中國(guó)荷斯坦牛PIK3CB基因多態(tài)性及其與繁殖和產(chǎn)奶性狀的關(guān)聯(lián)分析

2022-09-22 05:17:12徐昊祺許靜漪胡麗蓉羅漢鵬張海亮劉巧香王雅春

中國(guó)畜牧獸醫(yī) 2022年9期

徐昊祺，許靜漪，胡麗蓉，張帆，羅漢鵬，張海亮，師睿，李想，劉林，劉巧香，郭剛，王雅春

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物遺傳育種與繁殖(家畜)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，畜禽育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.北京奶牛中心，北京 100192；3.北京生物種業(yè)創(chuàng)新聯(lián)合體，北京 101206；4.北京首農(nóng)畜牧發(fā)展有限公司，北京 100029)

長(zhǎng)期以來(lái)，育種者對(duì)奶牛的產(chǎn)奶性能進(jìn)行了高強(qiáng)度的選育，其遺傳進(jìn)展取得了一定程度的改善[1]。然而，由于產(chǎn)奶性狀與繁殖性狀之間存在的不利遺傳相關(guān)，產(chǎn)奶性狀的高強(qiáng)度選擇造成了繁殖、健康、長(zhǎng)壽等功能性狀的衰退，嚴(yán)重影響了奶牛養(yǎng)殖的效益[2]。由于繁殖性狀的遺傳力較低，常規(guī)選育進(jìn)展速度較慢；針對(duì)繁殖性狀進(jìn)行相關(guān)研究，篩選候選基因和分子標(biāo)記，采用分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇對(duì)繁殖性狀的遺傳改良具有重要意義。師睿等[3]前期對(duì)中國(guó)荷斯坦牛繁殖性狀進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，獲得了包含磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亞單位β(PIK3CB)在內(nèi)的多個(gè)候選基因。隨后，采用蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)PIK3CB基因與多個(gè)候選基因存在互作關(guān)系，表明PIK3CB基因可能是影響中國(guó)荷斯坦牛繁殖性狀的重要基因(未發(fā)表)。PIK3CB基因可以編碼磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中磷脂酰肌醇3-激酶的p110催化亞單位PI3Kp110β[4]，PI3K/Akt通路廣泛存在細(xì)胞中，對(duì)細(xì)胞周期、凋亡、糖代謝及其他重要生理過(guò)程產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用[5]。

研究表明，PI3K/Akt通路可調(diào)節(jié)奶牛等哺乳動(dòng)物顆粒細(xì)胞的凋亡進(jìn)程，參與卵泡發(fā)育和排卵，以調(diào)控卵巢活動(dòng)周期[6-7]。畜禽生殖器官的細(xì)胞凋亡與繁殖性能存在關(guān)系，在雌性動(dòng)物卵巢中，卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞的凋亡會(huì)使卵泡閉鎖，從而影響卵巢發(fā)育[8-9]。排卵后殘留的顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞形成黃體，黃體的正常退化是啟動(dòng)下一個(gè)發(fā)情周期和卵泡發(fā)育的重要條件，黃體的溶解也同樣與細(xì)胞凋亡有密切聯(lián)系[10]。輸卵管上皮細(xì)胞和子宮內(nèi)膜細(xì)胞的周期性生長(zhǎng)、分化、退化和再生與生殖周期有密切聯(lián)系；在不同繁殖力的母羊生殖器官中，細(xì)胞凋亡情況和細(xì)胞凋亡基因Bad的表達(dá)存在顯著差異，Bad基因編碼PI3K/Akt通路下游Bcl-2家族中的促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白，受上游PIK3CB基因表達(dá)的調(diào)控[11]。馬鴻程等[12]發(fā)現(xiàn)，在牦牛不同大小級(jí)別卵泡壁顆粒細(xì)胞及卵母細(xì)胞中均有PIK3CB基因表達(dá)，其參與了PI3K/Akt介導(dǎo)的卵泡發(fā)育調(diào)控。上述研究表明PIK3CB基因可能在動(dòng)物繁殖生理中扮演著重要角色。此外，PI3K/Akt通路通過(guò)調(diào)控葡萄糖攝取和脂質(zhì)合成，參與奶牛乳腺上皮細(xì)胞的功能分化和乳汁合成的代謝途徑[13]。葡萄糖是泌乳奶牛合成乳糖的前體物質(zhì)，與乳脂、乳蛋白的合成密切相關(guān)，對(duì)泌乳奶牛具有重要的營(yíng)養(yǎng)生理功能[14]。同時(shí)，乳糖可以維持牛奶的滲透壓，其合成速率是產(chǎn)奶量的主要控制因素[15]。在敲除PIK3CB基因的小鼠肝臟中，p110β的缺失會(huì)影響胰島素敏感性和葡萄糖穩(wěn)態(tài)[16]。PI3K/Akt通路上游PIK3CB基因參與表達(dá)的PI3K蛋白受胰島素受體激活后催化4，5-二磷酸脂酰肌醇(PIP2)生成第二信使PIP3，可以調(diào)控糖原合成、抑制糖異生，降低血糖[17]，從而影響奶牛的產(chǎn)奶性能。

