miR-145-5p通過(guò)SMAD4基因?qū)κ彻荀[狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖與凋亡影響

趙紅丹,郭康,宋士軍,高明

(1 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)二科，河南 新鄉(xiāng) 453000； 2 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科)

食管癌作為世界常見(jiàn)六大惡性腫瘤之一，具有顯著的地域分布差異[1-2]。我國(guó)是食管癌高病死率國(guó)家，其中90%以上為鱗狀細(xì)胞癌[3-4]。食管癌的發(fā)病與飲食習(xí)慣、生活環(huán)境、遺傳因素、種族差異、地理分布等均有密切關(guān)系[5-7]。食管癌的發(fā)病過(guò)程涉及基因的遺傳學(xué)改變，包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活[8-10]。SMAD4最早以胰腺癌的抑癌基因被發(fā)現(xiàn)，后續(xù)研究證實(shí)其表達(dá)缺失與人類多種惡性腫瘤的進(jìn)程相關(guān)[11]。同時(shí)，微小RNAs(miRNA)作為一種非編碼的內(nèi)源性單鏈小分子RNA，已經(jīng)被證實(shí)可以通過(guò)靶向調(diào)節(jié)mRNA的降解或抑制該類靶基因的翻譯，進(jìn)而激活或抑制下游信號(hào)通路，參與并介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和凋亡等行為[12-13]。鑒于此，本研究通過(guò)探究miR-145-5p是否可以通過(guò)靶向調(diào)控SMAD4基因介導(dǎo)TGF-β/Smad4信號(hào)通路，進(jìn)而參與食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和凋亡，并闡述其關(guān)聯(lián)作用機(jī)制，以期為食管鱗狀細(xì)胞癌的早期診療和預(yù)后評(píng)估提供新的分子標(biāo)志物。

1 資料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1組織標(biāo)本 收集新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院2016年3月—2019年3月經(jīng)病理確診的食管鱗狀細(xì)胞癌病人68例，男40例，女28例，年齡34～78歲，平均(57.48±6.88)歲。所有病例均未接受放化療；既往無(wú)除食管鱗狀細(xì)胞癌之外的惡性腫瘤病史；既往無(wú)糖尿病、高血壓及嚴(yán)重心臟病等病史；無(wú)家族遺傳性病史。取食管鱗狀細(xì)胞癌組織為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)取相應(yīng)癌旁正常組織作為對(duì)照組。采集標(biāo)本分為兩份，一份液氮保存，一份甲醛固定備用。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)評(píng)審批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.1.2主要試劑與儀器 食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株TE-1、TE-13、ECA-109和TTN(購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))，目的質(zhì)粒均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(上海，中國(guó))，Lipofectamin 2000試劑盒、RNA提取試劑盒(Invitrogen公司，USA)，Prime Script RT試劑盒(寶日醫(yī)生物科技公司，北京)，PCR試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，GAPDH(abcam公司，英國(guó))，ECL試劑盒(Bio-Rad，美國(guó))，CCK8試劑、Annexin-V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司，上海)；成像分析儀(Image Reader，Bio-Rad，美國(guó))，酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技有限公司，美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1免疫組化檢測(cè)SMAD4陽(yáng)性率 組織標(biāo)本常規(guī)脫水、石蠟包埋，制作4 μm連續(xù)切片。參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)，其中，采用體積分?jǐn)?shù)0.03的H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，滴加非免疫山羊血清封閉；滴加鼠抗人SMAD4(1∶100)4 ℃冰箱內(nèi)孵育過(guò)夜。次日復(fù)溫后，加入生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗IgG，37 ℃孵育30 min。應(yīng)用含體積分?jǐn)?shù)0.01 Tween20的PBS洗滌后，滴加辣根過(guò)氧化物酶-鏈霉卵白素復(fù)合物進(jìn)行反應(yīng)。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野(200倍)分別計(jì)數(shù)其陽(yáng)性細(xì)胞，并取平均值。判定標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，≥81%為4分。

