雙報告基因標(biāo)記乳腺癌細(xì)胞移植瘤模型的建立及活體成像研究

周曼倩++閻皓++尹曉東++王輝

摘要：目的 探索雙報告基因標(biāo)記技術(shù)用于建立乳腺癌小鼠移植瘤模型并進(jìn)行活體成像研究的可行性。方法 利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將綠色熒光蛋白（eGFP）和熒光素酶（Fluc）融合基因標(biāo)記人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)篩選建立穩(wěn)定細(xì)胞系，利用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染率，體外細(xì)胞成像檢測Fluc的表達(dá)；將轉(zhuǎn)染后的231細(xì)胞接種至NOD/SCID小鼠皮下建立移植瘤模型，活體成像監(jiān)測移植瘤Fluc的發(fā)光。結(jié)果 熒光顯微鏡下觀察建立的穩(wěn)定細(xì)胞系中GFP表達(dá)率高，流式測定表達(dá)率95.2%，傳代擴(kuò)增5次后表達(dá)率無明顯變化。體外細(xì)胞成像檢測到明顯的Fluc發(fā)光，信號強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)成正比。所有實驗小鼠均接種成功，可觀察到Fluc信號強(qiáng)度隨時間逐漸增強(qiáng)。結(jié)論 慢病毒介導(dǎo)的Fluc-eGFP雙報告基因標(biāo)記可用于體內(nèi)移植瘤活體成像，為乳腺癌相關(guān)機(jī)制及治療研究提供了直觀，準(zhǔn)確的平臺。

關(guān)鍵詞：熒光素酶；綠色熒光蛋白；活體成像；乳腺癌

近年來新興的活體成像技術(shù)為生物醫(yī)學(xué)研究提供了新的平臺。其可從細(xì)胞或亞細(xì)胞水平對體內(nèi)的生物學(xué)過程進(jìn)行直觀觀察和量化分析，具有操作簡單，靈敏度高，無創(chuàng)性，觀測結(jié)果的直觀性和連續(xù)動態(tài)性等特點[1-2]ENREF1。 相對于熒光素酶生物發(fā)光成像較強(qiáng)的特異性和高信噪比，熒光成像應(yīng)用于活體內(nèi)時因其需要激發(fā)光源而造成較強(qiáng)的背景噪音，靈敏度較低，而用于體外細(xì)胞及組織標(biāo)記具有一定優(yōu)勢。利用熒光蛋白和熒光素酶對細(xì)胞或動物進(jìn)行雙重標(biāo)記，前者可用于體外檢測和細(xì)胞生物學(xué)觀察，后者用來進(jìn)行活體動物體內(nèi)追蹤研究[3-4]ENREF1。本研究構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)螢火蟲熒光素酶-綠色熒光蛋白（Fluc-eGFP，DF）的人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系，并在NOD/SCID小鼠建立乳腺癌皮下移植瘤模型，并應(yīng)用活體成像示蹤監(jiān)測標(biāo)記的乳腺癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的分布、存活及增殖。

1資料與方法

1.1一般資料 細(xì)胞，質(zhì)粒和實驗動物：人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系購自ATCC，人胚腎細(xì)胞系293T， Flu-eGFP慢病毒表達(dá)質(zhì)粒（圖1）由南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)實驗室惠贈。6～8周齡健康NOD/SCID雌性小鼠，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部，飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境。

1.2試劑及儀器 DMEM 培養(yǎng)基，F(xiàn)luc底物luciferin，活體成像設(shè)備（IVIS 200），流式細(xì)胞儀。

1.3方法

1.3.1慢病毒的包裝 將生長旺盛的293T細(xì)胞以1*106的密度接種在6孔板內(nèi)。細(xì)胞密度達(dá)到90%融合度進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染試劑和三種慢病毒包裝質(zhì)粒混合，靜置20 min后加入293T細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)，4 h后添加2 ml全培養(yǎng)基，16 h后換液，換液24 h后收集病毒上清。

1.3.2慢病毒感染MDA-MB-231細(xì)胞及陽性細(xì)胞的篩選 將231細(xì)胞以10%的密度接種在六孔板內(nèi)，加入1ml慢病毒上清，2 ml DMEM培養(yǎng)基，24 ug Polybrene。常溫下1600 r/min離心1 h。換成全培養(yǎng)基培養(yǎng)擴(kuò)增。用流式分選出GFP表達(dá)陽性的細(xì)胞群。熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)情況。

1.3.3 Fluc-eGFP標(biāo)記的MDA-MB-231細(xì)胞GFP和Fluc表達(dá)分析 利用流式細(xì)胞術(shù)檢測構(gòu)建的231-DF細(xì)胞系中GFP表達(dá)率。231-DF細(xì)胞消化后分別以不同梯度的細(xì)胞密度接種入6孔板內(nèi)。培養(yǎng)1 d后應(yīng)用活體成像儀檢測Fluc的表達(dá)。成像時向6孔板每個孔內(nèi)加入500 ul底物溶液（1：100稀釋），掃描時間1 s。用living imaging 軟件分析處理數(shù)據(jù)。

