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    福建省漳州市羅非魚無乳鏈球菌分離鑒定及毒力基因和耐藥性研究

    2022-09-22 05:18:12陳懷君溫華茂陳智怡董洪燕郭長明
    中國畜牧獸醫(yī) 2022年9期
    關(guān)鍵詞:無乳羅非魚血清型

    袁 橙,陳懷君,袁 圣,溫華茂,陳智怡,董洪燕,封 琦,郭長明

    (1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,泰州 225300;2.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,南寧 530004;3.福建恒興飼料有限公司,漳州 363108)

    羅非魚養(yǎng)殖在國內(nèi)發(fā)展迅速,已成為繼中國四大家魚之后的第五大養(yǎng)殖魚種。據(jù)《中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒2019》統(tǒng)計,2018年中國羅非魚淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量為162.5萬t,比2017年增長4萬t。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大,羅非魚養(yǎng)殖環(huán)境管理和控制卻未能同步保障,導(dǎo)致每年7~10月份無乳鏈球菌病等頻繁暴發(fā),制約了中國羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[1-3]。

    無乳鏈球菌感染宿主范圍廣泛,不僅會引起魚類敗血癥、奶牛乳腺炎,而且能引發(fā)新生兒敗血癥、腦膿腫等嚴(yán)重疾病[4]。中國流行的無乳鏈球菌血清型主要為Ⅰa型[5],其發(fā)病機(jī)制包括菌體黏附與侵襲細(xì)胞、菌體釋放毒素和宿主不適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答等[6-7]。無乳鏈球菌的許多毒力因子與致病機(jī)制相關(guān)。當(dāng)感染宿主時,病原菌選擇性表達(dá)的多種毒力因子共同配合引發(fā)疾病。已有研究證實(shí),約30種毒力因子與無乳鏈球菌的致病性有關(guān)[8]。其中,cylE基因編碼的β-溶血素是無乳鏈球菌表面相關(guān)的多功能毒素,可促進(jìn)細(xì)菌在宿主體內(nèi)擴(kuò)散,引起心臟、肝臟功能衰竭等;sodA基因編碼的超氧化物歧化酶有助于細(xì)菌適應(yīng)宿主體內(nèi)的氧化應(yīng)激環(huán)境;gapC基因參與編碼的三磷酸甘油醛脫氫酶與無乳鏈球菌黏附宿主細(xì)胞有關(guān);scpB基因編碼的C5a肽酶可分解和滅活人類補(bǔ)體成分C5a,幫助細(xì)菌逃避免疫系統(tǒng)的清除。目前魚無乳鏈球菌病尚無有效疫苗可用,多數(shù)養(yǎng)殖場應(yīng)對該病的主要措施仍是投喂抗生素,導(dǎo)致魚源無乳鏈球菌耐藥性日趨嚴(yán)重。

    為了解福建羅非魚主養(yǎng)區(qū)無乳鏈球菌病流行特征,江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從福建省漳州市部分地區(qū)羅非魚養(yǎng)殖場分離無乳鏈球菌,通過對分離菌株進(jìn)行血清型鑒定、主要毒力基因鑒定和藥敏試驗(yàn),以期明確福建羅非魚主養(yǎng)區(qū)無乳鏈球菌的生物學(xué)特性,為防治魚類無乳鏈球菌病提供一定的科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 樣品來源

    2020年8月上旬,江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從福建省漳州市某羅非魚養(yǎng)殖場采集泳姿異常(如翻滾式或呈原地轉(zhuǎn)圈式游動),或出現(xiàn)眼球突出混白等癥狀羅非魚的腦組織、眼球內(nèi)容物、肝臟等作為待檢病料。

    1.2 主要試劑

    無菌綿羊血購自南京鼎周生物科技有限公司;THB培養(yǎng)基購自BD公司;瓊脂粉購自O(shè)XOID公司;細(xì)菌基因組提取試劑盒、DNA純化試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司;DL2000 DNA Marker、PCR 2×TaqMix均購自南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司;藥敏紙片和生化反應(yīng)管均購自杭州濱和微生物試劑有限公司;其余試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