1.2.2食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株篩選 選擇食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株TE-1、TE-13、ECA-109和TTN，將以上4種細(xì)胞株置培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每24 h更換培養(yǎng)液，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)方法篩選出miR-145-5p表達(dá)水平最低的細(xì)胞系用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 選擇培養(yǎng)的人食管鱗狀細(xì)胞癌ECA-109細(xì)胞，將其分為6組：Blank組(不進(jìn)行任何處理，a組)、NC組(轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒，b組)、miR-145-5p mimic組(轉(zhuǎn)染miR-145-5p mimic質(zhì)粒，c組)、miR-145-5p inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR-145-5p inhibitor質(zhì)粒，d組)、siRNA-SMAD4組(轉(zhuǎn)染SMAD4siRNA質(zhì)粒，e組)和miR-145-5p inhibi-tor+siRNA-SMAD4組(共轉(zhuǎn)染siRNA-SMAD4質(zhì)粒和miR-145-5p mimic質(zhì)粒，f組)。將篩選細(xì)胞以每孔3×105個(gè)的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，使用Lipofectamin 2000試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用250 μL無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)液分別稀釋目的質(zhì)粒和Lipofectamine 2000。室溫下靜置5 min，兩者混合均勻，放置20 min后將混合液加到培養(yǎng)孔中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h后將培養(yǎng)液更換成完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞。

1.2.4雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 登錄生物學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)站(http://www.microrna.org和http://www.targetscan.org/vert_72/)進(jìn)行miR-145-5p的靶基因預(yù)測(cè)，驗(yàn)證SMAD4是miR-145-5p的直接靶點(diǎn)。人工合成SMAD4基因3′UTR野生型(WT)和突變型(MUT)序列。構(gòu)建熒光素酶報(bào)告載體，將測(cè)序正確的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒WT、MUT分別與miR-145-5p mimic和miR-145-5p NC共轉(zhuǎn)染至食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后收集并裂解細(xì)胞，分別使用熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.5qRT-PCR檢測(cè)各組相關(guān)基因的mRNA表達(dá) 取新鮮組織樣本采用RNA提取試劑盒提取總RNA，使用Prime Script RT試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系11.5 μL。設(shè)計(jì)miR-145-5p、SMAD4、TGF-β、Bcl-2、Bax、U6和GAPDH引物，交由TAKARA公司合成。按照PCR試劑盒操作步驟進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min后，95 ℃、 40 s，57 ℃、40 s，72 ℃、40 s，循環(huán)40次，72 ℃延伸10 min，4 ℃、5 min。miR-145-5p的相對(duì)水平以U6為內(nèi)參照，SMAD4、TGF-β、Bcl-2和Bax相對(duì)表達(dá)水平以GAPDH基因作為內(nèi)參照。采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因 mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。該實(shí)驗(yàn)步驟同樣適用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2.6Western Blot檢測(cè)各組相關(guān)基因的蛋白表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞，以預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次，加入全蛋白裂解液后置冰上裂解30 min，收獲蛋白。BCA法定量抽提蛋白后，于80 V泳道進(jìn)行SDS-PAGE，待樣品跑至分離膠時(shí)改用120 V電壓繼續(xù)電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜；置入50 g/L 脫脂奶粉溶液中室溫孵育60 min。TBST洗膜3次后，加入一抗多克隆抗體SMAD4、TGF-β、Bcl-2、Bax和GAPDH于4 ℃過(guò)夜；TBST洗膜3次后，加入二抗(辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗兔IgG)室溫下孵育60 min。TBST洗膜3次后用ECL試劑盒進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，濾紙吸去膜表面多余底物溶液，置于成像分析儀中顯影成像。用Quantity One軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的基因蛋白的相對(duì)表達(dá)量。每組3個(gè)樣本，設(shè)3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7CCK8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力的變化情況

