谷子種子高質(zhì)量總RNA提取方法的優(yōu)化

王金榮 許冰霞 尹美強 溫銀元

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山西 太谷 030801)

谷子[Setaria italica(L.) Beauv]屬禾本科(Gramineae)植物,谷粒含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪和維生素[1],營養(yǎng)價值很高[2-3]。隨著人們生活方式的改變,市場上對谷子的需求不斷增加[4]。種子活力的保持和萌發(fā)成苗決定著植物種類的繁衍和生存能力以及生態(tài)系統(tǒng)的建成,更直接影響作物的產(chǎn)量,而種子萌發(fā)被認為是植物生活周期中最重要和最脆弱的階段[5],因此研究種子萌發(fā)的分子機制有助于提高作物的產(chǎn)量,具有重要的經(jīng)濟和生態(tài)意義[6-7]。從植物種子中提取純度高、完整性好的RNA是進行基因動態(tài)表達、cDNA 合成、RNA 序列分析、基因克隆、構(gòu)建cDNA 文庫、體外翻譯等分子生物學(xué)試驗的前提[8]。但谷子中含有較多的蛋白質(zhì)、多糖和脂質(zhì),這些物質(zhì)會干擾或降解RNA,從而影響RNA的產(chǎn)量和質(zhì)量[9-11]。其中,多糖表現(xiàn)出與RNA 相似的物理化學(xué)性質(zhì),并與RNA提取物共沉淀[12]。蛋白質(zhì)和脂類也會干擾RNA 分離提取,干擾反轉(zhuǎn)錄酶- 聚合酶鏈鎖反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR),從而影響基因表達研究[13]。

從植物中提取總RNA的方法有很多,主要包括Trizol 法[14]、NAiso Plus 法、SDS 法[15]、異硫氰酸胍法[16]、CTAB 法[17-18]等,但由于植物之間及同一植物不同組織之間的差異,所需的RNA提取方法也不同[19-21]。目前已有報道從蓖麻[8]、甘藍[10]、花生[11]等植物種子中提取出高質(zhì)量的RNA,但從谷子中提取RNA的有效方法鮮見報道。本試驗以晉谷42、晉谷45、晉谷21、晉谷28、張雜13為材料,通過對現(xiàn)有的RNA提取技術(shù)進行結(jié)合和改進,同時與NAiso Plus法、CTAB 法進行比較,旨在找出一種能夠簡單、快速的從谷子干種子中提取出高質(zhì)量RNA的方法,為谷子萌發(fā)相關(guān)的后續(xù)分子生物學(xué)試驗奠定基礎(chǔ)并為其他禾谷類作物種子的RNA提取提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料及前處理試驗 試驗材料為晉谷42、晉谷45、晉谷21、晉谷28、張雜13,由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生理實驗室提供。

挑選成熟飽滿大小均一且谷殼完好無病蟲害的5個谷子品種種子,用0.1% HgCl2浸泡消毒10 min,蒸餾水沖洗5～6次[22-23],晾干后用于提取谷子種子總RNA。以晉谷42、晉谷45為萌發(fā)材料,消毒后的谷子在蒸餾水中萌發(fā),溫度為25℃,相對濕度為60%,分別于萌發(fā)6、10、18、24、36、48 h時取萌發(fā)種子,直接置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?用于提取不同萌發(fā)期谷子的總RNA。

1.1.2 主要試劑 RNAiso Plus 試劑,寶生物工程(大連)有限公司;HCl,成都科龍化工試劑廠;Tris,美國Camycal公司;1%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP),美國Camycal公司;2%β-巰基乙醇,上海振品化工有限公司;溴化十六烷基三甲銨(cetyltrimethyl ammonium bromide,CTAB),美國Camycal公司;乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA),美國Camycal公司;NaCl,天津凱通化學(xué)試劑有限公司;亞精胺(spermidine),上海恒遠生物科技有限公司。

