血管軟化丸抑制血管炎癥反應(yīng)防治動脈粥樣硬化的分子機制

秦合偉 牛雨晴 宋雪梅 王夢楠 孫孟艷

河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院康復(fù)科（鄭州 450002）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是冠狀動脈粥樣硬化心臟病的主要病理基礎(chǔ)，過度的慢性炎癥反應(yīng)貫穿AS 病理全程［1］，臨床研究尋找抑制炎癥反應(yīng)的靶點和藥物是研究重點和難點［2］。研究者發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA?TGFB2?OT1（lncRNA?TGFB2?OT1）是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子，lncRNA?TGFB2?OT1 在AS 病變VEC 中呈現(xiàn)高 表 達，敲低lncRNA?TGFB2?OT1 時，能夠抑制主動脈血管的脂質(zhì)積累，抑制血管內(nèi)皮的炎癥反應(yīng)，進而抑制了AS 的發(fā)生發(fā)展［3］。課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方血管軟化丸具有明顯的抑制炎癥反應(yīng)和防治AS的作用［4-8］，但具體作用機制不確定，本研究旨在觀察中藥復(fù)方血管軟化丸防治AS 的機制是否通過靶向調(diào)控lncRNA?TGFB2?OT1 抑制miRNA4459，進而抑制LARP1/SQSTM1/CASP1/IL1B 炎癥信號通路活化，降低ICAM?1、VCAM?1、IL?8 和MCP?1 表達水平，抑制炎癥反應(yīng)產(chǎn)生效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級健康雄性ApoE-/-小鼠75只，體質(zhì)量（20 ± 2）g，購自北京維通利華公司［動物許可證號：SCXK（京）2016?0006］。飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院動物實驗中心［試驗單位使用動物許可證號：SCXK（豫）2016?0009］，（22± 1）℃恒溫、60%～75%恒濕、12 h 循環(huán)照明，自由攝食、飲水。經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院動物實驗倫理委員會審核通過，本實驗設(shè)計方案符合安全性和公平性原則，符合國家對醫(yī)學(xué)實驗動物的有關(guān)要求［5］，倫理審核批準標號：20210263。

1.2 實驗藥物本研究所用血管軟化丸組成：山楂30 g、陳皮12 g、清半夏10 g、黃芪30 g、丹參12 g、三七12 g、萊菔子15 g。方中所有中藥均來源于河南省中醫(yī)院藥劑科。按照“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”換算成中等劑量：43.2 g/kg，分別相當于60 kg 成人臨床用量等效量的11.6 倍，醫(yī)院煎藥房按照要求煎煮成生藥含量為：1.738 g/mL。

1.3 造模與給藥ApoE-/-小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后給予全程高脂飼料（含玉米淀粉23.51%、酪蛋白22.18%、可可脂17.19%、蔗糖12.53%，麥芽糊精7.87%，纖維素5.54%，大豆油2.77%，檸檬酸鉀1.83%，磷酸鈣1.44%，膽固醇1.25%，維生素預(yù)混料1.11%，礦物質(zhì)預(yù)混料1.11%，碳酸鈣0.61%，膽酸鈉0.50%，胱氨酸0.33%，膽堿0.22%）喂養(yǎng)，隨機分為5 組，每組15 只；飼養(yǎng)8 周造模成功（每組隨機抽取1 只小鼠，經(jīng)過HE 染色發(fā)現(xiàn)主動脈壁有斑塊形成則為造模成功）后開始干預(yù)。

（1）模型對照組：0.9%生理鹽水43.2 g/（kg·d）；（2）TGFB2?OT1 inhibitor組：采用ApoE-/-小鼠造模后給予每只小鼠尾靜脈注射200 μL（2 × 108TU/mL）慢病毒LV?TGFB2?OT1?RNAi；（3）NC（陰性對照）組：采用ApoE-/-小鼠造模后給予給予轉(zhuǎn)染空載慢病毒；（4）血管軟化丸組：給予血管軟化丸43.2 g/（kg·d）；（5）聯(lián)合組（TGFB2?OT1 inhibitor+血管軟化丸組）：給予慢病毒LV?TGFB2?OT1?RNAi 和血管軟化丸43.2 g/（kg·d）。