綜上，PIK3CB基因可能與中國(guó)荷斯坦牛繁殖和產(chǎn)奶性狀有關(guān)，但在荷斯坦牛中鮮見(jiàn)關(guān)于PIK3CB基因多態(tài)性與繁殖和產(chǎn)奶性狀的關(guān)聯(lián)分析。本研究擬通過(guò)篩查PIK3CB基因的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(SNP)，并與荷斯坦牛的5個(gè)繁殖性狀(初產(chǎn)日齡、初配日齡、產(chǎn)犢至首次配種間隔、青年牛首末次配種間隔、經(jīng)產(chǎn)牛首末次配種間隔)和6個(gè)產(chǎn)奶性狀(產(chǎn)奶量、乳蛋白量、乳蛋白率、乳脂量、乳脂率、體細(xì)胞評(píng)分)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以探究該基因與荷斯坦牛繁殖和產(chǎn)奶性狀的關(guān)系，獲得中國(guó)荷斯坦牛繁殖和產(chǎn)奶相關(guān)的遺傳標(biāo)記，為中國(guó)奶牛的標(biāo)記輔助選擇和基因組選擇提供有用信息。

1 材料與方法

1.1 DNA混池構(gòu)建

選取70頭無(wú)親緣關(guān)系或親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的中國(guó)荷斯坦牛公牛構(gòu)建DNA池，凍精樣品由北京奶牛中心提供。用高鹽法提取凍精樣品基因組DNA，使用NanoDrop 2000檢測(cè)濃度后將所有DNA稀釋到100 ng/μL，于-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 樣品采集和DNA提取

挑選北京地區(qū)8個(gè)牛場(chǎng)(金銀島、半截河、南三、渠頭、長(zhǎng)三、長(zhǎng)四、金星和中以)1 160頭健康的泌乳荷斯坦牛，采集血液樣品，每頭牛采集尾根靜脈血約10 mL，使用血液基因組DNA提取試劑盒(DP318，天根生化科技(北京)有限公司)從抗凝血樣提取基因組DNA，利用NanoDrop 2000測(cè)定樣品DNA濃度和純度，并通過(guò)2.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA片段完整性，―40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因多態(tài)性篩查

根據(jù)GenBank中牛PIK3CB基因的序列(登錄號(hào)：NC_037328.1)，采用Primer-BLAST設(shè)計(jì)引物，引物信息見(jiàn)表1。引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25 μL：DNA(100 ng/μL)1 μL，1×CataAmpTaqPlus PCR Mix(北京開拓賽思生物技術(shù)有限公司)22 μL，上、下游引物(10 μmol/μL)各1 μL。PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，退火(溫度見(jiàn)表1)30 s，72 ℃延伸10 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸1 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠檢測(cè)后，送至北京擎科生物科技有限公司測(cè)序，利用R語(yǔ)言對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行可視化，識(shí)別雙峰，并比對(duì)參考序列篩選SNP位點(diǎn)。

表1 引物信息

續(xù)表

1.4 基因分型

針對(duì)篩選出的SNP，根據(jù)其峰值比例、距離、所處區(qū)域及突變類型等確定了7個(gè)SNPs用于在1 160頭泌乳荷斯坦牛中進(jìn)行基因分型。采用競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR(KASP)技術(shù)進(jìn)行SNP分型，其檢測(cè)引物和通用引物見(jiàn)表2，KASP分型由中玉金標(biāo)記(北京)生物技術(shù)股份有限公司完成。

表2 多態(tài)位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR(KASP)分型引物信息

1.5 育種值估計(jì)