RNA提取緩沖液:100 mmol·L-1Tris-HCl(pH值9.0)、1%(w/v)PVP,使用前加入2%β-巰基乙醇。

CTAB 提取液:2%(w/v)CTAB、2%(w/v)PVP、25 mmol·L-1EDTA、100 mmol·L-1Tris-HCl(pH值8.0)、2 mol·L-1NaCl、0.5 g·L-1亞精胺,滅菌,使用前加入2%β-巰基乙醇。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNAiso Plus 法 按照RNA提取試劑(RNAiso Plus)的操作流程提取谷子的總RNA。

1.2.2 改良RNAiso Plus 法 參照RNAiso Plus 法,并略作修改。每0.1 g 液氮研磨的材料中加入0.7 mL的RNA提取緩沖液,混勻靜置15 min,4℃、12 000×g條件下離心10 min,保留上清液;取上清液加入1 mL的RNAiso Plus,混勻室溫靜置10 min,然后于4℃、12 000×g條件下離心5 min,所得上清液中再加入氯仿(1/5 體積RNAiso Plus)并混合均勻,室溫靜置5 min,4℃、12 000×g條件下離心15 min,保留上層溶液;將上層溶液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中,加入等體積的異丙醇,充分混勻后在室溫靜置10 min,4℃、12 000×g條件下離心10 min,棄上清液,加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀后室溫干燥,最后加入30 μL RNase-free 水溶解,并置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 CTAB 法 參照陶倩等[24]的方法。

1.2.4 RNA 完整性的檢測 取4 μL 總RNA提取產(chǎn)物,利用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳,電壓為220 Ⅴ,電泳30 min。在Universal Hood Ⅱ凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)上觀察RNA 電泳條帶,初步分析RNA提取物的清晰度和完整性。

1.2.5 RNA 純度的檢測 取1 μL 總RNA提取產(chǎn)物,以RNase-free 水為空白對照,在BioDrop 上檢測RNA的質(zhì)量和濃度。

1.2.6 RT-PCR檢測 以改良RNAiso Plus 法提取的5個谷子品種的總 RNA,參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript? RT Reagent Kit With gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄說明書[寶生物工程(大連)有限公司]進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以合成的cDNA為模板,根據(jù)谷子actin基因設(shè)計引物并進行擴增,上游引物:5′-TGCTCAGTGGAGG CTCAACA-3′;下游引物:5′-CCAGACACTGTACTTGCG CTC-3′,擴增體系為10 μL,包括10×PCR Buffer 1 μL,TaKaPa Tap 0.05 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)0.8 μL,cDNA(0.1 μg·μL-1) 1 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL,ddH2O 5.15 μL。擴增程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,55℃復(fù)性30 s,72℃延伸1 min,共30次循環(huán);72℃延伸10 min。反應(yīng)完成后,用1%瓊脂糖凝膠電泳30 min,用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳條帶并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子種子總RNA的三種提取方法對比分析

由圖1可知,RNAiso Plus 法、改良RNAiso Plus 法和CTAB 法均能從晉谷42、晉谷45 中提取出總RNA,28S、18S和5S條帶均清晰可見,且28S均比18S 亮,條帶也未見彌散現(xiàn)象,說明這3種方法提取的總RNA均沒有明顯的降解現(xiàn)象且比較完整。此外,改良RNAiso Plus 法提取的RNA 28S和18S條帶的亮度和清晰度優(yōu)于其他2種方法,且28S的亮度約為18S的2倍,說明改良RNAiso Plus 法提取的總RNA 質(zhì)量和完整性較RNAiso Plus 法和CTAB 法好。