1.4 標本采集動物造模鑒定時每組各處死1 只小鼠，實驗過程中因撕咬致死和灌胃致死8 只，采用偏度?峰度檢驗法來判斷離群值，剔除離群值，最后各組進入統(tǒng)計的小鼠均為11 只［8］。各組每日干預(yù)一次，全程高脂飼養(yǎng)，連續(xù)干預(yù)8 周后取材進行檢測。禁食12 h后摘眼球取血，檢測血脂和血清炎性因子水平，取胸腹全長主動脈，一部分主動脈固定于4%福爾馬林溶液中，用于HE 染色和免疫組化；一部分置于-80 ℃凍存用于相關(guān)指標檢測。

1.5 檢測指標

1.5.1 血脂分析采用生化檢測儀檢測各組小鼠血脂四項：TC、TG、HDL?C 和LDL?C。

1.5.2 病理學(xué)觀察收集各組小鼠全主動脈用于組織學(xué)檢查，采用蘇木精?伊紅染色，通過光學(xué)顯微鏡檢查載玻片并拍照，放大200 倍拍攝圖像。測量指標包括：管腔面積（LA）、血管內(nèi)膜厚度（IMT）、斑塊面積（PA）、脂質(zhì)中心面積（LCA）。

1.5.3 采用免疫組化法檢測主動脈病理結(jié)構(gòu)改變和TGFB2?OT1 蛋白表達水平取石蠟包埋處理后的主動脈切片，按照實驗流程進行［5］，鏡檢及照像切片用中性樹膠封片后，顯微鏡下觀察結(jié)果。細胞核被染成藍紫色，陽性信號為棕黃色或棕褐色；結(jié)果采用美國Keyence 公司的圖像處理和分析軟件BZ8000 analysis 進行光密度分析。

1.5.4 采用雙染免疫熒光技術(shù)觀察TGFB2?OT1分布情況和熒光強度采用anti?TGFB2?OT1（綠色）抗體對冰凍組織切片進行免疫熒光染色，CD31（紅色）標記內(nèi)皮層，采用激光共聚焦檢測TGFB2?OT1 分布情 況，采用Zeiss LSM700，ZEN 2010 軟件分析TGFB2?OT1 熒光強度。

1.5.5 ELISA 法檢測外周血清炎性因子水平收集各組小鼠血清，采用ELISA 法按試劑盒說明書檢測血清中ICAM?1、VCAM?1、IL?8 和MCP?1 等炎性因子水平。

1.5.6 Real?time PCR法檢測主動脈TGFB2?OT1、miRNA4459、LARP1、SQSTM1 的mRNA 表達水平取主動脈標本，提取總RNA，將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 模板，將熒光染料SYBR Green 和目的基因與內(nèi)參GADPH 的引物混勻后，上機檢測［4］，在BIO?RAD Real?Time PCR 儀上進行實時熒光定量PCR，按照2-ΔΔCT計算目的基因的相對表達量［7］。引物序列：TGFB2?OT1 上游引物：5'?CCGGTACCAAC?TACTTCGTCG?3'，下游引物：5'?GCTTACCGAGGC?GTACCAGCA?3'；MIR4459 上游引物：5'?GCGTATT?TCATTACTCGTCG?3'，下游引物：5'?CAGGGGCGA?GGCAGCA?3'；LARP1 上游引物：5'?GCGTCAATGT?GATTCTGTTG?3'，下游引物：5'?GCTGCGTTGGTC?GACCAGGCT?3'；SQSTM1 上游引物：5'?AACAGC?GATCGTGTGGATTG?3'，下游引物：5'?GCTGCG?GTTGTGTTAGGAGTCGGCT?3'；GAPDH 上游引物：5'?AACACGGCGCTGTCAATATC?3'，下游引物：5'?GGAGTCTAGCATCATGTTTCCA?3'。