    1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)觀察

    取病魚腦組織、眼球內(nèi)容物及肝臟組織,劃線接種于TSB血平板進(jìn)行細(xì)菌分離,37 ℃過夜培養(yǎng),次日觀察菌落形態(tài)及溶血特性。挑取白色、表面光滑濕潤、邊緣整齊的優(yōu)勢菌單菌落接種TSB液體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期,取適量菌液進(jìn)行革蘭染色,用油鏡對分離株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

    1.4 分離株的生化鑒定

    從分離株純培養(yǎng)物中挑取單個典型菌落,參照生化反應(yīng)管說明書進(jìn)行VP試驗(yàn)、CAMP試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)、海藻糖和山梨醇發(fā)酵試驗(yàn)、馬尿酸鹽和七葉苷水解試驗(yàn)。

    1.5 細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定

    1.5.1 菌株P(guān)CR鑒定 將生化鑒定為陽性的分離株在THB血平板上進(jìn)行三區(qū)劃線純化菌株,37 ℃培養(yǎng)18 h后,挑取單菌落于THB液體培養(yǎng)基中,置于搖床180 r/min、37 ℃恒溫培養(yǎng)至對數(shù)生長期。利用菌液PCR快速檢測陽性菌株。根據(jù)文獻(xiàn)[9]合成無乳鏈球菌16S rDNA特異性片段引物(上游引物:5′-GAGTTTGATCATGGCTCAG-3′;下游引物:5′-ACCAACATGTGTTAATTACTC-3′),引物由蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系15 μL:菌液 2 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,2×TaqMix 7.5 μL,ddH2O 3.5 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性15 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸15 s,共34個循環(huán);72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

    1.5.2 細(xì)菌DNA提取 將PCR檢測陽性菌株分別接種于8 mL THB培養(yǎng)基中,置于搖床180 r/min、37 ℃恒溫培養(yǎng)6 h。按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組DNA,并保存于-20 ℃,用于16S rDNA通用引物PCR進(jìn)一步鑒定。

    1.5.3 分離菌株16S rDNA鑒定 根據(jù)文獻(xiàn)[10]合成細(xì)菌16S rDNA通用引物(上游引物:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCA-3′;下游引物:5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′),引物由蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系50 μL:DNA模板 2 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL,2×TaqMix 25 μL,ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)條件同1.5.1。序列預(yù)期擴(kuò)增長度為1 500 bp。取2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。用DNA純化試劑盒對符合預(yù)期條帶的部分?jǐn)U增產(chǎn)物進(jìn)行純化,寄送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序。

    1.6 分離株血清型鑒定

    參照Imperi等[11]基于莢膜多糖基因序列設(shè)計的無乳鏈球菌血清型鑒定引物,合成19條特異性引物(表1),引物均由蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司合成。以無乳鏈球菌參考菌株人源株NEW316、牛源株ATCC 13813、魚源株GD201008-001作為陽性對照,多重PCR鑒定分離株的血清型。

    從歷史來看,15世紀(jì)的西方人充滿了一種敢于冒險的精神,以超乎尋常的方式探索著未知的世界。葡萄牙人航海探險的規(guī)模雖然難以與東方世界鄭和下西洋的規(guī)模相比較,但它也是那個歷史性的時刻,一個海上技術(shù)與通道迅速發(fā)展、連接整個世界的時刻,一個西方亨利王子緊抓機(jī)遇、東方皇帝拒絕機(jī)遇的時刻,成了決定西方主宰世界的時刻。西方的冒險迸發(fā)了諸類治理文明,而這些文明又迅速擴(kuò)展,成為其主宰世界的有力工具。

