谷子GRAS轉錄因子家族的全基因組鑒定、表達分析及標記開發(fā)

王智蘭 韓康妮 杜曉芬 李禹欣 連世超 王 軍

(山西農(nóng)業(yè)大學谷子研究所/雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室/雜糧種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種山西省重點實驗室，山西 長治 046011)

GRAS基因家族編碼一類植物特有的轉錄調(diào)控因子，參與信號轉導、脅迫應答、分生組織形成等眾多生物學過程，在植物組織的生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用[1]。谷子作為世界性主要雜糧作物之一，基因組小，具有營養(yǎng)價值高、耐逆和高光效等特點，已經(jīng)成為遺傳和分子生物學研究的C4模式作物之一[2]。因此，鑒定GRAS家族基因并研究其在不同激素和逆境脅迫下的表達特性，對利用該家族基因進行谷子株高、產(chǎn)量和耐逆等性狀的遺傳改良具有重要意義。

GRAS轉錄因子家族命名來源于最初發(fā)現(xiàn)的3個家族成員GAI[3]、RGA[4]和SCR[5]。GRAS蛋白一般由400～700個氨基酸組成，其C端序列高度保守，一般由5個典型的結構域組成，即LHRI、VHIID、LHRII、PFYRE和SAW基序[6]。相比而言，GRAS蛋白N端含有不同的固有無序區(qū)域，使得該類蛋白可以通過改變N端結構來靈活地特異性識別配體，因此，GRAS家族表現(xiàn)出功能多樣性[7]，包括參與赤霉素[8]、光信號[9-11]和油菜素內(nèi)酯[12]等多種信號轉導通路，調(diào)控腋芽[13]、根[14-15]、分生組織生長[16-17]、分蘗[18]以及維持頂端優(yōu)勢[19-21]等，響應植物對鹽、干旱[22]、遮蔽[23]和重金屬[24]等非生物脅迫，并參與雄配子的形成過程[25]。根據(jù)N端結構域的差異，GRAS家族蛋白一般分為SCL3、SHR、PAT1、LISCL、DELLA、SCR、LS、DLT、SCL4/7和HAM等10個亞家族[26-28]。SCR亞家族蛋白N端包含與其他蛋白互作所必需的結構域，在抑制不對稱細胞分裂中起作用[29]；DELLA亞家族蛋白N端存在GA信號的感知結構域，水稻的SLR1[30]，擬南芥的GID1[31]、RGA[32]、GAI[33]、以及RGL1、RGL2和RGL[34]等都屬于DELLA蛋白。目前，已經(jīng)在擬南芥[26]、水稻[26,35]、大豆[36]、小麥[37]、大麥[38]、藜麥[39]、大白菜[40]、人參[41]和胡桃[42]等30余種植物中對GRAS基因家族進行了鑒定和分析。

隨著谷子基因組的公布[43-44]，bZIP、DREB、TCP和MYB等轉錄因子基因家族已被相繼鑒定[45-46]，但谷子GRAS轉錄因子基因家族相關研究仍鮮有報道。鑒于此，本研究通過生物信息學方法對谷子全基因組GRAS轉錄因子基因家族成員進行鑒定，對所有成員的理化信息、結構功能、表達模式等進行分析。同時，利用實時熒光定量(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)分析33個GRAS基因在4種植物激素和2種非生物脅迫條件下的表達模式，旨在為進一步解析GRAS基因家族的功能奠定基礎。另外，根據(jù)DELLA亞家族基因SiGRAS23序列差異開發(fā)分子標記，并在遺傳群體中進行檢測，以期為今后谷子株高分子標記輔助選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 谷子全基因組GRAS蛋白的鑒定及理化性質(zhì)分析

從Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)數(shù)據(jù)庫下載谷子蛋白數(shù)據(jù)，從Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)中下載GRAS家族的隱馬氏模型文件(Pfam號碼：PF03514)[47]，通過HMMER軟件對谷子蛋白進行相似性搜索，找到GRAS家族蛋白序列，使用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)和CDD(http://www.Ncbi.Nlm.Nih.Gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)檢測蛋白結構域[48]，過濾結構不完整的序列。最后，使用 ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)查找谷子GRAS蛋白的相關信息，包括氨基酸數(shù)目、分子量、等電點和親水性平均值(grand average of hydropathicity，GRAVY)。