1.5.7 Western blot 法檢測主動脈TGFB2?OT1、CASP1、IL1B 蛋白水平取主動脈標本，提取蛋白，采用BCA蛋白定量法，電泳，分離，轉(zhuǎn)膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，用相應(yīng)的一抗，孵育，4 ℃過夜，洗滌后標記二抗雜交。采用化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測，使用Image Lab 4.1 圖像分析軟件檢測TGFB2?OT1、CASP1、IL1B 印跡條帶凈吸光度值，以β?actin內(nèi)參照，結(jié)果以樣本灰度值/內(nèi)參照灰度值表示［5］。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法所得數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析，計量資料以（）表示，采用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血脂水平比較干預(yù)后，與模型組相比，血管軟化丸組血清TC、TAG 和LDL?C 水平明顯較低（均P< 0.05），與血管軟化丸組相比，聯(lián)合組血清TC、TAG 和LDL?C 水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表1 各組小鼠血脂水平比較Tab.1 Comparison of blood lipid levels of mice in each group ±s

表1 各組小鼠血脂水平比較Tab.1 Comparison of blood lipid levels of mice in each group ±s

注：與模型組比較，*P<0.05

組別模型組TGFB2-OT1 inhibitor 組NC 組血管軟化丸組聯(lián)合組F 值P 值n 11 11 11 11 11 TC（mmol/L）16.215±1.753 16.192±3.285 16.189±3.072 6.897±0.712*6.906±0.721*47.134<0.001 TG（mmol/L）12.947±2.851 12.941±2.341 12.981±2.466 2.695±0.306*2.701±0.261*36.052<0.001 LDL?C（mmol/L）6.519±0.714 6.489±0.805 6.498±0.756 2.401±0.215*2.391±0.273*45.036<0.001 HDL?C（mmol/L）1.130±0.265 1.129±0.259 1.131±0.233 2.894±0.306*2.900±0.397*50.261<0.001

2.2 各組小鼠主動脈病理學(xué)檢測模型組小鼠近心端主動脈管徑較小，管壁厚薄不均勻，內(nèi)膜不光滑，管腔內(nèi)可見明顯AS 斑塊形成，斑塊內(nèi)可見淺染無定形物和鈣化顆粒物。血管軟化丸和聯(lián)合組小鼠主動脈管徑厚薄雖然不均勻，但病灶表層纖維帽較薄，中膜平滑肌厚度均勻，但少數(shù)主動脈可見AS 斑塊，動脈血管結(jié)構(gòu)相對清晰，見圖1。與模型組比較，TGFB2?OT1 inhibitor 組、血管軟化丸組和聯(lián)合組的LA 大、IMT 薄、PA 小、LCA 小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P< 0.05），NC 組血清TC、TAG 和LDL?C 水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05）。與TGFB2?OT1 inhibitor 比較，血管軟化丸組和聯(lián)合組的LA大、IMT薄、PA小、LCA小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）。與血管軟化丸組比較，聯(lián)合組的LA 大、IMT 薄、PA 小、LCA 小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）。見表2。

圖1 各組小鼠主動脈HE 染色結(jié)果（×200）Fig.1 Results of HE staining in each group（×200）

表2 各組小鼠主動脈病理學(xué)檢測Tab.2 Pathological detection of the aorta of mice in each group ±s

表2 各組小鼠主動脈病理學(xué)檢測Tab.2 Pathological detection of the aorta of mice in each group ±s

注：與模型組比較，*P<0.05

組別模型組TGFB2?OT1 inhibitor 組NC 組血管軟化丸組聯(lián)合組F 值P 值LCA（mm2）0.092±0.013 0.025±0.006*0.089±0.003 0.003±0.001*0.002±0.001*24.051<0.001 n 11 11 11 11 11 LA（mm2）0.251±0.037 0.406±0.049*0.247±0.032 0.438±0.031*0.542±0.067*69.127<0.001 IMT（μm）0.159±0.031 0.063±0.011*0.161±0.043 0.039±0.006*0.022±0.031*59.753<0.001 PA（mm2）0.157±0.023 0.069±0.011*0.156±0.025 0.010±0.002*0.009±0.001*39.017<0.001

2.3 各組主動脈病理結(jié)構(gòu)改變和TGFB2?OT1 蛋白表達水平免疫組化法結(jié)果顯示TGFB2?OT1 蛋白表達陽性信號為棕黃色或棕褐色，以模型組和NC 組兩組的AS 斑塊形成最為明顯（圖2）。與模型組相比，TGFB2?OT1 inhibitor 組、血管軟化丸組和聯(lián)合組主動脈TGFB2?OT1 光密度值降低（均P< 0.05）。與聯(lián)合組相比，TGFB2?OT1 inhibitor組、血管軟化丸組主動脈TGFB2?OT1 光密度值升高（均P<0.05）。見圖3。

