基于網絡藥理學研究丹參-川芎抗腦缺血再灌注損傷作用機制及試驗驗證

付雪琴，蘭 瑞，鄒旭歡，王瑋瑋，王漫漫

(1.河南中醫(yī)藥大學，鄭州 450000;2.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，鄭州 450000)

腦卒中是一種復雜的多因素多基因疾病，是全球第二大死亡原因。缺血性腦卒中是最常見的形式，占腦卒中的87%[1]。缺血性腦卒中屬于中醫(yī)“中風”范疇，血瘀是中風的常見病理因素。氣血關系密不可分，王清任在《醫(yī)林改錯》中提到：“元氣既虛，必不能達于血管，血管無氣，必停留而瘀”[2],瘀血的形成阻滯氣機，致陰陽失調，氣血逆亂，上沖元神之府，出現(xiàn)猝然昏仆、不省人事等癥狀。基于標本緩急的原則，當以活血化瘀為中風后急則治標之法。丹參-川芎是治療中風使用頻率較高的藥對，具有明顯效果[3]。二藥具有抗炎、抑制細胞凋亡，減少神經細胞損傷等作用，中藥制劑丹參川芎注射液由此藥對演變而來，且在臨床被廣泛應用[4-5]。

丹參、川芎始載于《神農本草經》，丹參味苦，微寒，歸心、肝經，具有活血調經，祛瘀止痛等功效，川芎味辛，溫，歸肝、膽、心包經，具有活血行氣、祛風止痛的作用。二者相須配伍，協(xié)作增效。目前對于丹參-川芎藥對治療缺血性腦卒中的作用機制，目標靶點尚未明確。網絡藥理學的興起，為傳統(tǒng)中醫(yī)藥的整體觀念作用機制提供了理論預測[6]。本研究通過網絡藥理學角度預測丹參-川芎配伍治療腦缺血再灌注損傷的可能機制，構建成分信息、靶點、疾病信息三者網絡關系，從整體論治探究藥物和疾病之間的關聯(lián)性以及共同關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 50只健康成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠，體重220～230 g，購自華興實驗動物中心(動物許可證號：SCXK(豫)2019-0002)，所有動物飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院)SPF級動物實驗中心，(22±1) ℃恒溫、60%～75%恒濕、12 h循環(huán)照明，自由攝食、飲水。所有動物飼養(yǎng)及其他試驗操作均符合相關管理要求準則及試驗動物倫理要求(動物倫理號:PZ-HNSZYY-2020-019)。

1.1.2 藥物與試劑 丹參、川芎均購自河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院；4%多聚甲醛、HE染色試劑盒(G1120)均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 HD-300型生物脫水機；HD-310型石蠟包埋機；HD-320型生物切片機；HD-330型攤片烤片機；光學顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 丹參-川芎有效活性成分收集與篩選 應用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺 (traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP,http:∥tcmspw.com/tcmsp.php)，以丹參、川芎為關鍵詞進行檢索，基于口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為篩選條件獲得各個丹參、川芎所含化學成分，構建丹參-川芎所含化學成分數(shù)據(jù)庫。在Uniprot數(shù)據(jù)庫(https:∥www.uniprot.org)中限定人源“Human”和已認證“Reviewed”的靶點并下載，在已收集好的丹參-川芎有效成分表格中，匹配對應的靶點基因名稱，剔除重復值，得到完整的丹參-川芎有效成分潛在靶點列表。

1.2.2 疾病靶點的查找及共同靶點篩選 以“Ischemic stroke”為關鍵詞在GeneCards人類基因數(shù)據(jù)庫(https:∥www.genecards.org)和OMIM在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(https:∥www.omim.org/)中檢索，得到中風疾病靶點。

1.2.3 丹參-川芎藥對治療缺血性腦卒中潛在靶點蛋白互作(PPI)網絡構建 利用韋恩圖制作軟件Venny 2.1.0 (http:∥bioin-fogp.cnb.csic.es/tools/venny/Index.html)，將所有篩選出的藥物靶點與疾病靶點輸入并得到韋恩圖，得到疾病與藥物的共有靶點，將共有靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫(https:∥string-db.org/cgi/input.pl)進行PPI網絡構建，將生物種類設定為Homosapiens,得到 PPI網絡圖。