1.2 谷子GRAS家族系統(tǒng)發(fā)育關系分析

用ClustalW對52個谷子(Setariaitalia)SiGRAS、34個擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtGRAS[26]、56個水稻(Oryzesativa)OsGRAS[26]、84個玉米(Zeamays)ZmGRAS[27]、80個高粱(Sorghumbicolor)SbGRAS[27]和48個短柄草(Brachypodiumdistachyon)BdGRAS[28]等GRAS家族基因氨基酸序列進行多重序列比對，利用MEGA-X軟件中鄰接法(neighbor-joining)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值(Bootstrap)設為1 000。參考AtGRAS和OsGRAS蛋白的分類信息[35]對系統(tǒng)發(fā)育樹進行聚類分析，利用網(wǎng)站Evolview v3(https://www.evolgenius.info/evolview/#login)進行進化樹美化[49]。

1.3 谷子GRAS基因結構和家族成員保守結構域分析

從Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)數(shù)據(jù)庫下載谷子基因組GRAS序列信息。根據(jù)谷子GRAS家族成員的基因組DNA序列及編碼區(qū)序列(coding sequence, CDS)，利用GSDS 2.0軟件[50](http://gsds.cbi.pku.edu.cn)分析其基因結構。利用在線預測軟件MEME[51](http://eme.nbcr.net/meme/tools/meme)預測蛋白結構域，結構域查找的最大數(shù)值設定為15。

1.4 SiGRAS的組織表達分析

從谷子全生育期基因表達圖譜和多組學數(shù)據(jù)庫(http://sky.sxau.edu.cn/MDSi.htm)下載晉谷21號生長發(fā)育過程中各組織器官的RNA-Seq數(shù)據(jù)[44]，包括19個不同的組織(T1～T19)：萌發(fā)3 d種子(T1)、兩葉一心齡整株苗(T2)、抽穗后2 d的頂2和3葉(T3)、灌漿期的穗下節(jié)間(T4)、灌漿期的旗葉(T5)、灌漿期的旗葉葉鞘(T6)、灌漿期的莖(T7)、灌漿期的頂部第4葉(T8)、灌漿期的頂部第4葉(T9)、灌漿期的根(T10)、分化初始階段穗(T11)、分化第3階段穗(T12)、未成熟的圓錐花序S2(T13)、未成熟的圓錐花序S4(T14)、灌漿期種子S1(T15)、灌漿期種子S2(T16)、灌漿期種子S3(T17)、灌漿期種子S4(T18)和灌漿期種子S5(T19)，以此分析谷子GRAS基因的組織表達特性。利用SPSS軟件包中的Zscore方法，對各成員基因在各組織中表達的FPKM值進行數(shù)據(jù)標準化處理，用TBtools[52]繪制SiGRASs的組織表達熱圖。

1.5 SiGRAS啟動子區(qū)域順式作用元件預測

下載SiGRASs啟動子序列(起始密碼子ATG上游1.5 kb)(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)。將獲得的啟動子序列提交到PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)，進行順式作用元件預測。

1.6 qRT-PCR表達分析

根據(jù)GRAS基因家族啟動子順式作用元件預測結果，采用qRT-PCR方法，選取33個谷子GRAS基因(涵蓋了該家族的10個亞類)用于分析這些基因對生長素(吲哚乙酸，indole-3-acetic acid, IAA)、赤霉素(gibberellin A3, GA3)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)、脫落酸(abscisic acid, ABA)、干旱(PEG6000)和冷(4℃)處理下的表達規(guī)律。選擇飽滿的長農(nóng)35號種子播種于營養(yǎng)缽(營養(yǎng)土∶蛭石=1∶1)，放置于光照培養(yǎng)箱(RTOP-268Y，托普云農(nóng)，浙江)中，生長條件為光照14 h 30℃/黑暗10 h 25℃，待幼苗長至兩葉一心時，分別用5 μmol·L-1IAA、100 μmol·L-1GA3、100 μmol·L-1MeJA、100 μmol·L-1ABA、20% PEG-6000和4℃分別處理幼苗，分別采集對照植株和處理后1、3、6和12 h的植株葉片。按照RNAiso Plus試劑盒(TaKaRa，日本)和步驟說明提取總RNA，采用PrimeScript Ⅱ 1ststrand cDNA synthesis kit(TaKaRa，日本)反轉錄為cDNA，qRT-PCR引物見附表S1。以谷子ACTIN作為內(nèi)參基因。通過CFX96 Real-time PCR儀(Bio-Rad，美國)采集熒光實時定量數(shù)據(jù)，反應體系為10 μL：cDNA template(反轉錄第一鏈)1 μL、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(TAKARA,日本)5 μL、2 μmol·L-1特異引物1 μL，ddH2O 3 μL。擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸5 min。65～98℃繪制溶解曲線。采用比較閾值法進行定量分析。程序結束后，根據(jù)Ct值計算C值，公式如下：

