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    膠東某醫(yī)院西弗射盾子囊霉近10年檢出與藥敏分析

    2022-09-16 15:40鄭娟娟刁瑋田婷婷王喆王宏偉李靜
    關(guān)鍵詞:瓊脂菌落真菌

    鄭娟娟,刁瑋,田婷婷,王喆,王宏偉,李靜,

    (青島大學(xué),山東 青島 266071 1 醫(yī)學(xué)部醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系; 2 附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科)

    西弗射盾子囊霉(Stephanoascusciferrii)最早由KREGER-VAN RIJ[1]在1965年報(bào)道,曾用名西弗念珠菌(Candidaciferrii)、類西弗念珠菌(Candidaallociferrii)和西弗毛滴蟲(chóng)(Trichomonascusciferrii),屬于子囊菌類酵母。子囊菌的形態(tài)特征差別很大,其共同特征是有性生殖形成子囊孢子,是一類非常少見(jiàn)的機(jī)會(huì)致病性真菌[2-3]。目前,國(guó)內(nèi)外在病人指甲、痰液、腦脊液、腹膜透析液、外耳道分泌物和血液標(biāo)本中均有西弗射盾子囊霉的檢出報(bào)道,在貓耳分泌物、六堡茶中也有分離成功的報(bào)道[4-7]。青島大學(xué)附屬醫(yī)院近10年共檢出西弗射盾子囊霉8株。本文從臨床特點(diǎn)、形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特性及藥敏試驗(yàn)結(jié)果等方面對(duì)8株西弗射盾子囊霉進(jìn)行分析,以期為臨床少見(jiàn)病原菌感染檢出和用藥提供參考。

    1 資料與方法

    1.1 研究對(duì)象

    2011年1月—2021年1月,青島大學(xué)附屬醫(yī)院共檢出西弗射盾子囊霉陽(yáng)性病人8例。男性3例,女性5例;年齡35~64歲,其中年齡41~64歲者7例。2011—2015年檢出2例,2016—2021年檢出6例。標(biāo)本來(lái)自血液內(nèi)科1例,耳鼻喉科6例,眼科1例;標(biāo)本類型為血液1例,耳分泌物6例,眼分泌物1例。其中1例病人診斷為急性淋巴細(xì)胞白血病(M2型),住院期間有反復(fù)發(fā)熱癥狀,血培養(yǎng)檢出西弗射盾子囊霉;1例病人因“左眼疼痛伴流淚、視物不清”就診,眼拭子培養(yǎng)出西弗射盾子囊霉;6例病人因“外耳流膿”入院,耳分泌物培養(yǎng)檢出西弗射盾子囊霉。8例病人均根據(jù)藥敏結(jié)果給予抗感染治療和對(duì)癥治療,出院3個(gè)月后隨訪,癥狀好轉(zhuǎn),未見(jiàn)明顯并發(fā)癥。

    1.2 試劑與儀器

    所用MH平板(Mueller-Hinton agar plate)、血瓊脂平板、科瑪嘉顯色平板以及沙保弱培養(yǎng)基平板,VITEK 2 Compact梅里埃全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏系統(tǒng)及酵母菌鑒定卡(YST),ATB Fungus 3真菌藥敏試劑條、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜VITEK MS、比濁儀DensiCHEK Plus,均為法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品。

    1.3 菌種鑒定與藥敏試驗(yàn)

    嚴(yán)格按照細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程對(duì)送檢標(biāo)本進(jìn)行處理和常規(guī)培養(yǎng),將標(biāo)本分別接種于MH平板和血瓊脂平板,培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長(zhǎng)狀態(tài)。取菌落涂片后進(jìn)行革蘭染色顯微鏡檢,高倍鏡(1 000倍)下觀察。選單菌落轉(zhuǎn)種科瑪嘉顯色平板及沙保弱培養(yǎng)基平板,分別置35 ℃及28 ℃培養(yǎng),24 h后觀察菌落形態(tài),并涂片進(jìn)行革蘭染色鏡檢。按操作規(guī)程配制2.0濁度的菌液,用VITEK 2 Compact配套酵母菌鑒定卡(YST)進(jìn)行菌種鑒定,另外取菌涂布VITEK MS靶板進(jìn)行質(zhì)譜儀鑒定;同時(shí)用ATB Fungus 3酵母菌藥敏測(cè)試條,對(duì)菌液進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn),按說(shuō)明書(shū)操作。