1.3.4小鼠皮下移植瘤模型的建立 將培養(yǎng)的狀態(tài)良好的231-DF細(xì)胞消化，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×107/ml，用水合氯醛麻醉小鼠，100 ul上述細(xì)胞懸液注射至小鼠兩側(cè)肩部皮下。

1.3.5活體成像監(jiān)測移植瘤的生長狀況 自接種第2 d起，每7 d應(yīng)用活體成像檢測接種小鼠體內(nèi)Fluc發(fā)光信號，研究移植瘤的生長情況。每只小鼠成像前腹腔注射200 ml的熒光素酶底物，氣體麻醉后放入樣本暗箱內(nèi)成像，掃描時間30 s。

2結(jié)果

2.1慢病毒感染231細(xì)胞及陽性細(xì)胞的篩選 熒光顯微鏡下觀察231細(xì)胞轉(zhuǎn)染率在80%左右。流式分選出GFP陽性細(xì)胞群，GFP表達(dá)率在95%左右，經(jīng)傳代擴(kuò)增5次后表達(dá)率無明顯變化，見圖2。

2.2 231-DF細(xì)胞Fluc表達(dá)分析 在6孔板連續(xù)的5個孔內(nèi)，隨著細(xì)胞密度依次遞增，熒光信號的強(qiáng)度也依次增強(qiáng)（圖3）。說明我們用DF標(biāo)記的231細(xì)胞表達(dá)的Fluc蛋白在體外能夠使用活體成像檢測到。以熒光信號強(qiáng)度對細(xì)胞數(shù)做一線性回歸分析（圖3），R2=0.99，表示熒光強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)之間存在線性正相關(guān)。上述結(jié)果提示Fluc的信號強(qiáng)度可作為測定活細(xì)胞數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)。

2.3小鼠皮下接種成瘤及活體成像 NOD/SCID小鼠皮下接種經(jīng)231-DF細(xì)胞約2 w后接種部位出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)，所有實驗小鼠均接種成功，隨時間推移，移植瘤呈圓形或橢圓形生長。于接種第2 d起，成像1次/w，觀察到Fluc信號強(qiáng)度隨時間增強(qiáng)，提示小鼠體內(nèi)移植瘤的生長（圖4）。

3討論

慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染能夠使外源性基因整合入宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，對轉(zhuǎn)錄沉默作用有較強(qiáng)的抵抗能力[5]，本實驗中DF基因在MDA231細(xì)胞內(nèi)能得到長期穩(wěn)定的表達(dá)，可準(zhǔn)確的反映腫瘤細(xì)胞在實驗動物體內(nèi)的生存狀態(tài)。報告基因DF表達(dá)eGFP-Fluc融合蛋白，因此可在體外以GFP篩選表達(dá)陽性細(xì)胞群，建立穩(wěn)定細(xì)胞系。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行GFP表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)連續(xù)傳代5次后，GFP陽性細(xì)胞的比例維持在95%左右。融合基因的優(yōu)勢在于既可進(jìn)行活體內(nèi)成像研究、也可從體外驗證所標(biāo)記細(xì)胞的分布和功能，結(jié)果證明，對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了DF基因的細(xì)胞系，活體成像的熒光強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)成正比。

本研究采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，建立了穩(wěn)定表達(dá)雙融合eGFP-Fluc蛋白的人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系，在NOD/SCID小鼠建立乳腺癌皮下移植瘤模型，利用活體成像監(jiān)測荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。結(jié)果提示雙報告基因標(biāo)記技術(shù)為進(jìn)行體內(nèi)移植瘤成像提供了較大便利?？捎糜诨铙w成像的小鼠皮下移植瘤模型為乳腺癌相關(guān)機(jī)制及治療研究提供了直觀，準(zhǔn)確的平臺。

參考文獻(xiàn)：

[1]王麗婷，孫瑋，冉?，?，等.活體動物光學(xué)成像技術(shù)與應(yīng)用研究[J].醫(yī)學(xué)信息，2015（1）.

[2]劉靜靜，胡曉俊，李征然，等.Luciferase2/mKate2雙報告基因?qū)π∈蠊撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記及活體光學(xué)成像研究[J].中山大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)科學(xué)版），2014，35（3）.

[3]程凱.荷瘤鼠活體成像研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2011，17（21）.

[4]閆明霞，朱淼鑫，劉蕾，等.實驗性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移動物模型的活體成像觀察[J].實驗動物與比較醫(yī)學(xué)，2012，32（5）.

[5]蔣凱，韓永健，程龍，等.動物活體成像生物發(fā)光穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建[J].生物技術(shù)通訊，2011，22（2）.

編輯/孫杰