C=2-ΔCt(ΔCt=Ct目標基因-Ct內(nèi)參基因)

3次重復的C值平均值為目的基因的相對表達量。采用SPSS 19軟件中單因素方差分析方法進行相對表達量顯著性差異檢測(P<0.05)。

1.7 DELLA蛋白基因SiGRAS23分子標記開發(fā)

前期研究利用谷子矮寧黃×晉谷21號的F2分離群體，定位了7個與谷子株高相關的QTL，其中第5號染色體上存在3個株高QTL，分別為qPH5-1、qPH5-2、qPH5-3，qPH5-2的遺傳效應值較大[53]。因此，本研究在上述定位區(qū)間內(nèi)搜索相關GRAS基因家族成員，通過克隆測序，檢測目標基因在矮寧黃和晉谷21號中的等位變異，開發(fā)分子標記，并在矮寧黃×晉谷21號的F5群體(AJF5)中192個株系中進行檢測，結合株高表型值，進行相關性分析。同時，從谷子種質(zhì)資源中隨機選取株高表型變異從75.0～173.7 cm材料37份(附表S2)，利用開發(fā)的分子標記檢測上述材料的基因型。

2 結果與分析

2.1 谷子GRAS家族成員的鑒定及分析

利用HMMER軟件共獲得62個GRAS候選蛋白，使用SMART和CDD工具檢測保守結構域，刪除結構不完整的序列，最終保留52條具有完整谷子GRAS結構域序列。以SiGRAS命名谷子GRAS基因，將所對應的52條DNA序列作為谷子GRAS轉錄因子家族的候選基因。染色體定位結果顯示，除第Ⅵ染色體上無GRAS外，52個SiGRASs呈不均勻狀態(tài)分布在谷子8條染色體上(表1)。不同GRAS轉錄因子蛋白序列存在較大差異，氨基酸長度362～734 aa，蛋白分子量39.81～100.09 kDa，等電點為4.85～9.53，其中等電點小于7的GRAS蛋白有43個，偏酸性蛋白居多。除Seita.2G374000、Seita、3G137200和Seita.9G576800外，其余蛋白均具有親水性(表1)。

表1(續(xù))

2.2 谷子GRAS轉錄因子家族系統(tǒng)發(fā)育分析

為深入理解谷子GRAS的進化關系，通過構建谷子與擬南芥(34個)、水稻(56個)、玉米(84個)、高粱(80個)和短柄草(48個)GRAS蛋白進化樹，對系統(tǒng)發(fā)育樹進行聚類分析(圖1)。結果表明，谷子中52個GRAS轉錄因子家族可分成LISCL、PAT1、SCR、DELLA、DLT、SCL3、SHR、LAS、SCL4/7和HAM等10個亞家族(圖1)，其中LISCL亞家族成員最多，含15個蛋白；DLT和SCL4/7亞家族成員最少，各含1個蛋白。

圖1 谷子、擬南芥、水稻、玉米、短柄草和高粱的GRAS家族系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of GRAS gene family in Setaria italica, Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Zea mays, Sorghum bicolor and Brachypodium distachyon

2.3 GRAS基因結構和蛋白保守結構域分析

基因結構和蛋白保守域分析表明，SiGRASs多數(shù)無內(nèi)含子，同一亞家族內(nèi)，基因結構基本一致，保守基序具有相似性，暗示同一個亞家族的基因具有相似功能。所有SiGRAS蛋白都擁有由LHRI、VHIID、LHRII、PFYRE和SAW在C末端組成的GRAS結構域，與保守的C末端相比，SiGRAS蛋白的N末端序列在各亞族間差異較大。在同一亞家族中，SiGRAS蛋白質(zhì)的氨基酸序列表現(xiàn)出高度一致性(圖2)。