1.2.4 丹參-川芎有效成分-缺血性腦卒中靶點網絡構建 丹參-川芎是活血化瘀的常見藥對，為了更加直觀的理解丹參-川芎與缺血性腦卒中及相應靶點之間的相互關系，納入中藥活性成分、疾病與藥物共有靶點、疾病，構建藥物-成分-靶點-疾病網絡圖，導入Cytoscape 3.7.2(https:∥cytoscape.org/)軟件中進行網絡圖的繪制。

1.2.5 關鍵成分GO功能與KEGG通路富集分析 將交集靶點輸入Metascape 數(shù)據(jù)庫(https:∥metascape.org)，設置P<0.01，進行GO功能及KEGG通路富集分析。借助微生信(http:∥www.bioinformatics.com.cn)平臺進行可視化分析。

1.3 丹參-川芎藥對制備

查閱文獻[7-9]將丹參、川芎按照1∶1的比例稱取各藥，加10倍量的蒸餾水，浸泡、武火煮沸、轉文火煎、過濾，再加水煮沸、文火煎煮、濾液，合并2次藥液，蒸發(fā)濃縮，高壓滅菌，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 試驗動物分組和給藥

將雄性SD大鼠隨機分成5組，每組10只，分別是假手術組、模型組、丹參-川芎低劑量組、丹參-川芎中劑量組、丹參-川芎高劑量組。給藥劑量參照《人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表》[10]，丹參-川芎高、中、低劑量組分別為8.10、4.05和2.025 g/kg，每日1次。造模前3 d丹參-川芎各劑量組予以灌胃給藥，假手術組、模型組給予等體積的雙蒸水，術后待大鼠清醒最后一次灌胃給藥，于造模后24 h取材。

1.5 腦缺血再灌注大鼠模型的制備

參考Longa等[11]報道的線栓法制備腦缺血再灌注模型。將雄性SD大鼠用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，剪開左側頸部皮膚，依次分離頸部肌肉、頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈。微動脈夾夾閉頸內動脈，結扎頸外動脈、頸總動脈。距頸總動脈分叉處下端剪一V形切口，將線栓球形端插入頸內動脈，直至線栓標記點進入血管，有輕微阻力即可。插入線栓90 min后，輕柔拔出部分線栓實現(xiàn)再灌注。假手術組僅對上述血管進行剝離。大鼠傷口均勻灑青霉素粉末防感染，回籠飼養(yǎng)，正常供應水和飼料，觀察動物狀態(tài)。

1.6 神經功能缺損評分

采用Zea-longa 法[11]進行神經功能缺損評分。0分，無神經功能缺損，可正?；顒樱?分，神經功能輕微缺損，不能完全伸展患側的前爪；2分，神經功能中度缺損，向患側轉圈；3分，神經功能重度缺損，向患側傾斜；4分，不能自發(fā)行走，意識水平下降，甚至意識喪失；5分，死亡。

1.7 HE 染色觀察腦組織病理形態(tài)

各組大鼠再灌注24 h后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，開胸經心臟灌注生理鹽水200～300 mL，待右心耳流出清亮液體，4%多聚甲醛灌注200～300 mL，開顱取腦，4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,進行HE染色。石蠟切片脫蠟透明復水，將切片放進蘇木素染液染10～15 min后自來水沖洗。加入伊紅染色液中15 s，蒸餾水清洗，將切片依次放入75%、85%、95%、100%乙醇梯度脫水2 min，二甲苯透明，中性樹膠封片，自然晾干。光學顯微鏡下觀察拍片，圖像采集分析。

1.8 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料采用平均值±標準差表示。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊，采用t檢驗或單因素方差分析，若呈偏態(tài)分布或方差不齊的計量資料，采用非參數(shù)秩和檢驗。兩兩比較采用LSD檢驗，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 丹參-川芎成分獲取與篩選

根據(jù)TCMSP平臺，以OB≥30%、DL≥0.18為條件，篩選丹參-川芎有效成分，本研究納入72個活性成分，其中丹參活性成分65個，川芎活性成分7個，部分活性成分見表1。

