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    谷子12 種黃酮類代謝物合成通路分析

    2020-07-09 02:57:12張麗玲郄倩茹羅韶凡牛文康朱喆標(biāo)高雨柔李旭凱韓淵懷
    關(guān)鍵詞:晉谷牛毛黃酮類

    張麗玲 ,郄倩茹 ,羅韶凡 ,牛文康 ,朱喆標(biāo) ,高雨柔 ,李旭凱 *,韓淵懷 *

    (1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山西太谷030801;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太谷030801)

    谷子屬于禾本科狗尾草屬,去皮后俗稱小米。谷子起源于我國(guó),種植歷史悠久,是重要的雜糧作物之一[1]。谷子具有抗旱、耐瘠、耐貯藏的優(yōu)點(diǎn),主要種植在我國(guó)內(nèi)蒙古、山西、河北等地[2,3]。谷子含豐富的蛋白質(zhì)、維生素B2、鈣、鐵等物質(zhì),營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高[4,5]?!侗静菥V目》多處記載:“粟米(小米)味咸淡,氣寒下滲,腎之谷也之,虛熱消渴泄痢,皆腎病也。滲利小便,所以泄腎邪也,故脾胃之病宜食之”;“養(yǎng)腎氣,去脾胃中熱,益氣”,說(shuō)明谷子具有藥食同源的功能。黃酮代謝物屬于植物次生代謝物中相對(duì)重要的一類代謝產(chǎn)物,其合成是通過(guò)查爾酮合成酶催化丙二酰輔酶A(malonyl-CoA)與4-香豆酰輔酶A,而后將基本的碳架結(jié)構(gòu)提供給三葉豆甙、花翠素3-O-葡萄糖苷、異槲皮甙、山奈酚 3-O-蕓香糖苷、野漆樹苷、黃腐醇等物質(zhì)。黃酮代謝物普遍存在于植物膳食中,尤以薔薇科(蘋果,梨)、蕓香科(橙、柚、柑、橘)、禾本科(麥、稻、玉米、高粱)等植物中含量較為豐富,具有抗氧化、抗炎、降血糖、清除自由基等多種生理活性[6,7]。茶葉中黃酮類物質(zhì)對(duì)心血管起保護(hù)作用,能夠降低心血管疾病的發(fā)病率[8]。有研究表明,蒲公英的抗氧化性與其花中所含的黃酮類物質(zhì)有關(guān)[9]。鄭楠楠等[10]對(duì)10 個(gè)品種谷子營(yíng)養(yǎng)及功能活性成分進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),張雜谷5 號(hào)中黃酮含量顯著高于晉谷21等其他品種,除此研究外,目前對(duì)晉谷21 的黃酮類次生代謝物的研究較少,分析其代謝通路對(duì)發(fā)掘谷子功能性黃酮類物質(zhì)及相關(guān)基因具有重要意義。

    1 材料和方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    晉谷21(山西名優(yōu)品種,JG21)、牛毛白(白色籽粒農(nóng)家種,NMB)、xiaomi(晉谷21 通過(guò)EMS 誘變后獲得的超早熟材料)的籽粒及葉片等組織材料。

    1.2 谷子轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的處理

    谷子的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室RNA-seq測(cè)序,將超早熟xiaomi(待發(fā)表)、牛毛白及晉谷21于2019 年播種于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)雜糧分子育種團(tuán)隊(duì)基地(山西省太谷縣,北緯 37°25′13″,東經(jīng) 112°35′26″)。超早熟 xiaomi,分別取萌發(fā)后 2 周的葉、出苗30 d 和80 d 的倒2 葉,授粉期的谷穗和抽穗2天后的谷穗,灌漿期的根、莖、旗葉及穗,以及培養(yǎng)3 d 后萌芽的種子;晉谷21 及牛毛白品種均只取S2、S4 兩個(gè)灌漿時(shí)期未成熟的籽粒。取樣后將所有樣品立即冷凍在液氮中,隨后根據(jù)制造商的說(shuō)明采用RNAprep 純植物試劑盒(天根生化科技有限公司)分離總RNA,送諾禾致源公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。所有的測(cè)序原始數(shù)據(jù)fastq 序列文件利用FastQC[11]對(duì)其進(jìn)行質(zhì)控。數(shù)據(jù)過(guò)濾采用Trimmomatic[12]軟件,得到 clean data。利用 HISAT2[13]軟件將 clean data 比對(duì)到谷子基因組,SAMtools[14]進(jìn)行 sam/bam 文件處理,featureCounts[15]獲得數(shù)據(jù)的reads 計(jì)數(shù),計(jì)算得到基因表達(dá)的TPM 值(transcripts per million)。

