消除國產(chǎn)瓊脂磷酸鹽沉淀的工藝優(yōu)化及設(shè)計(jì)

段博嚴(yán)，倪輝，2，3，李志朋，2，3，姜澤東，2，3，朱艷冰，2，3，李清彪，2，3

（1 集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2 福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021；3 廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021）

瓊脂是從江蘺 （）、 石花菜（）、龍須菜（）等海洋紅藻中提取膠質(zhì)制成的一種長鏈形親水多糖膠體，具備良好的膠凝能力、凝膠可逆性和高滯后性等性質(zhì)，在食品工業(yè)、生物醫(yī)藥、日用化工等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。

目前，大部分瓊脂產(chǎn)品都已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了國產(chǎn)化，但微生物培養(yǎng)基專用瓊脂等產(chǎn)品尚未實(shí)現(xiàn)國產(chǎn)化生產(chǎn)。相關(guān)研究表明，配置微生物培養(yǎng)的生化瓊脂要求良好的透明度，而國產(chǎn)瓊脂配置微生物培養(yǎng)基時，加入磷酸鹽后常出現(xiàn)渾濁或沉淀現(xiàn)象，導(dǎo)致透明度降低，影響微生物群落觀察及計(jì)數(shù)。部分學(xué)者認(rèn)為國產(chǎn)瓊脂中存在鈣、鎂離子，在培養(yǎng)基配置時與磷酸鹽反應(yīng)生成不溶性沉淀，引起培養(yǎng)基渾濁度增加、透明度降低的“磷酸鹽沉淀”現(xiàn)象。目前，常用去除鈣、鎂離子的方法有吸附法（adsorption method）、 化學(xué)沉淀法（chemical precipitation method）， 掩蔽劑法（screening reagent softening）、離子交換法（ion exchange process）、膜分離法（separation membrane）以及電滲析法（electrodialysis）等。黎新等研究發(fā)現(xiàn)分步沉淀法可有效去除鈣離子，而鎂離子無明顯變化。Dong等研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)堿桿菌可通過胺化反應(yīng)生成碳酸鹽，從而去除海水中鈣、鎂離子。Sepehr 等研究發(fā)現(xiàn)改性沸石吸附法去除水中鈣、鎂離子。陳志林等發(fā)現(xiàn)在氯堿工業(yè)中以加入磷酸鹽沉降鈣、鎂離子，可以顯著去除鈣、鎂離子。王萍萍研究發(fā)現(xiàn)陽離子交換樹脂可以顯著降低瓊脂中灰分含量。此外，相關(guān)研究還表明，在瓊脂制備過程中采用烷基化法、羧烷基化法和縮水甘油醚法等改性處理也可以改善瓊脂產(chǎn)品透明度。雖然研究人員對瓊脂磷酸鹽沉淀已經(jīng)進(jìn)行了一些研究，但國產(chǎn)瓊脂產(chǎn)生磷酸鹽沉淀的原因尚不完全明確，相關(guān)技術(shù)尚不能完全消除磷酸鹽沉淀，國產(chǎn)瓊脂磷酸鹽沉淀問題尚未解決，導(dǎo)致微生物學(xué)計(jì)數(shù)用的生化瓊脂大量依賴進(jìn)口。

基于以上背景，本文根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，以Sigma 瓊脂、國產(chǎn)瓊脂條和國產(chǎn)瓊脂粉為原料，以瓊脂溶液添加磷酸鹽后的透明度和濁度為評價指標(biāo)，研究吸附法、掩蔽劑法和沉淀過濾法等對消除瓊脂磷酸鹽沉淀的效果，從瓊脂原料和處理方法兩個方面闡明生產(chǎn)生化瓊脂的關(guān)鍵技術(shù)，并通過工藝設(shè)計(jì)評估該技術(shù)的經(jīng)濟(jì)可行性，為國產(chǎn)化制備高品質(zhì)微生物培養(yǎng)基瓊脂提供工藝方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

國產(chǎn)瓊脂條和國產(chǎn)瓊脂粉，綠新（福建）食品有限公司；Sigma-A6686瓊脂粉，Sigma有限公司；活性沸石，青島鵬潤沸石礦物有限公司；3～5mm活性氧化鋁球，龍鑫凈水有限公司；AR 磷酸氫二鉀、AR 氯化氫、AR 氯化鈉、AR 氫氧化鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；AR 乙二胺四乙酸（EDTA），上海恒信化學(xué)試劑有限公司。