將轉(zhuǎn)染12 h后的各組細(xì)胞鋪入96孔培養(yǎng)板，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/L，每孔加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液。將培養(yǎng)板置于室溫下培養(yǎng)，分別檢測(cè)24、48、72、96 h的細(xì)胞活力。每孔加10 μL的CCK8試劑，37 ℃孵育2 h，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的光密度值(OD)。以時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞活力曲線圖。每組3個(gè)樣本，設(shè)3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的周期和凋亡率

按照Annexin-V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明檢測(cè)細(xì)胞凋亡。取各組轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，每100 μL染液重懸1×106個(gè)細(xì)胞，振蕩混勻，加入5 μL的 Annexin-V-FITC溶液，振蕩混勻。在室溫下孵育15 min后，加入5 μL的 PI后輕輕混勻，于4 ℃下避光孵育5 min。在1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm下檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。每組3個(gè)樣本，設(shè)3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 不同組織SMAD4蛋白及miR-145-5p mRNA表達(dá)比較

免疫組化檢測(cè)顯示，在食管癌組織中SMAD4蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈黃色或棕黃色顆粒，主要分布于細(xì)胞漿或細(xì)胞核。SMAD4蛋白在食管癌組織(44/68)中表達(dá)顯著高于在正常癌旁組織(22/68)中表達(dá)，差異有顯著性(χ2=14.251，P<0.05)。見(jiàn)圖1A、B。qRT-PCR檢測(cè)顯示，與正常癌旁組織相比，食管癌組織中miR-145-5p的表達(dá)水平明顯下降，差異有顯著性(t=109.800，P<0.05)。見(jiàn)圖1C。

A：正常癌旁組織與食管癌組織SMAD4蛋白表達(dá)；B：兩組SMAD4蛋白陽(yáng)性率比較；C：兩組miR-145-5p表達(dá)比較。與正常癌旁組織比較，*P<0.05。

2.2 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

生物學(xué)的預(yù)測(cè)網(wǎng)站microRNA.org顯示，miR-145-5p和SMAD4基因間存在結(jié)合位點(diǎn)(圖2A)。雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-145-5p mimic和SMAD4-wild共轉(zhuǎn)染組熒光素酶熒光信號(hào)明顯下降(t=21.820，P<0.05)，而SMAD4-mutant組熒光素酶信號(hào)無(wú)明顯變化(t=0.775，P>0.05)。提示miR-145-5p能夠特異性靶向結(jié)合SMAD4基因(圖2B)。

A：miR-145-5p和SMAD4的結(jié)合位點(diǎn)；B：兩組熒光素酶熒光信號(hào)比較。與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.3 食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株篩選

qRT-PCR檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株TE-1、TE-13、ECA-109和TTN中miR-145-5p表達(dá)量顯示，與其他3種細(xì)胞株相比較，ECA-109細(xì)胞中的miR-145-5p表達(dá)量最低(F=48.000，P<0.05)。篩選出ECA-109細(xì)胞株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖3。

與其他3種細(xì)胞株相比，*P<0.05。

2.4 各組細(xì)胞中相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)比較

qRT-PCR和Western Blot的檢測(cè)結(jié)果顯示，Blank組和NC組各基因mRNA和蛋白表達(dá)比較均無(wú)明顯差異(F=2.023、0.557，P均>0.05)。與Blank組和NC組細(xì)胞比較，miR-145-5p mimic組miR-145-5p和Bax的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量增加(F=38.240～118.600，P均<0.05)，SMAD4、TGF-β和Bcl-2的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(F=24.820～156.200，P均<0.05)；siRNA-SMAD4組miR-145-5p的表達(dá)無(wú)明顯變化(F=0.937，P>0.05)，Bax的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著增加(F=38.27、148.200，P均<0.05)，SMAD4、TGF-β和Bcl-2的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(F=27.470～134.900，P均<0.05)；miR-145-5p inhibitor組miR-145-5p以及Bax的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(F=65.550～82.320，P均<0.05)，SMAD4、TGF-β和Bcl-2的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平上升(F=35.350～101.400，P均<0.05)。而miR-145-5p inhibitor+siRNA-SMAD4組與Blank組和NC組相比較差異均無(wú)顯著性(P均>0.05)；且與siRNA-SMAD4組相比，miR-145-5p inhibitor+siRNA-SMAD4組SMAD4、TGF-β和Bcl-2的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量上升(t=15.920～24.020，P均<0.05)，miR-145-5p和Bax的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(t=6.325～14.720，P均<0.05)。見(jiàn)圖4A、B。