    1.3 黃酮類代謝物的提取與測(cè)定

    將谷子成熟后的籽粒冷凍干燥后利用高通量組織研磨器在30 Hz 條件下研磨1.5 min,稱取100 mg 研磨好的粉末于70%的甲醇溶液中提取,之后將其放入4 ℃的冰箱中過(guò)夜8 h 以上,期間震蕩3 次,以提高提取率。將樣品離心(轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1,10 min),吸 取 上 清 液 ,再 用 微 孔 濾 膜(0.22 μm pore size)過(guò)濾樣品,吸取 150 μL 于進(jìn)樣瓶中用于LC-MS/MS 分析。

    HPLC 條件和參數(shù):用于 LC-ESI-MS/MS 分析的儀器系統(tǒng)主要包括HPLC(Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM20A system,http://www. shimadzu. com. cn)和 MS(Applied Biosystems 4000 Q TRAP,http://www. appliedbiosystems. com.cn/),分析條件如下:shim-pack VP-ODS C18 色譜柱(pore size 5.0 μm,length 2×150 mm),0.1%乙酸的超純水水相),0.1%乙酸的乙腈有機(jī)相;洗脫梯度為:0 min 為 100∶0 V·V-1,20.0 min 為 5∶95V·V-1,22.0 min 為 5∶95 V·V-1,22.1 min 為 95∶5 V ·V-1,28.0 min 為 95∶5 V·V-1;流 速 為 0.25 mL·min-1;柱溫為 40 ℃;進(jìn)樣量為 5 μL。分離的樣品接著進(jìn)入ESI-QTRAP-MS,進(jìn)行質(zhì)譜分析。

    ESI-QTRAP-MS/MS 條件和參數(shù):ESI 源的電噴霧離子源溫度為500 ℃,IS 為5 500V,GSⅠ、GSⅡ以及 CUR 分別為 55 psi、60 psi 和 25 psi,CAD 設(shè)置為高。

    1.4 谷子黃酮類代謝物的分析

    根據(jù)晉谷21 及牛毛白灌漿后期籽粒的黃酮代謝組分析結(jié)果,結(jié)合已有代謝物信息,找到具有對(duì)人體有益的黃酮類物質(zhì)及其代謝通路上的酶基因編號(hào),將酶基因編號(hào)提交于至酶數(shù)據(jù)庫(kù)https://www. enzyme-database. org/[16],找出 其 在 其 他植物中的基因序列,之后用該基因序列在phytozome[17]數(shù)據(jù)庫(kù) Blast 谷子蛋白庫(kù),找到谷子代謝通路酶基因。將晉谷21 及牛毛白籽粒灌漿后期所測(cè)的代謝物含量及其酶基因表達(dá)量用Tbtools[18]進(jìn)行熱圖分析,繪制代謝通路圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 谷子黃酮類物質(zhì)代謝通路

    從圖1 可見(jiàn),代謝通路圖中有10 個(gè)關(guān)鍵基因,除異櫻花亭,其余5 個(gè)黃酮代謝物在晉谷21 中的含量要高于牛毛白。柚皮苷查爾酮是代謝通路中的第一個(gè)生成物,促使晉谷21 柚皮苷查爾酮含量高于牛毛白的關(guān)鍵基因有Seita. 9G142900、Seita. 8G139300;柚皮苷查爾酮通過(guò)E5.5.1.6 酶作用下生成柚皮苷,該過(guò)程中促使晉谷21 灌漿后期籽粒柚皮苷含量高于牛毛白的關(guān)鍵基因有Seita. 8G013300。之后柚皮苷分別在E2.1.1.231酶和E1.14.20.5 的作用下生成異櫻花亭和芹菜素,其中促使牛毛白灌漿后期籽粒異櫻花亭含量高于晉谷21、晉谷21 灌漿后期籽粒芹菜素含量高于牛毛白的關(guān)鍵基因分別是Seita. 1G045400;Seita. 3G026900、Seita. 9G342600、Seita. 9G561700;而后芹菜素經(jīng)由CYP75A 酶生成木犀草素,在此過(guò)程中使晉谷21 灌漿后期籽粒木犀草素含量高于牛毛白的關(guān)鍵基因有Seita. 9G393400;木犀草素在O-methyltransferase 酶的作用下生成金圣草(黃)素,促使晉谷21 灌漿后期籽粒金圣草(黃)素含量高于牛毛白的關(guān)鍵基因有Seita. 7G073700、Seita.9G374200。除此之外,從代謝通路圖中還可以看出:優(yōu)質(zhì)品種晉谷21 中多數(shù)基因的表達(dá)量顯著高于品質(zhì)較差的牛毛白,具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)脂肪等作用的柚皮苷查爾酮[19]和具降血脂、鎮(zhèn)靜、抗氧化、抗腫瘤的柚皮苷[20]是 6 個(gè)黃酮代謝物中含量較高的2 個(gè)物質(zhì)。

