BGN基因在胃癌中的表達(dá)及與預(yù)后相關(guān)性

趙浚江,劉皓,鄭自文,劉波,張登云,張堅(jiān)

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科,山東 青島 266003)

胃癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，由于缺乏有效的治療方法，其預(yù)后較差[1]。中國的胃癌發(fā)病率很高[2]。胃癌發(fā)生是一個復(fù)雜的生物過程，涉及多種因素、基因和分期，具有高度異質(zhì)性。尋找新的、特異性的生物標(biāo)志物對胃癌的診斷和治療具有重要的臨床價值，揭示關(guān)鍵基因在胃癌發(fā)病過程中的作用機(jī)制，可以為抗腫瘤實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，為胃癌治療提供新的選擇。雙糖鏈蛋白多糖(BGN)基因是編碼富含亮氨酸的小分子蛋白多糖家族的成員[3]。BGN的主要功能包括調(diào)節(jié)基質(zhì)裝配、細(xì)胞遷移、細(xì)胞黏附、骨骼礦化、炎癥、細(xì)胞生長、自噬以及細(xì)胞凋亡等[4-6]。因此，BGN參與了多種生理和病理生理過程，包括腫瘤發(fā)生[7]。BGN在腫瘤發(fā)生中的作用目前尚存在爭議。有研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，BGN過表達(dá)參與了血管內(nèi)皮生長因子受體信號的激活和細(xì)胞外信號激酶途徑的調(diào)節(jié)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[8]。但是在膀胱癌中，BGN基因沉默導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖增強(qiáng)，表明BGN在該疾病中起腫瘤抑制作用[9]。目前，BGN對胃癌發(fā)生發(fā)展作用的相關(guān)研究較少。因此，本研究利用相關(guān)數(shù)據(jù)庫分析BGN在胃癌中的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性，以期更好地理解BGN在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用，從而促進(jìn)新治療方法的開發(fā)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)檢索及篩選

本研究從Oncomine腫瘤信息數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org/)中檢索BGN相關(guān)數(shù)據(jù)，根據(jù)以下檢索條件進(jìn)行篩選：①基因名稱為BGN；②癌癥類型為Gastric cancer；③數(shù)據(jù)類型為mRNA；④分析對照類型為Cancer vs Normal Analysis；⑤臨界值設(shè)定條件為Pvalue<0.05，fold change(FC)>2，gene rank=top 10%。

1.2 BNG基因表達(dá)驗(yàn)證

利用GEPIA2數(shù)據(jù)庫(http://gepia2.cancer-pku.cn)的TCGA數(shù)據(jù)集和GETX數(shù)據(jù)集對BGN基因在腫瘤組織中的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。設(shè)置篩選條件如下:①gene為BGN;②methods為ANOVA；③|Log2FC| Cutoff為2；④qvalue Cutoff為0.01；⑤Matched Normal data為Match TCGA normal data，Match TCGA normal and GTEX data；⑥Tissue為STAD。

1.3 基因功能富集分析

收集了408例胃癌組織和36例正常胃組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)來自癌癥基因組圖譜網(wǎng)站TCGA(https://www.cancer.gov/about-nci/orga-nization/ccg/research/structural-genomics/tcga)。為研究胃癌中BGN表達(dá)相關(guān)的分子通路，采用基因集富集分析(GSEA)桌面軟件進(jìn)行GSEA，獲得相關(guān)性排前3位的通路(Pvalue<0.05)。

1.4 預(yù)后分析

從TCGA官方網(wǎng)站胃癌項(xiàng)目中獲得基因表達(dá)數(shù)據(jù)(胃癌組織與正常胃組織)和臨床信息，剔除臨床信息不夠完整的數(shù)據(jù)。對于最終保留的病人數(shù)據(jù)，使用sangerbox進(jìn)行生存曲線繪制?？偵嫫?OS)定義：診斷日期至死亡日期之間的時間[10]。無疾病間隔(PFI)定義：胃癌手術(shù)至檢測到復(fù)發(fā)之間的時間[11]。疾病特異性生存期(DSS)定義：結(jié)局指標(biāo)為癌癥相關(guān)死亡，它與癌癥生物學(xué)和治療效果有更大的關(guān)系[12]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Kaplan-Meier模型分析用于檢驗(yàn)BGN與胃癌預(yù)后的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同腫瘤中BGN的表達(dá)情況