    2 結(jié) 果

    2.1 菌落特征

    菌落在MH平板、血瓊脂平板、科瑪嘉顯色平板、沙保弱培養(yǎng)基平板中均能生長(zhǎng),且在28 ℃和35 ℃條件下均生長(zhǎng)良好。血瓊脂平板35 ℃培養(yǎng)24 h后可見(jiàn)表面光滑呈乳白色的圓形小菌落,在培養(yǎng)3 d后,菌落呈鑲嵌生長(zhǎng),質(zhì)地硬,不易研碎(圖1A);沙保弱培養(yǎng)基平板28 ℃培養(yǎng)1周,菌落呈淡黃色,中心呈菜花狀,邊緣有粗糙褶皺的大菌落;科瑪嘉顯色平板培養(yǎng)24 h,可見(jiàn)圓形光滑藍(lán)色小菌落,延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間,邊緣逐漸變白,呈現(xiàn)中心藍(lán)色、邊緣白色的“小蘑菇”狀,繼續(xù)培養(yǎng),菌落開(kāi)始變粗糙,邊緣不整并出現(xiàn)腦回狀溝槽(圖1B)。28 ℃條件下較35 ℃生長(zhǎng)緩慢,菌落形態(tài)較小。

    A:血瓊脂平板35 ℃培養(yǎng)3 d;B:科瑪嘉顯色平板35 ℃培養(yǎng)4 d。

    2.2 革蘭染色檢查

    菌落涂片革蘭染色鏡檢,可見(jiàn)革蘭陽(yáng)性酵母樣孢子及細(xì)長(zhǎng)菌絲,孢子為單細(xì)胞、卵圓形、沿菌絲排列生長(zhǎng)(圖2A、B)。

    A:血瓊脂平板35 ℃培養(yǎng)3 d;B:血瓊脂平板35 ℃培養(yǎng)5 d。1 000倍。

    2.3 質(zhì)譜檢測(cè)

    取血瓊脂平板上的單個(gè)菌落涂布于VITEK MS靶板上,加入0.5 μL甲酸,自然干燥后再加入1.0 μL基質(zhì)液(4-羥基-2-甲基肉桂酸),自然干燥后采用VITEK MS儀進(jìn)行該菌的蛋白指紋圖譜檢測(cè),結(jié)果鑒定為西氟射盾子囊霉,置信度為99.9%。并重復(fù)實(shí)驗(yàn),重復(fù)鑒定符合率100%。

    2.4 VITEK 2 Compact酵母菌鑒定卡(YST)鑒定

    按儀器的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程操作和判定結(jié)果。取血瓊脂平板上的單個(gè)菌落配制2.0濁度的菌液,放入VITEK2 Compact酵母菌鑒定卡,然后置VITEK 2 Compact中,經(jīng)18~22 h鑒定結(jié)果為西氟射盾子囊霉,準(zhǔn)確度99.9%。

    2.5 藥敏試驗(yàn)

    按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程用ATB Fungus 3酵母菌藥敏測(cè)試條檢測(cè)8株菌對(duì)常見(jiàn)抗真菌藥物的敏感性,結(jié)果以最低抑菌濃度(MIC)表示,其藥物敏感率分別為伏立康唑(MIC≤1.0 mg/L)100%,兩性霉素B(MIC≤0.5 mg/L)86%,氟康唑(MIC≤64.0 mg/L)38%,5-氟胞嘧啶(MIC≤32.0 mg/L)43%,伊曲康唑(MIC≤2.0 mg/L)12%。