    PCR反應(yīng)體系20 μL:DNA模板 1μL,2×TaqMix 10 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)條件同1.5.1。反應(yīng)結(jié)束后取2 μL產(chǎn)物進(jìn)行1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

    1.7 分離株毒力基因的檢測

    為檢測分離菌株的主要毒力基因,根據(jù)文獻(xiàn)[12]合成4個無乳鏈球菌主要毒力基因SodA、cylE、gapC和scpB引物,引物信息見表2。以無乳鏈球菌參考菌株人源株A909、牛源株ATCC13813、魚源株GD201008-001作為陽性對照,同時以ddH2O為模板做陰性對照,分別PCR擴(kuò)增以上4種毒力基因。PCR反應(yīng)體系15 μL:細(xì)菌基因組DNA 2 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,2×TaqMix 7.5 μL,ddH2O 3.5 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性15 s,退火(溫度見表2)15 s,72 ℃延伸30 s,共30個循環(huán);72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后,取2 μL產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

    表2 毒力基因檢測引物

    1.8 藥敏試驗(yàn)

    根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI)推薦的K-B法,測定各分離株對29種抗菌藥的敏感性。取150 μL新鮮的目的菌液涂于直徑90 mm的THB平板,貼藥敏片后37 ℃恒溫培養(yǎng)15 h左右,測量抑菌圈直徑。依據(jù)抑菌范圍說明書進(jìn)行藥敏結(jié)果判斷。

    2 結(jié) 果

    2.1 臨床癥狀

    病魚表現(xiàn)為食欲減退,游動姿勢不平衡或呈圈樣打轉(zhuǎn),眼球突出腫大,眼角膜渾濁,眼眶四周輕微出血。剖檢各臟器伴有不同程度的水腫,病魚肝臟腫大并呈纖維素樣變,膽囊腫大、顏色較深、膽汁充盈。

    2.2 形態(tài)學(xué)觀察

    將分離菌株劃線接種血瓊脂平板,37 ℃培養(yǎng)24 h后,菌落特征為:白色圓形、邊緣整齊、表面光滑濕潤,呈β溶血(圖1)。革蘭染色后,油鏡下分離株為典型的革蘭陽性球菌特性,菌體呈藍(lán)紫色,菌體排列為長短不一的鏈狀,單個或成對存在(圖2)。共分離獲得14株分離菌。

    圖1 分離株菌落特征

    圖2 分離株革蘭染色鏡檢圖(1 000×)

    2.3 生化鑒定結(jié)果

    生化鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn),14株分離株VP試驗(yàn)、CAMP均為陽性,觸酶試驗(yàn)陰性,能發(fā)酵海藻糖,不能分解山梨醇和馬尿酸鹽,七葉苷水解試驗(yàn)均為陰性,符合無乳鏈球菌的生化特性。

    2.4 特異性片段PCR擴(kuò)增及16S rDNA鑒定結(jié)果

    將生化試驗(yàn)鑒定陽性的14株分離菌株用特異性片段引物均擴(kuò)增出大小為220 bp的目的條帶,部分分離株特異性片段引物快速鑒定結(jié)果見圖3。

    M,DL2000 DNA Marker;1,GD201008-001;2,陰性對照;3~9,部分分離菌株。圖4同

    以各細(xì)菌基因組DNA為模板,16S rDNA通用引物擴(kuò)增結(jié)果顯示,獲得大小為1 500 bp的目的片段(圖4),與預(yù)期的條帶大小相符,測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對,與無乳鏈球菌相似度高于99%,進(jìn)一步證實(shí)14株分離菌株均為無乳鏈球菌。

    圖4 部分分離株16S rDNA PCR鑒定

    2.5 血清型鑒定

    以已知血清型的參考菌株GD201008-001、ATCC 13813、NEW316為陽性對照,采用多重PCR鑒定目的菌株的血清型,結(jié)果見圖5。由圖5可知,所有分離菌株的血清型均為Ⅰa型,與陽性對照菌株GD201008-001一致,呈現(xiàn)2個目的條帶680和270 bp。