    圖1 相關(guān)物質(zhì)代謝通路圖Fig.1 The pathway of related substance

    2.2 三葉豆甙的生成

    三葉豆甙為黃酮醇類別的一種物質(zhì),由山奈酚通過(guò)E2.4.1.234 酶生成。從圖2 可以看出,晉谷21 的灌漿后期籽粒中該物質(zhì)的含量明顯高于牛毛白,從基因表達(dá)熱圖中可以看出各組織中低表達(dá)或不表達(dá)的基因較多,如Seita. 1G124800、Seita. 7G318900、Seita. 3G189600、Seita. 1G124900、Seita. 6G104300、Seita. 9G389900等 基 因 。Sei-ta. 1G125200除在旗葉、出苗 30 d 后的倒 2 葉與根中表達(dá)較高外,其余組織中表達(dá)都低;Seita. 1G041600基因在授粉期及灌漿期穗與旗葉中表達(dá)較高,其余組織中表達(dá)均低且相差無(wú)幾;Seita. 5G127500、Seita. 1G057100、Seita. 9G086800、Seita. 5G308400、Seita. 4G082500等基 因 表 達(dá)較高,其中Seita. 5G127500表達(dá)具有組織特異性,除在根中不表達(dá)外,在晉谷21 與牛毛白灌漿期籽粒中表達(dá)也較低,在其余組織中表達(dá)均較高;Seita. 1G057100在晉谷21 與牛毛白籽粒中表達(dá)顯著高于其他基因在籽粒中的表達(dá),且在晉谷21 中表達(dá)量明顯高于牛毛白。此外,Seita. 2G275500、Seita. 2G419800、Seita. 9G086800、Seita. 4G228200等4 個(gè)基因在晉谷21 灌漿后期籽粒的表達(dá)略高于牛毛白;Seita. 1G057100在晉谷21 中籽粒表達(dá)量明顯高于牛毛白,該基因可能是決定晉谷21 灌漿后期籽粒中三葉豆甙含量明顯高于牛毛白的主效基因。

    圖2 三葉豆甙的代謝圖與熱圖Fig.2 Metabolism and heatmap of trifolin

    2.3 花翠素3-O-葡萄糖苷的生成

    花翠素3-O-葡萄糖苷是由花翠素通過(guò)BZ1 酶生成的,由圖3 可以看出,其代謝物含量在晉谷21籽粒中略高于牛毛白,Seita. 8G192500、Seita.8G192600在各組織中表達(dá)均比較低;Seita. 2G324300、Seita. 4G043100、Seita. 8G117800、Sei-ta. 8G117700、Seita. 7G079000、Seita. 8G203200等在晉谷21 及牛毛白S2、S4 籽粒中表達(dá)較高,其中Seita. 8G203200與Seita. 8G117700具 有 組 織 特 異性,僅在根、灌漿期的莖稈中表達(dá)最高;Seita. 7G079000、Seita. 8G117800、Seita. 2G324300在晉谷21 灌漿后期的籽粒中表達(dá)高于牛毛白,其中Seita. 2G324300在晉谷21 灌漿后期的籽粒中表達(dá)顯著高于牛毛白,說(shuō)明Seita. 2G324300可能是晉谷21 籽粒中代謝物含量高于牛毛白的主效基因。