注：外顯子和內(nèi)含子分別用黑色方框和黑色線條表示，UTR用淺灰色方框表示。不同顏色代表不同的結構域。Note: Exons and introns were indicated by dark boxes and dark lines respectively, UTRs were indicated by light grey boxes. Different motifs were displayed in different colors.圖2 谷子GRAS基因家族的進化樹、基因結構和保守結構域Fig.2 Phylogenetic tree, gene structure and conserved domain of GRAS gene family in foxtail millet

2.4 SiGRAS的組織表達分析

為初步分析SiGRASs的功能，根據(jù)MDSi數(shù)據(jù)庫中不同組織轉錄組數(shù)據(jù)的每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的片段(fragments per kilobase, FPKM)，對52個SiGRASs組織表達特性進行了分析。結果表明，不同GRAS在谷子不同組織器官中的表達量存在明顯差異，SHR亞族中各基因均在根中有較高的表達量，DELLA亞族中的Seita.5G243400和Seita.9G123000在莖中有較高的表達量，LISCL亞族中的Seita.9G453600和Seita.5G377500、PAT1亞族的Seita.2G369400、HAM亞族中的Seita.4G003600和Seita.1G262900在葉中有較高的表達量。另外，本研究發(fā)現(xiàn)一類特殊現(xiàn)象，即42.3%的基因在各組織器官中表達量很低(圖3)，研究共檢測到22個這樣的基因，包括LISCL亞族中的Seita.3G066300、Seita.3G066400、Seita.3G066200、Seita.9G174600、Seita.9G174900、Seita.7G112100、Seita.3G380300、Seita.7G268200和Seita.7G268300；SCR亞族中的Seita.3G200500；DELLA亞族中的Seita.3G137200和Seita.8G129500；SCL3亞族中的Seita.7G317100、Seita.7G317000、Seita.8G026600、Seita.3G266500和Seita.3G266700；SHR亞族中的Seita.3G189300；HAM亞族中的Seita.7G294300、Seita.8G042700、Seita.9G455500和Seita.7G100800。

2.5 SiGRAS啟動子順式作用元件預測與分析

SiGRAS含有多種與植物生長發(fā)育相關的順式作用元件，如光反應、胚乳表達、分生組織表達、晝夜節(jié)律、細胞周期、多種植物激素以及與逆境相關的順式作用元件，表明SiGRAS廣泛參與谷子的生長發(fā)育。對激素以及與逆境相關的順式作用元件進行分析發(fā)現(xiàn)，其中43個SiGRAS含有響應脫落酸的ABRE元件、46個SiGRAS含有響應茉莉酸甲酯的CGTCA-motif或TGACG-motif元件、27個SiGRAS含有響應生長素的TGA-element或AuxRR-core元件、27個SiGRAS含有響應赤霉素的P-box、TATC-box或GARE-motif元件以及19個SiGRAS含有響應冷脅迫的LTR元件。

2.6 SiGRAS在不同激素和逆境下表達模式分析

圖3 GRAS基因在谷子不同組織和不同發(fā)育時期的表達模式分析Fig.3 Expression profile analysis of GRAS genes in different tissues and different developmental stages of foxtail millet

根據(jù)上述順式作用元件預測結果，選取33個SiGRAS，分別對其在IAA、MeJA、GA3、ABA、4℃和PEG-6000處理1、3、6和12 h后的表達模式進行了分析。結果表明，33個SiGRASs均響應激素和非生物脅迫，但表達水平不同。18個基因(包括Seita.3G066400、Seita.3G066200、Seita.8G250200、Seita.7G112100、Seita.3G380300、Seita.7G268300、Seita.1G273300、Seita.3G200500、Seita.5G418700、Seita.4G017100、Seita.8G026600、Seita.7G317000、Seita.3G266700、Seita.2G374000、Seita.3G189300、Seita.1G048800、Seita.4G219200和Seita.7G294300)雖然對各種激素和逆境有不同程度的響應，但是表達仍處于較低水平。因此，本試驗選取在不同激素和逆境處理下葉片中相對表達量較高的15個SiGRAS進行重點分析，PAT1亞族中Seita.2G369400對6種不同的處理響應最為敏感，而LISCL亞族Seita.9G453600 和HAM亞族Seita.4G003600對各種處理響應不明顯；在4℃脅迫下，大部分基因在處理1、3 h 后表達逐漸上調(diào)，但在6 h后表達量逐漸下降；在IAA處理下，大部分基因在處理1 h后表達量急劇下降，而在 6 h 后又有小幅回升，但仍低于對照的表達水平；在MeJA、GA3、ABA、4℃和PEG-6000處理下，除Seita.2G369400外，大部分基因在1 h的表達量輕微上調(diào)或維持不變，在3 h后表達量逐漸下降(圖4)。