表1 丹參-川芎部分活性成分

2.2 丹參-川芎與缺血性腦卒中共有靶點韋恩圖

利用GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫篩選疾病靶點，匯總并去除重復值，最終獲得缺血性卒中疾病靶點1 972個，將139個丹參-川芎藥物靶點與疾病靶點輸入韋恩圖在線制作軟件Venny 2.1中，發(fā)現(xiàn)共有靶點94個(圖1)。

圖1 丹參-川芎治療缺血性腦卒中共有靶點韋恩圖

2.3 PPI網絡圖

采用STRING數(shù)據(jù)庫對94個丹參-川芎潛在治療缺血性卒中作用靶點進行PPI網絡圖分析，獲得核心靶點PPI網絡圖(圖2)。PPI網絡中節(jié)點越大、顏色越深，表示該蛋白與其他蛋白的相互作用越密切。根據(jù)置信度篩選出前十位核心靶點，構建核心靶點PPI網絡圖見圖3。排在前十位關鍵節(jié)點分別是AKT1、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、白細胞介素6(interleukin 6，IL6)、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、腫瘤蛋白p53(tumor protein p53，TP53)、低聚果糖(fructooligosaccharides，F(xiàn)OS)、胱天蛋白酶 3(recombinant caspase 3，CASP3)、信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、雌激素受體1(estrogen receptor 1，ESR1)，推測其可能為丹參-川芎藥對治療缺血性腦卒中的重要靶點。

圖2 藥物疾病PPI網絡圖

圖3 核心靶點PPI網絡圖

2.4 丹參-川芎治療缺血性腦卒中的藥物-成分-靶點-疾病網絡構建

通過Cytoscape 3.7.2軟件，對丹參-川芎2味中藥活性成分及其94個關鍵靶點基因進行網絡構建及可視化處理。結果顯示，丹參-川芎的活性成分的作用靶點均與缺血性腦卒中疾病靶點基因存在關聯(lián)(圖4)。

六邊形代表疾??；圓形代表川芎有效活性成分；三角形代表丹參有效活性成分；菱形代表94個缺血性腦卒中與藥對丹參-川芎的共同靶點

2.5 丹參-川芎治療缺血性腦卒中潛在靶點GO功能富集分析

利用Metascape數(shù)據(jù)庫對潛在作用靶點進行GO功能富集分析。以P<0.01作為篩選條件，分別進行生物過程(biological processes，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細胞組分(cellular components，CC)分析，共得到GO條目5 587條。生物過程條目4 549條，包括細胞對氮化合物的反應、對激素的反應、蛋白質磷酸化的正調節(jié)、外源刺激的反應、循環(huán)系統(tǒng)過程、MAPK級聯(lián)調節(jié)、對氧含量降低的反應、細胞遷移的正調控等；分子功能條目627條，包括兒茶酚胺結合、激酶結合、胺結合、蛋白質同源二聚體活性、DNA結合轉錄因子結合、核受體活性、肽結合、泛素連接酶結合等；細胞組分條目411條，包括膜筏、突觸前膜的組成部分、感受器復合、轉錄調節(jié)復合物、核膜、內質網腔、膜側、細胞投射膜等。富集結果前十個GO條目見圖5。

圖5 丹參-川芎作用靶點GO功能富集圖

2.6 丹參-川芎治療缺血性腦卒中潛在靶點KEGG富集分析

在KEGG通路富集結果中共富集到114條相關信號通路，PI3K-Akt信號通路、神經活性配體受體相互作用信號通路、cAMP信號通路、cGMP-PKG信號通路等與丹參-川芎治療缺血性腦卒中的作用機制緊密聯(lián)系。如AGE-RAGE信號通路、FoxO信號通路、缺氧誘導因子1(HIF-1)、PI3K-AKT-mTOR信號通路在后20條通路中也有體現(xiàn)，也呈現(xiàn)出了一定的相關度。關系最緊密的前20條信號通路氣泡圖見圖6。