對Oncomine數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，并分析BGN基因在腫瘤與正常組織中的差異表達(dá)情況。共檢索到相關(guān)研究421項(xiàng)，其中BGN基因在腫瘤組織中呈高表達(dá)的研究103項(xiàng)，呈低表達(dá)的研究9項(xiàng)。對檢索的結(jié)果進(jìn)行篩選，在涉及胃癌的相關(guān)研究中，BGN基因在胃癌組織中呈高表達(dá)的研究11項(xiàng)，呈低表達(dá)的研究0項(xiàng)。見圖1。

紅色為高表達(dá)，藍(lán)色為低表達(dá)，顏色越深表示越顯著。

2.2 BGN在胃癌組織中的表達(dá)

對Oncomine數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果分析顯示，BGN基因在胃癌組織及癌旁組織中存在表達(dá)差異的研究共5項(xiàng)(共有12個芯片數(shù)據(jù)集，包含298例組織樣本)。將此12個數(shù)據(jù)集相關(guān)研究進(jìn)行meta分析，結(jié)果顯示，BGN在所有差異表達(dá)基因中的中位數(shù)值排名為70.5(P<0.001)，提示該基因在胃癌組織中顯著高表達(dá)。見圖2。

圖2 12個數(shù)據(jù)集BGN表達(dá)與胃癌相關(guān)研究的meta分析

2.3 BGN在不同病理類型胃癌中的表達(dá)

在Oncomine數(shù)據(jù)庫中檢索不同病理類型胃癌BGN表達(dá)的研究，對研究結(jié)果分析顯示，與正常胃組織相比較，BGN基因在胃腸型胃癌(t=18.317，P<0.001)、彌漫型胃癌(t=23.103，P<0.001)和大細(xì)胞型胃癌(t=8.406，P<0.001)組織中均呈顯著高表達(dá)(圖3A～C)。利用GEPIA2數(shù)據(jù)庫，對從TCGA和GETX數(shù)據(jù)庫中篩選的胃癌組織與正常組織樣本的研究結(jié)果(篩選條件為|Log2FC|>1,P<0.01)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，與211例正常組織樣本比較，BGN在408例胃癌組織樣本中也呈現(xiàn)高表達(dá)(圖3D)。

A：胃腸型胃癌組織與正常胃組織BGN表達(dá)的比較；B：彌漫型胃癌組織與正常胃組織BGN表達(dá)的比較；C：大細(xì)胞型胃癌組織與正常胃組織BGN表達(dá)的比較；D：TCGA、TCGA+GETX數(shù)據(jù)庫中胃癌組織與正常胃組織BGN表達(dá)的比較。與正常胃組織比較，*P<0.01。

2.4 胃癌中BGN基因功能的富集分析

為了確定胃癌中可能的BGN相關(guān)通路，使用TCGA胃癌數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)進(jìn)行GSEA，結(jié)果顯示，BGN在胃癌中的表達(dá)可能與同種異體排斥、頂端連接、凋亡信號通路密切相關(guān)。見圖4。

圖4 胃癌中BGN基因功能的GSEA富集圖

2.5 BGN表達(dá)與胃癌病人預(yù)后的關(guān)系

自TCGA數(shù)據(jù)庫中下載胃癌病人相關(guān)臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。根據(jù)臨床結(jié)局情況，分別進(jìn)行篩選。分別對441例病人的OS結(jié)局、420例病人的DSS結(jié)局及435例病人的PFI結(jié)局進(jìn)行Kaplan-Meier Plotter分析，以比較BGN表達(dá)與胃癌病人不同預(yù)后結(jié)局間相關(guān)性。結(jié)果顯示，BGN表達(dá)水平與胃癌病人OS、DSS、PFI均呈顯著負(fù)相關(guān)(P=0.002～0.039)，BGN高表達(dá)病人的OS、DSS和PFI均明顯短于BGN低表達(dá)病人。見圖5。