2.5 CCK8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活力

CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染24 h各組細(xì)胞增殖能力均無(wú)明顯差異，且NC組和Blank組相比各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活力均無(wú)明顯差異(P均>0.05)；在48、72和96 h時(shí)，與Blank組和NC組相比，miR-145-5p mimic組與siRNA-SMAD4組細(xì)胞活力均顯著下降(F=10.770～22.340，P均<0.05)；miR-145-5p inhibitor組細(xì)胞活力顯著升高(F=5.814～15.810，P<0.05)；miR-145-5p inhibitor+siRNA-SMAD4組與siRNA-SMAD4組比較細(xì)胞活力顯著增加(P均<0.05)，而與NC組和Blank組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)圖5。

a：Blank組，b：NC組，c：miR-145-5p mimic組，d：miR-145-5p inhibitor組，e：siRNA-SMAD4組，f：miR-145-5p inhibitor+siRNA-SMAD4組。與Blank組和NC組相比，*P<0.05；與miR-145-5p mimic組相比，#P<0.05。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率

細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后NC組與Blank組相比凋亡率無(wú)明顯差異(t=0.537，P>0.05)；與Blank組和NC組相比，miR-145-5p mimic組與siRNA-SMAD4組細(xì)胞凋亡率顯著升高(F=136.900、151.000，P均<0.05)；miR-145-5p inhibitor組凋亡率顯著降低(F=18.000，P<0.05)；而miR-145-5p inhibitor+siRNA-SMAD4組的細(xì)胞凋亡率與siRNA-SMAD4組相比較明顯降低(P<0.05)，與NC組和Blank組相比無(wú)明顯差異(F=1.355，P>0.05)。見(jiàn)圖6。

A：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞凋亡率的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)；B：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞凋亡率比較。a：Blank組，b：NC組，c：miR-145-5p mimic組，d：miR-145-5p inhibitor組，e：siRNA-SMAD4組，f：miR-145-5p inhibitor+siRNA-SMAD4組。與Blank組和NC組相比，*P<0.05；與miR-145-5p mimic組相比，#P<0.05。

3 討 論

食管癌的病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。我國(guó)食管癌發(fā)病率高，其5年生存率低、預(yù)后不良[14]。作為食管癌的主要病理類型，食管鱗狀細(xì)胞癌的診治方案研發(fā)日益受到重視[15-16]。本研究通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究miR-145-5p靶向調(diào)控SMAD4基因介導(dǎo)TGF-β/Smad4信號(hào)通路對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、凋亡的作用機(jī)制。

食管鱗狀細(xì)胞癌中促癌作用的基因激活與抑癌作用的基因失活，及其相互作用的失衡是腫瘤發(fā)展的分子基礎(chǔ)[17]。近年來(lái)，miRNA在腫瘤進(jìn)程中的作用日益突出[18-19]。既往研究顯示，在食管鱗狀細(xì)胞癌中異常表達(dá)的miRNA通過(guò)調(diào)控某些關(guān)鍵原癌基因或抑癌基因介導(dǎo)腫瘤發(fā)生[20-21]。尋找食管鱗狀細(xì)胞癌中異常表達(dá)的miRNA并預(yù)測(cè)及驗(yàn)證下游靶基因，對(duì)于食管鱗狀細(xì)胞癌基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用具有重要價(jià)值。例如孟利峰等[22]研究表明，miR-149-5p可能通過(guò)調(diào)控Aurora-B表達(dá)參與食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)展進(jìn)程。CUI等[23]發(fā)現(xiàn)，miR-34a可通過(guò)抑制PLCE1發(fā)揮其抗癌作用，miR-34a/PLCE1軸可參與食管鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移，為食管鱗狀細(xì)胞癌治療提供了新的候選靶點(diǎn)。基于既往類似研究，研究之初我們假設(shè)miR-145-5p可能通過(guò)靶向調(diào)控SMAD4基因表達(dá)進(jìn)而參與食管鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)行為。