圖6 丹參-川芎治療缺血性腦卒中作用靶點參與的信號通路富集信息氣泡圖

2.7 丹參-川芎對大鼠神經功能評分的影響

大鼠神經功能評分結果見圖7，模型組大鼠再灌注24 h神經功能評分均顯著高于假手術組(P<0.05)，模型組與丹參-川芎低劑量組、丹參-川芎中劑量組之間無顯著性差異(P>0.05)；與模型組比較丹參-川芎高劑量組顯著降低模型大鼠再灌注24 h的Zea-longa評分(P<0.05)；丹參-川芎低、中劑量組有降低腦缺血再灌注損傷24 h Zea-longa評分的趨勢。

①A，假手術組；B，模型組；C，丹參-川芎低劑量組；D，丹參-川芎中劑量組；E，丹參-川芎高劑量組。下同。②模型組與假手術組相比，*，差異顯著(P<0.05)。各劑量組與模型組相比，#，差異顯著(P<0.05)；無#，差異不顯著(P>0.05)

2.8 丹參-川芎對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織病理學的影響

由圖8可知，假手術組大鼠缺血半暗帶皮層神經細胞形態(tài)基本正常，具有完整的結構，排列整齊，細胞核清晰；與假手術組大鼠比較，模型組大鼠神經細胞減少明顯，排列紊亂，細胞核固縮深染，形成較多的空泡，周圍存在激活的小膠質細胞；與模型組大鼠比較，丹參-川芎給藥組神經細胞結構較完整，細胞形態(tài)改變較輕，核固縮少，細胞質較飽滿豐富，且丹參-川芎對腦組織損傷的改善程度隨著丹參-川芎藥對劑量增大而逐漸增強，提示丹參-川芎藥對可改善腦缺血再灌注大鼠的腦損傷。

圖8 各組大鼠腦組織HE染色觀察(400×)

3 討 論

缺血性腦卒中發(fā)病機制復雜，卒中后可引起不同程度的神經損傷癥狀。研究表明，腦卒中后損傷的關鍵機制包括神經細胞的凋亡、Ca2+超載、氧化應激和炎癥等病理反應相關[12]。針對上述病理機制，現(xiàn)代醫(yī)學主要采用溶栓、鈣通道頡頏劑、自由基清除劑、谷氨酸頡頏劑、細胞膜穩(wěn)定劑等藥物對癥治療，但對于腦缺血后的損傷治療效果不佳[13]。丹參-川芎作為活血化瘀的良藥，臨床常用于治療缺血性腦卒中，但其作用機制不太明確。

丹參-川芎作為活血化瘀的常用藥對，在治療缺血性腦卒中方面發(fā)揮較好的療效。周惠芬等[14]采用氧糖剝奪-復氧法，建立體外腦缺血再灌注損傷模型，發(fā)現(xiàn)丹參-川芎有效成分配伍通過減輕氧化應激、炎癥損傷和抑制細胞凋亡保護氧糖剝奪海馬神經元?；葙t瑞等[15]發(fā)現(xiàn)，丹參-川芎中藥制劑冠心寧片可降低腦缺血再灌注小鼠神經功能評分、減輕腦梗死面積、改善腦組織病理學形態(tài)、神經元損傷及細胞凋亡。楊喜忠等[16]觀察50位腦梗死患者發(fā)現(xiàn)，冠心寧注射液對早期腦梗死具有較好效果。王麗萍等[17]發(fā)現(xiàn)急性腦梗死患者應用丹參-川芎注射液聯(lián)合依達拉奉治療優(yōu)于依達拉奉的臨床療效。丹參-川芎嗪注射液[18]可能通過下調GMP-140和vWF含量，改變血瘀模型大鼠的血液流變學指標。藥理學研究發(fā)現(xiàn)，丹參[19-20]的活性成分具有抗炎、抗氧化、保護神經功能等作用，川芎[21]有效活性成分具有改善微循環(huán)、抗炎、抗氧化、細胞保護等作用。