圖4 不同激素和逆境脅迫下SiGRAS的相對表達量Fig.4 Relative expression of SiGRASs under different hormone and abiotic stress

對6種處理后6 h的基因相對表達量進行了分析，結果表明，與CK相比，在IAA處理下，Seita.9G174600顯著上調(diào)表達，大多數(shù)基因顯著下調(diào)表達，5個表達無顯著差異；在GA3、MeJA、ABA和PEG處理下，除Seita.4G003600外，其余均顯著下調(diào)表達；而在低溫脅迫下，Seita.5G377500、Seita.3G236000和Seita.9G576800顯著上調(diào)表達，而Seita.5G377500、Seita.5G243400和Seita.9G112200顯著下調(diào)表達。Seita.7G209700、Seita.2G369400、Seita.5G243400和Seita.5G450300在4種激素和2種脅迫下相比對照均顯著下調(diào)表達(圖5)。

注：*和**分別表示在P<0.05和P<0.01水平差異顯著。Note: * and ** mean significant difference at 0.05 and 0.01 level, respectively.圖5 15個GRAS基因在谷子激素和逆境脅迫處理6 h后的表達模式分析Fig.5 Expression profile analysis of 15 SiGRAS genes at 6 h after different hormones and abiotic stresses treatment

2.7 DELLA蛋白基因SiGRAS23分子標記開發(fā)

在前期矮寧黃×晉谷21號的F2群體定位的株高QTL區(qū)間基礎上，發(fā)現(xiàn)2個DELLA蛋白編碼基因SiGRAS23(Seita.5G243400)和SiGRAS26(Seita.5G418700)分別位于qPH5-2和qPH5-1區(qū)間內(nèi)或附近，分別擴增上述基因的序列(表2)。比對分析后發(fā)現(xiàn)，SiGRAS26在雙親中無差異位點，而SiGRAS23在雙親間存在7個差異位點，其中CDS區(qū)存在2個SNP，啟動子區(qū)存在3個SNP和2處InDel。根據(jù)這些差異位點，本研究開發(fā)了D8-1、D8-2和D8-3等3個分子標記，分別位于啟動子區(qū)-871 bp、啟動子區(qū)-349 bp、CDS區(qū)627 bp(圖6-A，表2)。利用開發(fā)的標記D8-1對190份AJF5(矮寧黃×晉谷21號)群體株系和37份株高差異較大的谷子材料進行基因型檢測，將矮寧黃基因型命名為D8-1-A，晉谷21號基因型命名為D8-1-J，雜合基因型命名為D8-1-A/J，結果表明，分子標記D8-1與AJF5(矮寧黃×晉谷21號)群體中株高緊密連鎖(P<0.01)(圖6-B)；在37份谷子親本材料中，矮88、矮97、石矮大-1等矮桿材料與矮寧黃基因型一致，D8-1-A基因型材料的株高與另外2種基因型材料的株高存在顯著差異，但D8-1-J基因型和D8-1-A/J基因型的材料間株高差異不顯著(圖6-C，附表S2)，表明該基因可能與株高遺傳相關，D8-1-A可能是谷子矮桿變異相關的基因型之一。

3 討論

在植物中GRAS基因家族編碼的轉錄因子數(shù)量眾多，功能多樣，參與調(diào)控許多重要生長發(fā)育過程。目前，該基因家族已經(jīng)在多個物種中被鑒定，如在擬南芥[26,54]、水稻[26]、大豆[36]、小麥[37]、高粱[27]、玉米[27]、短柄草[28]、大麥[38]、藜麥[39]、大白菜[40]、人參[41]、大麻[22]和胡桃[42]分別鑒定出34、56、117、153、80、86、48、59、54和52個GRAS家族成員。本研究從谷子全基因組數(shù)據(jù)庫中獲得了52個GRAS家族成員，與水稻、短柄草和藜麥等作物中的數(shù)量相似，96%蛋白均具有親水性，與前人結果一致[55]。根據(jù)進化樹分支，結合擬南芥、水稻、玉米、高粱和短柄草同源基因的分類方法，將谷子GRAS家族同樣分為10個亞類。

