)下調(diào)、基因突變或缺失，其介導(dǎo)的細(xì)胞自噬行為減少，進(jìn)而減少自噬依賴性蛋白、細(xì)胞器降解與自噬體形成，異位內(nèi)膜細(xì)胞可躲避自噬，于子宮內(nèi)膜外生長而引發(fā)不孕；②Beclin-1表達(dá)減少后，成熟自噬體也相對減少，影響細(xì)胞凋亡，患者細(xì)胞凋亡減少可能導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥；③Beclin-1減少與失活對Bcl-2家族部分基因調(diào)控失控，降低細(xì)胞自噬力與程序性細(xì)胞死亡，進(jìn)而使異位子宮內(nèi)膜生存。不孕組血流阻力指數(shù)、搏動指數(shù)高于健康組，其子宮內(nèi)膜厚度與容積低于健康組，說明不孕患者子宮內(nèi)膜容受性比正常女性差。相關(guān)性分析顯示，CD4+/CD8+與血流阻力指數(shù)、搏動指數(shù)呈正相關(guān)，與子宮內(nèi)膜厚度與容積呈負(fù)相關(guān)；Beclin-1陽性表達(dá)與其相反，提示CD4+/CD8+、Beclin-1水平與子宮內(nèi)膜容受性變化有一定關(guān)聯(lián)［24］。當(dāng)發(fā)生子宮內(nèi)膜炎、子宮內(nèi)膜異位等情況，T細(xì)胞參與激活自身免疫系統(tǒng)，細(xì)胞自噬行為減少，可影響受精而降低子宮內(nèi)膜容受性，進(jìn)而對胚胎著床率有一定影響。

綜上，不孕癥女性外周血CD4+/CD8+上升，自噬蛋白Beclin-1陽性表達(dá)下降，與機(jī)體子宮內(nèi)膜容受性變化和不孕癥發(fā)生有一定關(guān)聯(lián)。本研究僅從各指標(biāo)水平方面分析CD4+/CD8+和自噬蛋白Beclin-1與子宮內(nèi)膜容受性的關(guān)系，具體機(jī)制需進(jìn)一步探究。