網絡藥理學通過PPI網絡圖分析結果顯示，丹參-川芎有效組分配伍作用于缺血性腦卒中的重要靶點包括Akt1、TNF、IL6、VEGFA、ESR1等94個。PI3K的下游關鍵靶點是Akt，腦缺血后PI3K/Akt信號通的激活對抑制神經元凋亡和神經炎癥具有重要作用[22]。本課題組前期研究表明，大鼠腦缺血再灌注后，PI3K/Akt信號通路的激活，誘導Akt磷酸化對神經血管單元具有保護作用[23]。TNF、IL6是介導炎癥級聯(lián)反應的細胞因子，腦缺血時，炎癥因子聚集刺激引起NF-κB迅速活化促進炎性因子的表達，引起組織的炎癥反應，加重神經元的損傷[24]。在腦缺血后，VEGFA通過促進損傷后的腦內神經血管單元的重構起到保護神經元的作用[25]。ESR1編碼雌激素受體的亞型ERα，它們與雌激素結合后發(fā)揮生物學效應，腦缺血后，神經保護和認知功能的修復都與ESR1有關，宋先兵[26]發(fā)現(xiàn)在大鼠去卵巢局灶性腦缺血模型中，雌激素具有神經保護和認知修復作用。

通過GO功能和KEGG通路富集分析顯示，丹參-川芎治療缺血性腦卒中涉及多種生物過程和多個信號通路，相關性較高的信號通路包括PI3K-Akt、cGMP-PKG、cAMP、VEGF等信號通路，主要在抑制炎癥反應、抑制細胞凋亡、保護神經功能、促進血管內皮生成等過程中發(fā)揮抗腦缺血損傷作用。缺血性腦卒中是一種多因素多基因的疾病，發(fā)病機制錯綜復雜，腦缺血后損傷是一種迅速而又復雜的過程，細胞的死亡在此過程中意義重大，PI3K-Akt信號通路[27]是腦卒中后細胞程序性死亡的關鍵靶點。環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)和環(huán)磷酸腺苷(cAMP)作為第二信使調節(jié)激素和神經遞質的釋放，cGMP通過cGMP依賴性蛋白激酶(PKG)對蛋白質磷酸化的作用來介導細胞的生理效應，cAMP通過激活APK使蛋白磷酸化從而調節(jié)細胞反應[28]。腦缺血情況下，腦內的環(huán)核苷酸被激活，潘建玲等[29]發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注模型大鼠中，cAMP、cGMP的含量對腦缺血后抗氧化應激能力具有重要意義。Akt 是PI3K的下游靶標，PI3K/Akt通路在小腦神經元中介導cGMP依賴性生存作用，PI3K/Akt通路的激活介導了來自腦室下區(qū)的成體祖細胞cGMP增強的神經發(fā)生[30]。大鼠腦缺血再灌注損傷后，通過激活VEGF介導的PI3K-Akt信號通路緩解腦缺血再灌注的損傷[27,31]。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學的方法驗證了丹參-川芎治療缺血性腦卒中的理論依據(jù)，通過關鍵疾病藥物的共同靶點預測出丹參-川芎治療缺血性腦卒中的重要信號通路，主要包括PI3K-Akt、cGMP-PKG、cAMP、VEGF等信號通路，動物試驗驗證丹參-川芎藥對可改善腦缺血再灌注損傷模型大鼠的神經功能損傷，改變腦缺血再灌注損傷后腦組織病理形態(tài)變化，從而發(fā)揮神經保護作用，并呈現(xiàn)劑量相關性，本研究體現(xiàn)了丹參-川芎多靶點的作用特點，對明確丹參-川芎抗腦缺血再灌注損傷的機制具有重要意義。這些研究結果為丹參-川芎治療腦缺血再灌注損傷的作用機制提供理論支持，但仍需通過更多的基礎試驗進行后續(xù)驗證。

4 結 論

本研究結果顯示，丹參-川芎治療腦缺血再灌注損傷可能是通過參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、阿魏酸等藥物活性成分，作用于AKT1、TNF、IL6、VEGFA、TP53、FOS、CASP3、STAT3、EGFR、ESR1等核心靶點，通過PI3K-Akt、cGMP-PKG、cAMP、VEGF信號通路對腦缺血再灌注損傷產生治療作用。丹參-川芎可減輕急性腦缺血再灌注模型大鼠神經功能評分，改善腦缺血再灌注損傷后大鼠腦組織病理形態(tài)變化，為丹參-川芎治療急性腦缺血再灌注損傷提供有力證據(jù)。