    圖3 花翠素3-O-葡萄糖苷的代謝圖和熱圖Fig.3 Metabolism and heatmap of mirtillin

    2.4 異槲皮甙的生成

    異槲皮甙是由槲皮素通過(guò)E2.4.1.91 酶生成的物質(zhì)。由圖4 可以看出,該代謝物在晉谷21 與牛毛白的籽粒中含量相差無(wú)幾。在該通路中,Seita. 9G269600、Seita. 5G308200、Seita. 5G308900、Seita. 2G351100、Seita. 8G154000、Seita. 2G276000等基因在各組織中表達(dá)均低;Seita. 2G324200是所有基因中表達(dá)最高的;Seita. 9G409500、Seita. 5G308500在根中表達(dá)具有特異性;Seita. 2G092900在灌漿期莖稈中表達(dá)具有特異性;Seita. 9G239700、Seita. 1G325500、Seita. 1G041500在灌漿期旗葉中表達(dá)具有特異性;Seita.5G309200在萌發(fā)2 周的葉及出苗后30 d 的倒2 葉中表達(dá)具有特異性;Seita. 2G324600在穗與旗葉中表達(dá)較高,其余組織中較低;Seita. 5G309300在萌發(fā)3 d的萌芽種子、灌漿期的穗與根中表達(dá)較高。該通路中大多數(shù)基因在晉谷21、牛毛白中表達(dá)相差不大,這可能導(dǎo)致了異槲皮甙在晉谷21 與牛毛白籽粒中含量相差無(wú)幾。

    2.5 黃腐醇的生成

    黃腐醇是由去甲黃腐醇通過(guò)OMT1 酶生成的一種物質(zhì)。由圖5 可以看出,牛毛白的黃腐醇含量明顯高于晉谷21。Seita. 8G108400、Seita. 6G088200、Seita. 8G110100在根中表達(dá)具有特異性;Seita. 6G055900在各組織中表達(dá)最高,且其在抽穗后2 d及授粉期的穗中表達(dá)最高;Seita.8G203300在發(fā)芽3 d 的種子中具有特異性;Seita. 1G372500、Seita. 7G022900、Seita. 8G210100表達(dá)較高,其中Seita. 8G210100在牛毛白灌漿后期的籽粒中表達(dá)高于晉谷21,可能是牛毛白中黃腐醇含量顯著高于晉谷21 的主效基因。

    2.6 芹菜素7-O-新橘皮糖苷的生成

    圖4 異槲皮甙的代謝圖和熱圖Fig.4 Metabolism and heatmap of isotrifoliin

    芹菜素7-O-新橘皮糖苷又稱野漆樹苷,是由芹菜素-7-O-葡糖苷通過(guò)C12RT1 酶生成的一種物質(zhì),由圖6 可以看出,牛毛白中該代謝物含量高于晉 谷 21。Seita. 1G041700、Seita. 2G324400、Seita. 8G134800、Seita. 5G124200、Seita. 4G045200、Seita. 7G194300、Seita. 2G324500、Seita. 3G287700、Seita. 7G264500、Seita. 7G171900等多個(gè)基因在除籽粒外的其余組織中表達(dá)較高;Seita. 7G031700、Seita. 1G304200、Seita. 2G192900、Seita. 7G139300、Seita. 6G191600、Seita. 7G171800等基因在各組織表達(dá)均最 低 ;Seita. 8G196100、Seita. 2G076300、Seita. 2G050100在根中表達(dá)較高;Seita. 2G179100在灌漿期的莖稈中表達(dá)具有特異性;Seita. 7G159300在葉、倒2 葉中不表達(dá),在其余組織中表達(dá)較高;Seita. 2G076100在葉中表達(dá)最低;Seita. 9G493900在抽穗后2 d 的穗中表達(dá)較高;Seita. 4G127300在抽穗后2 d 及授粉期的穗及莖稈中表達(dá)具有組織特異性;Seita. 7G194900在萌發(fā)3 d 的萌芽種子中表達(dá)具有特異性;Seita. 2G427700、Seita. 9G542000、Seita. 7G194700在牛毛白灌漿后期籽粒的表達(dá)量比晉谷21 高,其中Seita.9G542000最顯著,說(shuō)明這可能是牛毛白中該代謝物含量高于晉谷21 的主效基因。