    M,DL2000 DNA Marker;1,GD201008-001(血清Ⅰa型);2,ATCC 13813 (血清Ⅱ型);3,NEW316 (血清Ⅲ型);4,陰性對照;5~18,分離菌株

    2.6 主要毒力基因的檢測

    以已知毒力基因的參考菌株GD201008-001、ATCC 13813、A909為陽性對照,擴(kuò)增各分離菌株的主要毒力基因。cylE(697 bp)、sodA(528 bp)及gapC(222 bp)3種毒力基因的檢出率為100%。14株分離菌株均未檢測出毒力基因scpB(1 270 bp),該毒力基因僅在參考菌株人源無乳鏈球菌A909中檢出。部分菌株毒力基因檢測結(jié)果見圖6。

    ①A~D,分別為毒力基因cylE、sodA、gapC和scpB。②M,DL2000 DNA Marker;1,GD201008-001;2,ATCC 13813;3,A909;4,陰性對照;5~11,部分分離株

    2.7 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

    由表3可知,14株分離菌株對甲氧胺嘧啶、磺胺異噁唑、氟羅沙星、多黏菌素B及氨基糖苷類藥物敏感率為0,且耐藥率均達(dá)50%以上。但對氯霉素類、β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、利福霉素類、林可胺類藥物的敏感性為100%。

    表3 分離菌株藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

    2.8 多重耐藥分析

    由圖7可知,14株分離菌株均呈多重耐藥現(xiàn)象,耐藥數(shù)量為4到8重,其中6重及以上耐藥的菌株11株,占總分離菌株數(shù)的78.57%。

    圖7 分離株多重耐藥分析結(jié)果

    3 討 論

    從福建省漳州市部分漁業(yè)養(yǎng)殖場采集眼球混白突出、眼眶輕微出血、游動姿勢呈圈樣打轉(zhuǎn)或偏向一側(cè)等病癥的羅非魚病料,從病魚的腦、肝臟和眼部分離病原菌。純化結(jié)果發(fā)現(xiàn),分離菌菌落在THB血平板上為圓形乳白色,表面光滑,呈β溶血。由16S rDNA特異性片段引物初步鑒定及16S rDNA通用引物擴(kuò)增后測序比對,共獲得14株無乳鏈球菌。

    研究表明,魚源、人源和牛源無乳鏈球菌分子血清型主要包含Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ型3種[13-14]。國內(nèi)分離菌株的血清型主要為Ⅰa型,Ⅰb和Ⅲ型較少。對14株分離菌株的血清型進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)血清型均為Ⅰa型,與對照菌株GD201008-001相同。此次在福建地區(qū)分離得到的菌株血清型,與江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室同期在海南、廣西地區(qū)分離得到的無乳鏈球菌血清型相同[15-16],均為Ⅰa型。方偉等[17]研究顯示,廣東省部分羅非魚養(yǎng)殖區(qū)感染的無乳鏈球菌血清型均為Ⅰa型,與本試驗(yàn)結(jié)果一致,進(jìn)一步證實(shí)國內(nèi)羅非魚無乳鏈球菌的優(yōu)勢血清型是Ⅰa型。

    無乳鏈球菌中多種毒力因子作用于機(jī)體,導(dǎo)致宿主產(chǎn)生一系列病癥。本研究檢測的毒力基因包括cylE、sodA、gapC和scpB,檢測結(jié)果與江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室同期在福建、海南、廣西3個地區(qū)分離獲得的76株無乳鏈球菌主要毒力基因檢測結(jié)果完全吻合,這些分離株均含毒力基因cylE、sodA和gapC,而缺少毒力基因scpB[15-16]。馬芳等[18]檢測結(jié)果顯示,分離株血清型也均為Ⅰa型,同時gapC和cylE基因陽性;Kayansamruaj等[19]研究顯示,cylE基因陽性率為100%,但scpB基因序列在Ⅰa 型無乳鏈球菌的基因組中不存在。以上國內(nèi)相關(guān)研究成果均與此次研究符合,提示scpB基因可能不是Ⅰa 型羅非魚無乳鏈球菌的主要毒力基因,所以檢出率低。