由表1可知,用RNAiso Plus 法和CTAB 法提取的晉谷42、晉谷45的總RNA 濃度相近,晉谷42 總RNA的濃度為237.1～252.0 μg·mL-1,晉谷45 總RNA的濃度為303.7～358.5 μg·mL-1,用改良RNAiso Plus 法提取的晉谷42 總RNA 濃度為443.9 μg·mL-1,晉谷45 總RNA 濃度為416.7 μg·mL-1,明顯高于RNAiso Plus 法和CTAB 法提取的總RNA 濃度。理論上RNA的A260/A280值為2,高質(zhì)量RNA的A260/A280值應(yīng)介于1.8～2.0 之間[25];A260/A280值超過2.0 則RNA 有降解或含有高鹽等雜質(zhì)的污染,A260/A280值低于1.8 則有蛋白或苯酚存在[26]。RNAiso Plus 法提取的晉谷42總RNA的A260/A280值為1.848,質(zhì)量和純度相對較好,而晉谷45 總RNA的A260/A280值低于1.8,說明RNA中含有蛋白質(zhì)或苯酚;CTAB 法提取的晉谷42、晉谷45 總RNA的A260/A280值均大于2.0,所以RNA可能有輕微的降解或有高鹽等雜質(zhì)的污染;而改良RNAiso Plus 法提取的晉谷42 總RNA的A260/A280值為1.949、晉谷45 總RNA的A260/A280值為1.908,表明改良RNAiso Plus 法提取的RNA 純度更高,質(zhì)量更好。

圖1 谷子總RNA 凝膠電泳圖Fig.1 Total RNA gel electrophoresisof millet

表1 谷子干種子總RNA 純度分析Table1 Purity analysis of total RNA extracted from dry millet seeds

2.2 改良RNAiso Plus 法提取不同品種谷子干種子總RNA分析

采用改良RNAiso Plus 法提取晉谷42、晉谷45、晉谷21、晉谷28、張雜13 干種子的總RNA。由圖2可知,晉谷28 總RNA的5S條帶稍亮,有輕微的降解,但總體來看,5個谷子品種的總RNA 圖像全部有清晰條帶,28S 亮度最高,18S次之,5S 亮度最不明顯,表明改良RNAiso Plus 法提取的這5個谷子品種的RNA 質(zhì)量和完整性良好。

改良RNAiso Plus 法從晉谷21、晉谷28、張雜13中提取的總RNA 濃度分別為344.8、320.1、444.2 μg·mL-1,且A260/A280值均在1.8～2.0 之間(表2),說明這些總RNA的純度和質(zhì)量良好。

此外,用改良RNAiso Plus 法提取的5種干種子總RNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后,用PCR 擴增actin基因片段,進一步檢測所提取的RNA是否可以用于后續(xù)研究。由圖3可知,5個谷子品種的總RNA均可擴增出單一產(chǎn)物,且?guī)颓逦?說明改良RNAiso Plus 法提取的RNA 能用于RT-PCR 反應(yīng)等以RNA為基礎(chǔ)的研究分析。

圖2 改良RNAiso Plus 法提取的谷子干種子總RNA 凝膠電泳圖Fig.2 Total RNA gel electrophoresis of dry millet seeds extracted by modified RNAiso Plus method

表2 改良RNAiso Plus 法提取的谷子干種子總RNA 純度分析Table2 Purity analysis of total RNA extracted from different varieties of dry millet seeds by modified RNAiso plus method

圖3 改良RNAiso Plus 法cDNA 擴增結(jié)果Fig.3 Results of cDNA amplification by modified RNAiso Plus method

2.3 改良RNAiso Plus 法提取谷子不同萌發(fā)期總RNA分析

由圖4可知,改良RNAiso Plus 法提取的晉谷42、晉谷45 萌發(fā)6、10、18、24、36、48 h時的總RNA,所有條帶均清晰可見,且未見拖帶彌散現(xiàn)象,各條帶中均為28S 最亮,其次是18S,5S 最模糊,說明采用改良RNAiso Plus 法提取的晉谷42、晉谷45 不同萌發(fā)期的RNA均完整性好,未發(fā)生降解。

由表3可知,用改良RNAiso Plus 法從晉谷42 不同萌發(fā)時間提取的總RNA 濃度在290～542 μg·mL-1之間,晉谷45 不同萌發(fā)時間提取的總RNA 濃度在450～590 μg·mL-1之間,2個品種的A260/A280值均在1.8～2.0 之間,說明這些RNA的純度高。