    3 討 論

    本文總結(jié)分析了青島大學(xué)附屬醫(yī)院近10年西弗射盾子囊霉的檢出情況,作為臨床罕見(jiàn)機(jī)會(huì)致病菌,其檢出率近年有增加趨勢(shì)。分析原因可能與以下幾點(diǎn)有關(guān)。①腫瘤、血液病等疾病發(fā)生率的增高和移植、抗生素、糖皮質(zhì)激素等治療手段的大量使用,損傷機(jī)體屏障和免疫力,使機(jī)會(huì)致病性真菌感染率明顯增加。從國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道可以看出,合并西弗射盾子囊霉感染的病人,其臨床病程長(zhǎng)短不一,但在高齡、惡性腫瘤及服用免疫抑制劑等免疫力低下病人中檢出率更高[5,8-9]。②臨床對(duì)真菌感染的關(guān)注度增高,增加了樣品送檢,提高了檢出率。③實(shí)驗(yàn)室真菌檢測(cè)技術(shù)手段的發(fā)展提高了檢出率。分析本研究中的6例慢性中耳炎病人,結(jié)合張繼東等[10]和賀文芳等[11]報(bào)道的病例,我們發(fā)現(xiàn)西弗射盾子囊霉相關(guān)慢性化膿性中耳炎主要臨床表現(xiàn)為外耳道奇癢,常搔刮至皮膚破損后方可解癢,以致出現(xiàn)耳道流膿,膿液呈黃色,稀薄略帶臭味,多伴耳鳴,治療不及時(shí)可導(dǎo)致鼓膜穿孔引起聽(tīng)力下降。對(duì)于合并西弗射盾子囊霉感染的中耳炎,外科手術(shù)可取得比較理想的治療效果。

    西弗射盾子囊霉在MH平板、血瓊脂平板和沙保弱培養(yǎng)基平板等臨床常用培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng),且在28 ℃和35 ℃均生長(zhǎng)較好。特征最明顯的是,該菌在科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基上呈現(xiàn)中心藍(lán)色、邊緣白色的腦回狀菌落,易于觀察。根據(jù)菌落形態(tài)及對(duì)該菌鏡檢可以初步判斷病人為真菌感染,結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道西弗射盾子囊霉可同化利用大多數(shù)碳水化合物和氨基酸等的生化反應(yīng)特性,可與其他真菌進(jìn)行鑒別[12-13]。這有利于進(jìn)一步的真菌鑒定和抗真菌藥物的藥敏試驗(yàn),為臨床治療爭(zhēng)取時(shí)間和提供藥敏依據(jù)。有條件的醫(yī)院還可以用現(xiàn)代分子檢測(cè)技術(shù)快速鑒別該真菌。

    國(guó)外學(xué)者PFALLER等[14]的一項(xiàng)持續(xù)10年的關(guān)于念珠菌屬對(duì)氟康唑和伏立康唑藥物敏感性監(jiān)測(cè)的研究顯示,分離出的西弗射盾子囊霉對(duì)氟康唑的敏感率為50%,對(duì)伏立康唑的敏感率為50%。SOKI等[15]分離出對(duì)氟康唑耐藥的菌株。本文西弗射盾子囊霉的藥敏情況為,伏立康唑敏感率最高,其次是兩性霉素B,伊曲康唑敏感率最低。因此,臨床用藥時(shí)在排除用藥禁忌后,可優(yōu)先考慮伏立康唑,為臨床有效治療爭(zhēng)取時(shí)間。真菌耐藥機(jī)制主要為膜通透性降低使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低,藥物作用靶酶增多、缺失或者結(jié)構(gòu)改變以及細(xì)胞壁合成障礙等[16]。本研究中2015年檢出菌株對(duì)氟康唑敏感,2020年檢出菌株則出現(xiàn)耐藥,是否與培養(yǎng)過(guò)程有關(guān)或基因突變引起尚需深入研究。

    總而言之,西弗射盾子囊霉是一種非常少見(jiàn)的機(jī)會(huì)致病性真菌,主要見(jiàn)于免疫力低下病人,在中青年及免疫力正常人群中偶見(jiàn)合并感染[17-18]。因此,對(duì)于就診病人,應(yīng)詳細(xì)詢問(wèn)病史、服藥史,對(duì)于發(fā)熱原因不明病人,應(yīng)做分泌物培養(yǎng)、血培養(yǎng)甚至骨髓培養(yǎng),必要時(shí)可聯(lián)系實(shí)驗(yàn)室延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。另外,臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該菌的認(rèn)識(shí),及時(shí)準(zhǔn)確地分離鑒定該菌,并積極開(kāi)展抗真菌藥物的敏感試驗(yàn),以便為臨床醫(yī)師早期合理選擇抗真菌藥物提供參考,從而有助于正確治療和有效控制真菌感染,減少耐藥菌株的產(chǎn)生。

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