    研究發(fā)現(xiàn),福建地區(qū)無乳鏈球菌對β-內(nèi)酰胺類、氨芐青霉素、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素等藥物敏感,此結(jié)果與王巧煌[20]研究結(jié)果一致。謝?;╗21]研究顯示,福州地區(qū)無乳鏈球菌對青霉素G、氨芐青霉素、萬古霉素有較高的敏感率,與本研究結(jié)果相符。將此次福建地區(qū)藥敏結(jié)果與江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離得到的海南、廣西地區(qū)無乳鏈球菌的藥物分析結(jié)果進(jìn)行比較[15-16],3個地區(qū)的分離菌株均對磺胺異噁唑、慶大霉素、鏈霉素、新霉素4種藥物表現(xiàn)高耐藥率,對紅霉素、利福平、克林霉素、β-內(nèi)酰胺類藥物的敏感率高。福建、海南和廣西3個地區(qū)分離株的不同之處包括:①福建、廣西地區(qū)菌株還對卡那霉素有較強(qiáng)的耐藥性,但海南地區(qū)菌株對卡那霉素敏感性高達(dá)93%;②海南地區(qū)菌株對復(fù)方新諾明呈現(xiàn)高耐藥率,但福建、廣西地區(qū)菌株對該藥敏感性較強(qiáng)。以上對比結(jié)果顯示,3個地區(qū)的漁業(yè)養(yǎng)殖戶對抗生素的選用大致相似,進(jìn)一步分析造成3個地區(qū)分離株耐藥性差別的原因可能有:①3個地區(qū)的分離株有不同的遺傳背景,對某些藥物的敏感度不同[22-24];②部分養(yǎng)殖戶長期使用某種藥物,病原菌毒力基因、耐藥基因的表達(dá)可能發(fā)生變化,誘導(dǎo)病原菌耐藥性的產(chǎn)生,造成抗生素“失效”;③養(yǎng)殖環(huán)境的差異,如水體硬度、pH及金屬離子的含量等[25],這些因素均對藥效有一定影響。明確各地的無乳鏈球菌的耐藥規(guī)律,對指導(dǎo)用藥、制定合理防控措施具有重要的指導(dǎo)意義。

    調(diào)研和采樣中發(fā)現(xiàn),許多羅非魚養(yǎng)殖戶一味追求提高養(yǎng)殖密度,忽視養(yǎng)殖環(huán)境控制,使魚體長期處于應(yīng)激狀態(tài)、免疫力下降,感染細(xì)菌性疾病的風(fēng)險增加。規(guī)范養(yǎng)飼養(yǎng)管理,保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全迫在眉睫[26]。當(dāng)前,使用抗生素仍是控制羅非魚無乳鏈球菌病的主要手段,養(yǎng)殖戶應(yīng)提高科學(xué)用藥意識,通過藥敏試驗(yàn)篩選國家允許使用的有效藥物,精準(zhǔn)治療羅非魚鏈球菌病。隨著漁用抗生素禁用種類的不斷增加,尋找替代抗生素療法對防治羅非魚無乳鏈球菌病也有重要意義,如研制疫苗、使用抗菌肽及中草藥防治方法等[27-29]。

    4 結(jié) 論

    本研究從福建省漳州市發(fā)病羅非魚中分離獲得14株無乳鏈球菌,血清型均為Ⅰa型。毒力基因cylE、sodA、gapC檢出率均為100%,未檢出毒力基因scpB。14株分離菌株均呈多重耐藥,磺胺異噁唑、慶大霉素、卡那霉素等耐藥率>70%,氯霉素類、β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類等敏感率為100%。

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