圖2 各組小鼠主動脈免疫組化染色結(jié)果（×200）Fig.2 Results of Immunohistochemical staining in each group（×200）

圖3 各組小鼠主動脈TGFB2?OT1 蛋白表達水平Fig.3 Expression levels of TGFB2?OT1 protein in the aorta of mice in each group

2.4 各組小鼠主動脈TGFB2?OT1 免疫熒光染色結(jié)果與模型組相比，TGFB2?OT1 inhibitor 組、血管軟化丸組和聯(lián)合組主動脈TGFB2?OT1 熒光強度降低（均P<0.05）。與聯(lián)合組相比，TGFB2?OT1 in?hibitor 組、血管軟化丸組主動脈TGFB2?OT1 熒光強度明顯升高（均P<0.05）。結(jié)果見圖4、5。

圖4 各組小鼠主動脈免疫熒光染色結(jié)果（Bar=60 μm）Fig.4 Results of Immunofluorescence staining in each group（Bar=60 μm）

2.5 各組血清ICAM?1、VCAM?1、IL?8 和MCP?1水平比較干預(yù)后，與模型組相比，TGFB2?OT1 inhibitor 組、血管軟化丸組和聯(lián)合組小鼠外周血清中ICAM?1、VCAM?1、IL?8 和MCP?1 水平降低（均P<0.05）。與聯(lián)合組相比，TGFB2?OT1 inhibitor組、血管軟化丸組外周血清中ICAM?1、VCAM?1、IL?8和MCP?1 水平升高（均P<0.05）。結(jié)果見圖6。

圖6 各組小鼠血清ICAM?1、VCAM?1、IL?8 和MCP?1 水平Fig.6 Serum ICAM?1，VCAM?1，IL?8 and MCP?1 levels of mice in each group

2.6 各組主動脈TGFB2 ? OT1、miRNA4459、LARP1、SQSTM1 的mRNA 表達水平干預(yù)后，與模型組相比，TGFB2?OT1 inhibitor組、血管軟化丸組和聯(lián)合組小鼠主動脈TGFB2?OT1、miRNA4459、LARP1、SQSTM1 水平降低（均P< 0.05）。與聯(lián)合組相比，TGFB2?OT1 inhibitor 組、血管軟化丸組主動脈TGFB2?OT1、miRNA4459、LARP1、SQSTM1 水平升高（均P<0.05）。結(jié)果見圖7。

圖7 各組主動脈TGFB2?OT1、miRNA4459、LARP1、SQSTM1 的mRNA 表達水平Fig.7 Expression levels of TGFB2?OT1，miRNA4459，LARP1 and SQSTM1 mRNA in each group

2.7 Western blot 法檢測主動脈TGFB2?OT1、CASP1、IL1B 蛋白水平干預(yù)后，與模型組相比，TGFB2?OT1 inhibitor 組、血管軟化丸組和聯(lián)合組主動脈TGFB2?OT1、CASP1、IL1B 蛋白表達水平降低（均P<0.05）。與聯(lián)合組相比，TGFB2?OT1 inhibitor組、血管軟化丸組主動脈TGFB2?OT1、CASP1、IL1B蛋白表達水平升高（均P< 0.05）。結(jié)果見圖8、圖9。

圖8 各組小鼠主動脈TGFB2?OT1、CASP1、IL1B 蛋白表達水平Fig.8 Expression levels of TGFB2?OT1，CASP1 and IL1B proteins in each group

圖9 各組主動脈TGFB2?OT1、CASP1、IL1B 蛋白表達Fig.9 Expression of TGFB2?OT1，CASP1 and IL1B proteins in each group

3 討論

AS 屬于中醫(yī)學(xué)“脈痹”范疇，本課題組認為“痰瘀阻滯”是AS 的主要證型，本研究所用血管軟化丸由保和丸化裁而來，方中山楂消食健胃，行氣散瘀為君藥；陳皮、半夏理氣健脾、化痰散結(jié)；黃芪補氣以推動血液運行；丹參，三七行氣散結(jié)，活血化瘀共為臣藥；萊菔子消食除脹、降氣化痰為佐藥；諸藥合用，共奏消食化痰、活血化瘀之功；本課題組既往研究［4-9］發(fā)現(xiàn)，血管軟化丸防治AS 是通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR 通路、miR?17?5p、CD40?CD40L、TLR3/TLR9、miRNA?467b 等信號通路產(chǎn)生效果。