PL602-S電子天平、FE20pH計(jì)，梅特勒-托多利儀器（上海）有限公司；ZXRB-B5210鼓風(fēng)干燥箱、ZSBB-728 恒溫水浴鍋，廈門史維思技術(shù)服務(wù)有限公司；NN-GT353M 微波爐，松下電器（中國）有限公司；BXU-30R 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；WGZ-2000濁度計(jì)，上海昕瑞儀器儀表有限公司；V-T3 可見分光光度計(jì)，屹譜儀器制造（上海）有限公司；LXJ-IIB 離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 磷酸鹽沉淀程度的測定

以料液比（質(zhì)量比）1.5∶100 分別稱取Sigma瓊脂、國產(chǎn)瓊脂粉和國產(chǎn)瓊脂條1.5g，加入100mL去離子水后進(jìn)行加熱，充分?jǐn)嚢枞芙?，制成瓊脂樣液，加?.500g 磷酸氫二鉀并用磷酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.0～7.5，121℃高壓滅菌20min，進(jìn)行透明度和濁度測定。其中，透明度測定是將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂溶液趁熱倒入比色皿中，室溫放置24h，用紫外可見分光光度計(jì)測定750nm的透光率；濁度的測定是取適量樣品溶液，冷卻至85℃，倒入準(zhǔn)備好的測試瓶中至刻度線位置，用濁度儀測定瓊脂溶膠的濁度（NTU）。

1.2.2 活性沸石吸附法去除瓊脂中磷酸鹽沉淀的作用

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[23]，以1mol/L NaCl+1mol/L NaOH 活化沸石，提高其吸附性能。稱取1.5g 瓊脂樣品，加入100mL 去離子水，在100℃溫度條件下水浴保溫20min后，溶解后加入預(yù)熱至60℃的活性沸石2g，80℃水浴振蕩5min 后過濾，得到活性沸石處理后的樣液。向處理后樣液中加入0.500g磷酸氫二鉀攪拌均勻，經(jīng)121℃高壓滅菌20min 后于100℃水浴中保溫，測定其透明度及濁度。

1.2.3 活性氧化鋁吸附法去除瓊脂中磷酸鹽沉淀的作用

將活性氧化鋁用蒸餾水反復(fù)清洗至洗液透明，并浸泡20h 以上，熱風(fēng)干燥12h 后放于干燥器內(nèi)保存。稱取1.5g 瓊脂樣品，加入100mL 去離子水，在100℃溫度條件下水浴加熱20min 后，加入提前預(yù)熱至60℃的活性氧化鋁2g，在80℃溫度條件下水浴振蕩5min 后過濾，得到處理樣液。向處理后樣液中加入0.500g 磷酸氫二鉀攪拌均勻，經(jīng)121℃高壓滅菌20min 后于100℃水浴中保溫，測定其透明度及濁度。

1.2.4 EDTA掩蔽劑法去除瓊脂磷酸鹽沉淀的作用

稱取1.5g瓊脂樣品，加入100mL去離子水，在100℃水浴中加熱20min 后加入0.020g EDTA，100℃水浴30min，取出靜置至完全凝固，用尼龍布包裹后壓榨脫水，用20倍體積清水浸泡潤洗3次，再次脫水后加水至總體積100mL，100℃加熱熔化后加入0.500g 磷酸氫二鉀攪拌均勻，經(jīng)121℃高壓滅菌20min 后于100℃水浴中保溫，測定其透明度及濁度。

1.2.5 磷酸氫二鉀沉淀法去除瓊脂磷酸鹽沉淀的作用

稱取1.5g瓊脂樣品，加入100mL去離子水，在100℃水浴中加熱20min 后加入0.500g 磷酸氫二鉀在100℃下攪拌5min，靜置10min 進(jìn)行預(yù)沉淀。然后過濾得到處理樣液，待靜置凝固后用尼龍布包裹壓榨脫水，用20倍體積清水浸泡潤洗3次，總體積100mL，100℃加熱熔化后加入0.500g 磷酸氫二鉀攪拌均勻，經(jīng)121℃高壓滅菌20min后于100℃水浴中保溫，測定其透明度及濁度。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析方法

實(shí)驗(yàn)采用3 次平行實(shí)驗(yàn)，平均值為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。利用Microsoft Office Excel 2019 軟件進(jìn)行平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算。利用AutoCAD 2020 軟件進(jìn)行工藝流程圖設(shè)計(jì)。