表2 DELLA蛋白基因SiGRAS23和SiGRAS26分段擴增引物及標記開發(fā)引物Table 2 Amplified primers and marker development primers of DELLA protein encoding gene SiGRAS23 and SiGRAS26

注：A圖：SiGRAS23在矮寧黃和晉谷21號間的序列差異和分子標記開發(fā)，不同數(shù)字代表距基因起始密碼子的位置，D8-1、D8-2、D8-3分別為開發(fā)的分子標記，A：矮寧黃，J：晉谷21號，A/J：雜合基因型；B圖：D8-1在AJF5群體株系中的基因型檢測；C圖：D8-1在37份材料中的基因型檢測。字母a和b表示不同等位變異間的顯著差異(P<0.01)。Note: Figure A: Sequence difference and molecular markers development between Aininghuang and Jingu 21. Different numbers represent the position from the start codon of the gene. D8-1, D8-2 and D8-3 are the developed molecular markers, respectively. A: Aininghuang. J: Jingu 21. A/J: the heterozygous genotype line. Figure B: Genotyping in lines of AJF5 with D8-1. Figure C: Genotyping in 367materials with D8-1. a and b indicate significant differences at 0.01 level.圖6 SiGRAS23在矮寧黃和晉谷21號間的序列差異和分子標記開發(fā)以及在不同材料中的基因型檢測Fig.6 Sequence difference and molecular markers development between Aininghuang and Jingu 21, and genotyping in materials of SiGRAS23

SiGRAS各亞家族基因的組織器官表達特性分析表明，谷子各亞族基因與擬南芥中已報道同類亞族基因的表達特性和相應功能基本一致。大多數(shù)谷子PAT亞家族基因在葉中表達量較高，而葉是感受光信號的主要部位，推測該類基因在谷子phyA的信號轉導中發(fā)揮作用；SHR蛋白參與根系徑向形態(tài)的維持和根系生長[56-57]。谷子SHR亞族中各基因均在根中有較高的表達量，其對根系發(fā)育的調(diào)控作用有待進一步研究；DELLA蛋白通過GA應答反應調(diào)控植物莖的伸長[1,3-4]。本研究中，Seita.5G243400和Seita.9G123000等DELLA亞族中的基因在莖中有較高的表達量，推測這些基因可能通過莖的生長發(fā)育來調(diào)控谷子株高等性狀。另外，谷子GRAS各亞族基因的組織表達特異性與水稻、短柄草、大豆中各亞族的組織表達特異性一致[26,28,36]。GRAS各亞類基因在不同物種中的保守表達譜表明，同源基因可能在這些特定的組織器官發(fā)育中發(fā)揮相同或相似的作用。

植物對各種激素和環(huán)境脅迫的應答中需要GRAS蛋白的參與[1-4,20-22]。本研究中，SiGRASs啟動子區(qū)域存在多個與激素或逆境響應相關的順式作用元件，經(jīng)生長素、赤霉素、茉莉酸甲酯、脫落酸、干旱和冷等6種不同的處理后發(fā)現(xiàn)，33個SiGRAS表達水平存在較大差異，在同一亞族成員之間也存在較明顯差異。在短柄草[28]、楊樹[35]、梅花[55]和番茄[58]GRAS同一亞族不同基因中也出現(xiàn)類似的結果，表明同一亞族各基因在非生物脅迫反應和激素介導的信號通路中的作用可能不同。另外，本研究中，谷子PAT1亞族中Seita.2G369400對6種不同的處理響應最為敏感，暗示該基因是谷子在激素響應和逆境脅迫中的一個重要基因。GRAS家族PAT1分支基因不僅在光敏色素信號轉導中發(fā)揮重要作用，也直接影響植物抗逆過程，該亞族中已報道的SlGRAS4[58]、AtGAI[59]和BdGRAS[60]等基因能積極響應低溫脅迫。DELLA蛋白是GA信號關鍵負向調(diào)節(jié)因子，本研究中的3個DELLA亞族基因Seita.5G243400、Seita.9G123000和Seita.5G418700在GA3處理后的3、6、12 h均表現(xiàn)為下降趨勢?；蚣易逋ǔＴ诨蚪M中具有多個拷貝，這些基因表現(xiàn)出功能冗余性和特異性，5個MIR172基因在調(diào)控植物分生組織大小、葉片下表皮毛起始、莖的伸長、側枝發(fā)生以及開花時間上具有冗余性[60]，推測本研究中表達量極低的基因也存在基因冗余，但還需大量試驗驗證。