目前認為AS 的過程是多因素介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)過程［10-14］，內(nèi)皮細胞覆蓋于全身血管的內(nèi)膜，對維持血管通透性、防治AS 具有重要的作用，當多種因素刺激損傷內(nèi)皮細胞，引起粘附分子ICAM?1、VCAM?1 和炎性因子IL?8、MCP?1 的高表達，炎性因子刺激引起內(nèi)皮功能紊亂，促進AS 斑塊的發(fā)生和發(fā)展［15-18］。本實驗中血管軟化丸組小鼠外周血清中ICAM?1、VCAM?1、IL?8 和MCP?1 水平明顯低于模型組，并且能夠降低小鼠血清TC、TG 和LDL?C 水平，改善AS 的進程，抑制AS 斑塊形成。提示血管軟化丸能夠抑制ICAM?1、VCAM?1、IL?8 和MCP?1 表達，抑制血管炎癥反應(yīng)。

圖5 各組小鼠主動脈TGFB2?OT1 熒光強度Fig.5 Fluorescence intensity of aorta TGFB2?OT1 in each group

研究者發(fā)現(xiàn)miRNAs 和LncRNA 參與AS 的發(fā)生發(fā)展過程［19］，LncRNA?TGFB2?OT1 在AS 中呈現(xiàn)高表達，TGFB2?OT1 通過結(jié)合miRNA4459，靶向影響LARP1、SQSTM1、CASP1 和IL1B 等下游分子，導(dǎo)致血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，加重AS 程度［20］。SQSTM1是氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)炎性因子，上調(diào)氧化應(yīng)激反應(yīng)的基因，調(diào)控炎癥受體蛋白，抑制炎癥反應(yīng)［21-23］。SQSTM1 通過促進炎性小體產(chǎn)生，激活CASP1，提高IL1B 的表達水平，引起炎癥反應(yīng)［24］。過度的慢性炎癥反應(yīng)貫穿AS 病理全程，尋找抑制炎癥反應(yīng)的靶點和藥物是研究重點和難點［25-26］。本實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)血管軟化丸組主動脈TGFB2?OT1 熒光強度明顯較低，血管軟化丸能夠抑制主動脈壁TGFB2?OT1蛋白表達，抑制主動脈TGFB2?OT1、miRNA4459、LARP1、SQSTM1、CASP1、IL1B 表達水平，血管軟化丸與通過抑制lncRNA?TGFB2?OT1 表達具有相同作用。結(jié)果表明血管軟化丸防治AS 的分子機制與調(diào)控lncRNA?TGFB2?OT1，抑制miRNA4459/LARP1/SQSTM1/CASP1/IL1B 炎癥信號通路活化，抑制ICAM?1、VCAM?1、IL?8 和MCP?1 表達，抑制血管炎癥反應(yīng)、保護血管內(nèi)皮有關(guān)。

本研究聚焦AS 的防治機制這一臨床難點和中醫(yī)藥優(yōu)勢點，基于lncRNA?TGFB2?OT1 在AS 形成中的重要作用，運用分子生物學(xué)方法，在組織、細胞、分子水平和蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)層面，將炎癥反應(yīng)和TGFB2?OT1 這兩個關(guān)鍵病理機制點和中醫(yī)藥聯(lián)合起來，提出了一個全新的研究思路，目前對中藥復(fù)方治療AS 作用機制與lncRNA?TGFB2?OT1 之間關(guān)系的研究國內(nèi)外尚無報道。本研究首次揭示了血管軟化丸防治AS 的分子機制是通過靶向調(diào)控長鏈非編碼RNA?TGFB2?OT1、miR4459 及其下游信號抑制炎癥反應(yīng)產(chǎn)生效果，對中醫(yī)藥防治心腦血管疾病具有重要理論與應(yīng)用價值，是科研思路上的持續(xù)創(chuàng)新。