A：BGN表達(dá)與OS的相關(guān)性；B：BGN表達(dá)與DSS的相關(guān)性；C：BGN表達(dá)與PFI的相關(guān)性。

3 討 論

胃癌是一種常見的惡性腫瘤，是世界范圍內(nèi)因腫瘤死亡的主要原因。目前外科手術(shù)是治療胃癌的主要手段，但手術(shù)治療具有較高的復(fù)發(fā)率。靶向治療是治療癌癥的新策略與新方法，但是目前胃癌仍缺乏有效的靶向治療。所以，尋找潛在的胃癌相關(guān)基因有助于胃癌的治療與預(yù)后判斷。同時，炎癥和腫瘤發(fā)展之間的關(guān)系被越來越多的證據(jù)證實(shí)。雖然炎癥在組織損傷修復(fù)與對抗病原體中有著重要作用，但是如果炎癥消退不及時會使得免疫細(xì)胞浸潤，伴隨產(chǎn)生大量的免疫細(xì)胞因子、趨化因子等，這些免疫因子會引起組織的再次損傷與炎性反應(yīng)，改變免疫微環(huán)境，從而在一定程度上促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

BGN基因與炎癥密切相關(guān)，可能作為腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因子參與癌癥的進(jìn)程。有研究顯示，BGN在人類胰腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等腫瘤組織中均存在過表達(dá)[13-15]。本文結(jié)果顯示，BGN的表達(dá)與同種異體排斥、頂端連接、凋亡信號通路密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。已有研究表明，BGN與腫瘤細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，BGN的缺失通過細(xì)胞凋亡促進(jìn)細(xì)胞死亡，BGN的表達(dá)干擾胃癌病人抗凋亡和促凋亡基因的調(diào)節(jié)，提示BGN參與的細(xì)胞凋亡途徑可能是治療胃癌的一個靶點(diǎn)[16-17]。關(guān)于同種異體排斥、頂端連接相關(guān)的信號通路對癌癥作用的研究較少，推測BNG可能通過參與這些通路，直接或間接地參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，但這種猜想需要進(jìn)一步的研究證明。既往有研究結(jié)果顯示，BGN可通過TLR2/4-NF-κB和P2X7-NLRP3-caspase-1信號通路直接參與腫瘤的調(diào)控，同時可以通過下游遞質(zhì)，如活性氧(ROS)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)間接影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[18]。

慢性炎癥在胃癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用[19]。慢性胃炎已被證明是胃癌的關(guān)鍵病因，控制胃部炎性反應(yīng)被認(rèn)為是臨床預(yù)防胃癌發(fā)生的有效方法，但胃部炎癥導(dǎo)致胃癌的機(jī)制還需要進(jìn)一步探索。ROS、VEGF主要參與炎癥介導(dǎo)的損傷，多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中ROS、VEGF的含量增加，表明二者參與了腫瘤的進(jìn)程[20-21]。炎癥反應(yīng)中公認(rèn)的細(xì)胞內(nèi)信號通路之一是核因子κB(NF-κB)信號通路。Toll樣受體(TLR)基因(特別是TLR2、TLR4和TLR10)在宿主防御中起重要作用[22]。目前研究表明，在胃癌組織中，TLR4蛋白基本呈高表達(dá)狀態(tài)，且其表達(dá)可能與腫瘤惡性侵襲、轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)[23]。NLRP3炎性小體作為目前研究較為廣泛的復(fù)雜炎性體，激活后可通過活化半胱天冬酶-1，剪切白細(xì)胞介素(IL)-1β或IL-18，引起大量炎癥因子的釋放，IL-1β及IL-18等炎性因子的過表達(dá)在腫瘤的逐步演進(jìn)過程中起著重要作用[24]。結(jié)直腸癌、乳癌等組織中NLRP3的表達(dá)水平均明顯高于對應(yīng)的正常組織[25]。有研究結(jié)果顯示，NF-κB蛋白在胃癌組織中的陽性染色率(71.43%)明顯高于癌旁正常切緣(23.81%)，NLRP3的陽性染色率(78.57%)也顯著高于癌旁正常切緣(16.67%)[26]。BGN基因通過參與調(diào)控TLR2/4-NF-κB和P2X7-NLRP3-caspase-1信號通路可能在胃癌的發(fā)展中起到重要作用。但胃癌中BGN與下游信號通路的關(guān)系機(jī)制較為復(fù)雜且不十分清楚，仍需通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行探討。

綜上所述，本研究使用生物信息學(xué)的方法，基于Oncomine、GEPIA2與TCGA數(shù)據(jù)庫的聯(lián)合分析顯示，BGN基因在胃癌組織中高表達(dá)，且與病人的OS、DSS和PFI有關(guān)。表明BGN基因參與了胃癌的重要進(jìn)程，并影響其預(yù)后。檢測胃癌組織中BGN的表達(dá)有助于評估病人的風(fēng)險狀況和預(yù)后。BGN有可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)，為胃癌的治療提供新的方向。