用改良RNAiso Plus 法提取的晉谷42、晉谷45總RNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA,用PCR 擴增actin基因片段,以檢測所提取的RNA是否可以用于后續(xù)研究。由圖5可知,晉谷42、晉谷45 不同萌發(fā)時期的總RNA均可擴增出單一產(chǎn)物,且?guī)颓逦?說明該方法提取的RNA 能用于RT-PCR 反應(yīng)等以RNA為基礎(chǔ)的研究分析。

表3 改良RNAiso Plus 法提取的谷子不同萌發(fā)期總RNA 純度分析Table3 Analysis of total RNA purity of millet extracted by modified RNAiso Plus method at different germination time

圖4 改良RNAiso Plus 法提取的谷子不同萌發(fā)總RNA 凝膠電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of total RNA gel extracted by modified RNAiso Plus method

圖5 不同萌發(fā)時間的谷子總RNA的cDNA 擴增結(jié)果Fig.5 CDNA amplification of total RNA of millet at different germination times

3 討論

提取高質(zhì)量、完整性好的RNA是分子生物學(xué)試驗的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)[27],但是在提取過程中微量的RNA酶就會使RNA 降解,磨樣時組織的破碎程度,組織中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多酚等物質(zhì)的含量也會嚴重影響RNA的提取質(zhì)量[28],進而影響下游的試驗操作。谷子種子中含有豐富的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和酚類等物質(zhì),干擾了RNA的提取,而常用的RNA提取方法難以除掉谷子中的雜質(zhì)。本試驗先采用了3種方法提取谷子種子總RNA,其中,RNAiso Plus 法簡單快速,但谷子中蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖類等物質(zhì)較多,此方法除不干凈,容易有蛋白質(zhì)殘留;CTAB 法能去除蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等物質(zhì),但其步驟繁瑣,用時較長,導(dǎo)致RNA 在提取過程中容易降解并且會有試劑殘留,影響RNA 質(zhì)量;改良RNAiso Plus 法提取的RNA 質(zhì)量、純度和濃度明顯優(yōu)于其他2種方法,且步驟簡單,用時較短。之后用改良RNAiso Plus 法提取晉谷21、晉谷28、張雜13的干種子總RNA,并提取晉谷42和晉谷45 萌發(fā)期的總RNA,發(fā)現(xiàn)提取的總RNA 完整性、濃度和質(zhì)量良好,并對改良RNAiso Plus 法提取的5個谷子品種和不同萌發(fā)期的總RNA進行RT-PCR檢測,發(fā)現(xiàn)所有RNA均可擴增出單一產(chǎn)物且條帶清晰,說明采用改良RNAiso Plus法提取的谷子總RNA 質(zhì)量良好,可用于后續(xù)的分子生物學(xué)試驗。

本試驗在前人研究[8,13]的基礎(chǔ)上對RNAiso Plus法進行改良,改良緩沖液中含有PVP和β-巰基乙醇。PVP 具有較強的結(jié)合酚類化合物的能力,能與多酚形成穩(wěn)定的復(fù)合物,將酚從核酸中游離,PVP和β-巰基乙醇可防止酚類化合物氧化,有效降低了酚類物質(zhì)的影響[29-30]。β-巰基乙醇還可促進核蛋白復(fù)合體的解離,將RNA 釋放到溶液中;且這些成分作為還原劑在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用,所以改良RNAiso Plus 法提取的RNA 純度更高。采用CTAB 法可從水稻、豌豆和蓮霧等種子中成功提取到高質(zhì)量的RNA[31-32],但較難在谷子種子里提取成功,容易出現(xiàn)降解,凝膠電泳時經(jīng)常會出現(xiàn)拖帶現(xiàn)象,所以在提取RNA時,應(yīng)對不同的植物做適當調(diào)整。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,RNAiso Plus 法提取的谷子RNA中有蛋白質(zhì)殘留,影響了RNA 質(zhì)量;CTAB 法提取時間較長且步驟繁瑣,容易使谷子RNA 降解;改良RNAiso Plus 法提取谷子RNA 完整性好、濃度和質(zhì)量高,步驟簡單,用時相對較短等優(yōu)點,且適用于多個谷子品種,可以推廣應(yīng)用于谷子萌發(fā)期和不同品種谷子總RNA的提取。