本研究對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌組織及其癌旁正常組織免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，SMAD4陽(yáng)性顆粒主要表達(dá)于細(xì)胞漿或細(xì)胞核，且與癌旁正常組織相比，食管鱗狀細(xì)胞癌組織中SMAD4陽(yáng)性率明顯升高；同時(shí)，qRT-PCR顯示食管鱗狀細(xì)胞癌組織miR-145-5p表達(dá)水平顯著降低，SMAD4表達(dá)水平則顯著增加。本文組織實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步提示，miR-145-5p在食管鱗狀細(xì)胞癌中低表達(dá)，SMAD4高表達(dá)，推測(cè)miR-145-5p高表達(dá)可通過(guò)靶向抑制SMAD4基因表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮抑癌作用。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前的細(xì)胞株篩選結(jié)果顯示，ECA-109細(xì)胞中的miR-145-5p表達(dá)量最低，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，要了解miRNA的作用機(jī)制，關(guān)鍵在于鑒定靶基因[24-26]。本研究熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，miR-145-5p可靶向調(diào)控SMAD4。SMAD4已被報(bào)道在諸如胰腺腫瘤、宮頸癌、乳癌中異常表達(dá)[27-31]。為了解miR-145-5p及SMAD4對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)功能的影響，本實(shí)驗(yàn)基于不同轉(zhuǎn)染組別，應(yīng)用qRT-PCR、Western Blot、CCK8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分別檢測(cè)關(guān)聯(lián)基因mRNA及蛋白表達(dá)、細(xì)胞增殖活力和凋亡率等指標(biāo)。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照和陰性對(duì)照細(xì)胞相比，上調(diào)miR-145-5p表達(dá)可促進(jìn)促凋亡因子Bax表達(dá)增加，抑制SMAD4、TGF-β和抑制凋亡因子Bcl-2表達(dá)，并下調(diào)細(xì)胞增殖活力且提升細(xì)胞凋亡率；且抑制SMAD4基因表達(dá)可發(fā)揮同樣作用；而下調(diào)miR-145-5p表達(dá)則導(dǎo)致Bax表達(dá)降低，SMAD4、TGF-β和Bcl-2的表達(dá)上升，細(xì)胞增殖能力上升，細(xì)胞凋亡率下降。同時(shí)，值得注意的是，在下調(diào)miR-145-5p表達(dá)水平同時(shí)抑制SMAD4基因表達(dá)則逆轉(zhuǎn)了抑制siRNA-SMAD4表達(dá)處理細(xì)胞的積極作用，導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力的提升和凋亡率的下降。上述結(jié)果提示，上調(diào)miR-145-5p或過(guò)表達(dá)SMAD4基因，可抑制TGF-β/Smad4信號(hào)通路的激活，且過(guò)表達(dá)miR-145-5p能夠靶向抑制SMAD4基因而抑制食管癌細(xì)胞增殖能力、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究對(duì)miR-145-5p以及SMAD4基因在食管鱗狀細(xì)胞癌中作用研究的結(jié)果顯示，SMAD4為miR-145-5p的下游靶基因，上調(diào)miR-145-5p表達(dá)可以通過(guò)下調(diào)SMAD4基因表達(dá)，抑制TGF-β/Smad4信號(hào)通路的激活，進(jìn)而在調(diào)控腫瘤生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用。本研究為今后食管鱗狀細(xì)胞癌的早期診治和預(yù)后評(píng)估提供了新型分子標(biāo)志物和機(jī)制通路解釋。然而，本研究機(jī)制探究單純基于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，缺乏進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)，未來(lái)可通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，并確認(rèn)下游潛在信號(hào)通路，從而為后續(xù)機(jī)制及臨床轉(zhuǎn)化研究提供理論指導(dǎo)。