    2.7 山奈酚3-O-蕓香糖苷的生成

    圖6 野漆樹苷的代謝圖和熱圖Fig.6 Metabolism and heatmap of rhoifolin

    山奈酚3-O-蕓香糖苷是由紫云英苷通過(guò)FG2酶來(lái)生成的。由圖7 可以看出,該物質(zhì)在牛毛白中含量顯著高于晉谷21。從圖中可以看出,Seita. 2G222400、Seita. 3G189800、Seita. 3G189900、Seita. 4G177600、Seita. 5G392600、Seita. 8G192600、Seita. 9G095800等基因在組織中表達(dá)最低。Seita. 6G165400、Seita. 2G102600、Seita. 8G203200在根中表達(dá)具有組織特異性;Seita. 2G076000在根與莖稈中表達(dá)較高;Seita. 9G163100在2 周的葉及倒2 葉中表達(dá)具有特異性;Seita. 5G124300在旗葉中具有組織特異性;Seita. 3G190000在出苗30 d的倒 2 葉中表達(dá)較高;Seita. 9G125900除在 2 周葉及出苗30 d 的倒2 葉中表達(dá)較高外,在牛毛白灌漿后期籽粒中表達(dá)高于晉谷21,推測(cè)Seita. 9G125900可能是該物質(zhì)在牛毛白中含量顯著高于晉谷21 的主效基因。

    3 討論與結(jié)論

    黃酮類物質(zhì)對(duì)于緩解人類疾病具有明顯作用,研究谷子中的黃酮類物質(zhì)至關(guān)重要。本研究對(duì)谷子14 份籽粒及葉片等組織材料的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析,對(duì)晉谷21 及牛毛白灌漿后期籽粒黃酮代謝物及酶基因熱圖進(jìn)行了分析,結(jié)果表明在黃酮代謝通路中有15個(gè)關(guān)鍵基因,分別為Seita. 1G057100、Seita. 2G324300、Seita. 9G125900、Seita. 9G542000、Seita. 8G210100、Seita. 9G142900、Seita. 8G139300、Seita. 8G013300、Seita. 1G045400、Seita. 3G026900、Seita. 9G342600、Seita. 9G561700、Seita. 9G393400、Seita. 7G073700、Seita. 9G374200,其中有 9 個(gè)關(guān)鍵基因促使7 個(gè)黃酮類物質(zhì)在晉谷21 中含量高于牛毛白,有6 個(gè)關(guān)鍵基因促使4 個(gè)黃酮類物質(zhì)在牛毛白中含量高于晉谷21。黃酮代謝物中柚皮苷查爾酮、柚皮苷是含量最高的黃酮代謝物,其中柚皮苷查爾酮具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)脂肪和性激素代謝的作用,柚皮苷具有降血脂、鎮(zhèn)靜、抗氧化、抗腫瘤、抗真菌、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用,推測(cè)這2 種物質(zhì)可能是影響谷子養(yǎng)胃的重要代謝物。在栽培品種晉谷21 中,山奈酚3-O-蕓香糖苷等黃酮類物質(zhì)的含量顯著低于農(nóng)家種牛毛白。有研究表明將光敏核不育系 A2(PTGMS A2)分別與張雜谷 3、5、6、13 號(hào)、敦煌2 號(hào)雜交產(chǎn)生的后代葉片進(jìn)行代謝組分析,發(fā)現(xiàn)葉片中含107 種黃酮類物質(zhì)且過(guò)量積累,主要以糖基化形式存在。不同谷子品種雜交后對(duì)其后代進(jìn)行綜合代謝分析,將有助于開發(fā)雜交表現(xiàn)的預(yù)測(cè)模型,并實(shí)現(xiàn)谷子的遺傳育種目標(biāo)[21]。鑒于山奈酚3-O-蕓香糖苷等黃酮類物質(zhì)重要的藥用功能,在未來(lái)分子品質(zhì)育種中,可通過(guò)適當(dāng)提高該物質(zhì)在栽培品種中的含量,提高谷子中的功能性成分,為谷子功能農(nóng)業(yè)與發(fā)展提供參考依據(jù)。

    圖7 山奈酚3-O-蕓香糖苷的代謝圖和熱圖Fig.7 Metabolism and heatmap of nicotiflorin

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