2 分析與討論

2.1 活性沸石吸附法去除瓊脂中磷酸鹽沉淀的作用

活性沸石由于獨(dú)特的微孔晶體結(jié)構(gòu)及高比表面積，對多種金屬離子具有最大吸附能力?；钚苑惺瘜a和Mg的吸附涉及兩種基本機(jī)制：一種是用溶解的Ca和Mg替換游離沸石離子（Na）或部分結(jié)構(gòu)離子，為表面絡(luò)合過程；另一種是在離子交換作用減小后的靜電吸引、化學(xué)結(jié)合和化學(xué)絡(luò)合過程，為內(nèi)部絡(luò)合過程。研究表明，使用活性沸石對水中鈣、鎂離子去除率可達(dá)到70%和60%。根據(jù)相關(guān)報(bào)道，活性沸石吸附Ca和Mg的功能可能去除瓊脂磷酸鹽沉淀，但目前有關(guān)活性沸石處理對瓊脂中磷酸鹽沉淀影響的研究尚未報(bào)道。圖1 顯示，在未處理?xiàng)l件下，Sigma 瓊脂的透明度明顯高于國產(chǎn)瓊脂條和國產(chǎn)瓊脂粉；濁度顯著低于國產(chǎn)瓊脂條和國產(chǎn)瓊脂粉，該結(jié)果說明國產(chǎn)瓊脂條和瓊脂粉的磷酸鹽沉淀程度要高于Sigma瓊脂。經(jīng)過活性沸石處理后，Sigma 瓊脂、國產(chǎn)瓊脂條和國產(chǎn)瓊脂粉的透明度都有所降低，Sigma 瓊脂的濁度沒有明顯變化，國產(chǎn)瓊脂條和國產(chǎn)瓊脂粉的濁度有所降低。參照日本對生化瓊脂中濁度應(yīng)小于20NUT 的標(biāo)準(zhǔn)，活性沸石吸附法處理瓊脂達(dá)不到生化瓊脂的質(zhì)量水平，也達(dá)不到Sigma 普通瓊脂的質(zhì)量水平。該結(jié)果說明活性沸石吸附法雖然對國產(chǎn)瓊脂條和瓊脂粉具有一定的降低濁度作用，但不能消除瓊脂的磷酸鹽沉淀。該現(xiàn)象的原因可能是瓊脂中引起磷酸鹽沉淀的成分除鈣、鎂離子外，還有其他成分；此外，瓊脂溶液具有一定黏度，降低了沸石對鈣、鎂離子的吸附效果，這可能是另外一個原因。

圖1 活性沸石處理對樣液濁度及透明度的影響

2.2 活性氧化鋁吸附法去除瓊脂中磷酸鹽沉淀的作用

活性氧化鋁特殊的尖晶石結(jié)構(gòu)使其具有高比表面積、高機(jī)械強(qiáng)度和良好的吸附性能?；钚匝趸X對Ca和Mg吸附的基本機(jī)制包括靜電吸引和離子交換，其中靜電吸引適用于堿性環(huán)境，有利于吸附劑表面羥基的去質(zhì)子化，這導(dǎo)致吸附劑表面呈負(fù)電性并通過靜電引力將帶正電的鈣、鎂離子吸附到帶負(fù)電的吸附劑表面上；離子交換則是附著在吸附劑表面的游離離子（Na）有利于與鈣、鎂離子進(jìn)行離子交換。有研究表明，活性氧化鋁對水中鈣、 鎂離子去除率可達(dá)75.6% 和44.16%。Lorenzen 等研究表明，在pH 小于等于8.0，操作溫度小于45℃時，活性氧化鋁的吸附效果最佳。根據(jù)活性氧化鋁吸附Ca和Mg的功能，推測其可能具有降低瓊脂磷酸鹽沉淀的作用，但目前有關(guān)活性氧化鋁處理對瓊脂中磷酸鹽沉淀影響的研究尚未報(bào)道。圖2 顯示，經(jīng)過活性氧化鋁處理后，Sigma 瓊脂、國產(chǎn)瓊脂條和國產(chǎn)瓊脂粉的透明度都比未處理有所降低，而Sigma瓊脂的濁度沒有明顯變化，國產(chǎn)瓊脂條和國產(chǎn)瓊脂粉的濁度顯著降低；該規(guī)律與圖3所示的活性沸石處理后濁度和透明度變化規(guī)律相似，說明活性氧化鋁吸附法不能有效降低瓊脂磷酸鹽沉淀。該現(xiàn)象的原因可能是瓊脂中引起磷酸鹽沉淀的成分復(fù)雜以及瓊脂溶液的黏度影響了活性氧化鋁對鈣、鎂離子的吸附效果。

圖2 活性氧化鋁處理對樣液濁度及透明度的影響

圖3 EDTA處理對樣液濁度及透明度的影響

2.3 EDTA 掩蔽劑法去除瓊脂中磷酸鹽沉淀的作用

EDTA 作為一種氨基多元羧酸螯合劑擁有6 個配位點(diǎn)，分別位于2個氮原子及4個羧基上的氧原子，因此能較好地與大多數(shù)金屬元素形成穩(wěn)定的水溶性配合物。EDTA 去除Ca和Mg的機(jī)理可以概括為絡(luò)合反應(yīng)機(jī)理，如式(1)、式(2)所示。