DELLA蛋白是GAs代謝通路中的負調(diào)控因子，屬于植物特有的GRAS家族，調(diào)控植物生長發(fā)育，但其結構域相對復雜[1,3-4,34-38]。在擬南芥GRAS家族中共有5個DELLA蛋白，其N端均含有DELLA和VHYNP典型的結構域[26,54]，在水稻中，DELLA亞家族成員中僅有OsSLR1含有DELLA和VHYNP結構域，而與其同聚為DELLA亞族的OsSLRL1和OsSLRL2并不含有這2個結構域[61]，短柄草DELLA亞家族成員BdSLR1含有DELLA和VHYNP結構域而BdSLRL1不存在該結構域[28]，在玉米中也出現(xiàn)了類似現(xiàn)象，但這些蛋白均作為GA信號的阻遏蛋白調(diào)控植株的生長發(fā)育，過表達這些基因的植株均表現(xiàn)為矮化。在本研究中，谷子DELLA亞家族有5個基因，除Seita.9G123000中發(fā)現(xiàn)DELLA結構域，其余4個蛋白均未發(fā)現(xiàn)DELLA結構域，這與水稻[26,61]、短柄草[28]、藜麥[39]中GRAS家族DELLA亞族結果相似。目前，對該現(xiàn)象的解釋可能是，GRAS基因通過復制增加基因拷貝數(shù)，不同拷貝數(shù)導致基因序列發(fā)生改變，這些序列差異決定了功能特異的各種蛋白質(zhì)。在這種情況下，DELLA蛋白復制DELLA、TVHYNP和polyS/T/V等功能結構域序列。研究人員推測GRAS序列復制可能發(fā)生在單子葉植物和雙子葉植物分化之前，雙子葉植物中存在DELLA基因復制事件，而單子葉植物中不存在DELLA基因復制[61]。DELLA結構域的有無是否會影響谷子DELLA蛋白的功能，還有待下一步研究。

SiDWARF1(Seita.9G123000)編碼的DELLA蛋白，是目前谷子中唯一報道的GRAS家族基因，其突變體84133植株表現(xiàn)矮化[62]。本研究結合先前本課題組對谷子矮寧黃×晉谷21號F2分離群體株高性狀的QTL定位[53]，發(fā)現(xiàn)第V染色體與株高相關的QTL區(qū)間中包含2個編碼DELLA蛋白的基因(SiGRAS23和SiGRAS26)。目前已知，根據(jù)SiGRAS23變異位點開發(fā)的分子標記D8-1與AJF5群體株高性狀緊密連鎖，下一步本研究小組擬從株高性狀QTL的精細定位、克隆以及SiGRAS23基因功能驗證兩方面開展相關研究，以探明編碼DELLA蛋白的SiGRAS23基因與株高的關系。此外，谷子中常見的矮桿材料，如矮88、矮97和石矮大-1等基因型均為D8-1-A，但也有少數(shù)材料的基因型和株高表型不相符，如晉谷20號、東山谷、合光3號、六十天還家(見附表S2)。鑒于株高為數(shù)量性狀控制，推測這些材料中存在其他控制株高的主效基因或位點，有待于進一步發(fā)掘和利用。

4 結論

本研究對谷子GRAS基因家族進行了全基因組鑒定，共發(fā)現(xiàn)52個SiGRAS家族成員，可分為10個亞類。除第Ⅵ染色體上無GRAS基因外，其余8條染色體上均有SiGRASs分布，且具有典型的C端GRAS保守域和N端高度可變特異結構域。不同亞族基因表達具有明顯的組織表達特異性，不同程度地響應生長素、赤霉素、茉莉酸甲酯、脫落酸等激素以及干旱和冷等脅迫。進一步研究發(fā)現(xiàn)，DELLA亞族中的SiGRAS23在遺傳群體AJF5的雙親矮寧黃和晉谷21號間存在序列差異，據(jù)此開發(fā)的標記D8-1與該群體株高性狀緊密連鎖，D8-1-A可能是谷子矮桿的優(yōu)異等位變異之一。

表S1 qRT-PCR所用引物信息Table S1 Primers used for qRT-PCR

表S2 37份谷子材料信息Table S2 Profiles of 37 foxtail millet