本研究收集了北京地區(qū)荷斯坦牛群(與基因分型個(gè)體屬于相同群體)的初產(chǎn)日齡(AFC)、初配日齡(AFS)、產(chǎn)犢至首次配種間隔(ICF)、青年牛首末次配種間隔(IFL_H)、經(jīng)產(chǎn)牛首末次配種間隔(IFL_C)5個(gè)繁殖性狀以及產(chǎn)奶量(MY)、乳蛋白量(PY)、乳蛋白率(PP)、乳脂量(FY)、乳脂率(FP)、體細(xì)胞評(píng)分(SCS)6個(gè)產(chǎn)奶性狀的估計(jì)育種值(EBV)作為表型，用于關(guān)聯(lián)分析。基于牛群的生產(chǎn)性能測(cè)定記錄和牧場(chǎng)管理記錄，進(jìn)行上述性狀的常規(guī)遺傳評(píng)估工作，進(jìn)而獲得上述性狀的估計(jì)育種值，繁殖和產(chǎn)奶性狀的遺傳評(píng)估模型參考Liu等[18]和任小麗等[19]的研究。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)7個(gè)SNPs進(jìn)行分型后，統(tǒng)計(jì)具有多態(tài)位點(diǎn)的基因型頻率、基因頻率、多態(tài)信息含量(PIC)、群體雜合度(He)和有效等位基因數(shù)(Ne)，并檢驗(yàn)各SNP基因型分布是否符合哈代-溫伯格平衡定律。使用Haploview 4.2軟件對(duì)PIK3CB基因SNP進(jìn)行連鎖不平衡分析，并構(gòu)建單倍型塊。

采用SAS 9.2軟件的GLM過(guò)程對(duì)5個(gè)繁殖性狀(AFC、AFS、ICF、IFL_H和IFL_C)和6個(gè)產(chǎn)奶性狀(MY、PY、PP、FY、FP和SCS)與PIK3CB基因的7個(gè)SNPs進(jìn)行基于單位點(diǎn)和單倍型組合的關(guān)聯(lián)分析，關(guān)聯(lián)分析模型為：

Y=μ+G+e

式中,Y,泌乳牛各繁殖或產(chǎn)奶性狀的EBV;μ,群體均值;G,基因型或單倍型固定效應(yīng);e,隨機(jī)殘差。采用Bonferronit檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。結(jié)果以最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 PIK3CB基因的SNP

根據(jù)雙峰篩查與序列比對(duì)，確定了17個(gè)位于1號(hào)染色體上的候選SNPs位點(diǎn)(表3)，均已被數(shù)據(jù)庫(kù)收錄，其中15個(gè)SNPs位于內(nèi)含子區(qū)域，2個(gè)SNPs位于外顯子區(qū)域。最終確定7個(gè)SNPs用于在泌乳牛群體中分型，其測(cè)序峰圖如圖3所示。由圖3可知，g.130430832 A>-位點(diǎn)可見(jiàn)由缺失導(dǎo)致的片段錯(cuò)位，其余SNP位點(diǎn)可見(jiàn)明顯套峰。

表3 PIK3CB基因候選SNPs信息

箭頭所示為SNPs位點(diǎn)

2.2 SNP的群體遺傳學(xué)分析

通過(guò)KASP分型技術(shù)，本研究在1 160頭泌乳荷斯坦牛中獲得了7個(gè)SNPs的基因型，部分結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看到3種基因型聚類明顯，說(shuō)明SNP分型結(jié)果可靠。

左上和右下區(qū)域點(diǎn)分別代表純合基因型；中間區(qū)域點(diǎn)代表雜合基因型；圓圈中點(diǎn)代表無(wú)明確分型的信號(hào)；左下區(qū)域點(diǎn)為空白對(duì)照

由表4可知，PIK3CB基因7個(gè)SNPs的MAF的范圍為0.12～0.44。位點(diǎn)g.130430832 A>-、g.130433743 A>G和g.130448069 G>A的PIC分別為0.21、0.23和0.22，為低度多態(tài)；其余SNP的PIC位于0.41～0.49之間，為中度多態(tài)。g.130448069 G>A位點(diǎn)處于哈代-溫伯格不平衡狀態(tài)(P<0.05),其余SNPs均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)(P>0.05)。7個(gè)SNPs的遺傳雜合度(He)較低，說(shuō)明其在測(cè)定群體中變異較小。g.130430832 A>-、g.130433743 A>G和g.130448069 G>A位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)(Ne)較小，等位基因在測(cè)驗(yàn)群體中分布較不均勻，其余SNPs均接近于2，說(shuō)明等位基因在測(cè)驗(yàn)群體中分布均勻。