加入EDTA 與瓊脂溶液充分混合后，EDTA 與鈣、鎂離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)生成可溶于水的鈣、鎂絡(luò)合物，通過脫水將鈣、鎂絡(luò)合物與瓊脂溶液分離，進(jìn)而達(dá)到去除瓊脂中鈣、鎂離子的目的。如圖3所示，經(jīng)過EDTA 處理后瓊脂樣品的濁度顯著降低，透明度顯著提高（均大于等于94.7%）。該結(jié)果說明EDTA掩蔽劑法可有效降低瓊脂磷酸鹽沉淀的程度，這可能與其螯合瓊脂溶液中多價金屬離子的能力有關(guān)。經(jīng)過EDTA 處理后，Sigma 瓊脂、國產(chǎn)瓊脂條及國產(chǎn)瓊脂粉的濁度分別降低至53.61NTU、50.63NTU 和48.03NTU，參照日本對生化瓊脂中濁度應(yīng)小于20NUT的標(biāo)準(zhǔn)，仍然達(dá)不到生化瓊脂的濁度標(biāo)準(zhǔn)要求；這說明EDTA掩蔽法處理可以顯著降低瓊脂磷酸鹽沉淀，但尚達(dá)不到消除瓊脂磷酸鹽沉淀的效果。

2.4 磷酸氫二鉀化學(xué)沉淀法去除瓊脂中磷酸鹽沉淀的作用

磷酸氫二鉀易溶于水，水溶液呈弱堿性，其去除Ca和Mg的機(jī)理可以概括為化學(xué)沉淀反應(yīng)機(jī)理，如式(3)～式(5)所示。

磷酸氫二鉀與Ca及Mg發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成磷酸鈣、磷酸氫鈣及磷酸氫鎂沉淀，從而去除鈣、鎂兩種元素。如圖4所示，經(jīng)過磷酸氫二鉀處理后，Sigma 瓊脂、國產(chǎn)瓊脂條及國產(chǎn)瓊脂粉的濁度相比未處理都顯著降低，透明度也都明顯提高（均大于等于92.0%）。與掩蔽劑法相比，兩種方法處理后透明度都顯著提高；而在降低濁度方面，顯然化學(xué)沉淀法優(yōu)于掩蔽劑法。其中，Sigma 瓊脂和國產(chǎn)瓊脂條經(jīng)過處理后的濁度分別為13.15NTU 和20.27NTU，參照日本對生化瓊脂中濁度應(yīng)小于20NTU 的標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到了生化瓊脂濁度不高于20NTU 的標(biāo)準(zhǔn)。國產(chǎn)瓊脂粉經(jīng)過處理后的濁度為43.84NTU，達(dá)不到生化瓊脂濁度不高于20NTU 的標(biāo)準(zhǔn)。該結(jié)果說明磷酸氫二鉀化學(xué)沉淀法處理Sigma 瓊脂和國產(chǎn)瓊脂條，可以制備得到符合生化瓊脂質(zhì)量要求的瓊脂產(chǎn)品。

圖4 磷酸氫二鉀處理對樣液濁度及透明度的影響

2.5 消除瓊脂磷酸鹽沉淀的工藝設(shè)計(jì)及經(jīng)濟(jì)技術(shù)分析

通過以上研究結(jié)果，磷酸氫二鉀處理Sigma瓊脂和國產(chǎn)瓊脂條，可以將瓊脂的透明度提高至94%以上，將濁度降低至20NTU，符合生化瓊脂的要求。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[33]，以國產(chǎn)瓊脂條為原料，對磷酸鹽沉淀法去除瓊脂磷酸鹽沉淀進(jìn)行工藝設(shè)計(jì)，評估其工藝的產(chǎn)業(yè)化經(jīng)濟(jì)可行性（圖5）。磷酸鹽沉淀法消除瓊脂磷酸鹽沉淀的工藝流程是：國產(chǎn)瓊脂→溶膠→磷酸氫二鉀預(yù)沉淀→過濾→凝膠→機(jī)械脫水→浸洗三次→機(jī)械脫水→干燥→粉碎。其中，溶膠是在蒸煮罐中加熱使瓊脂完全溶解，磷酸氫二鉀預(yù)沉淀是溶膠后加入磷酸氫二鉀形成沉淀，過濾是使用板框壓濾機(jī)使生成的磷酸鹽沉淀與膠液分離，機(jī)械脫水是通過壓榨的方式使瓊脂凝膠與磷酸鹽水溶液分離，浸洗是使用純水浸泡壓榨后的瓊脂凝膠使其中的磷酸鹽溶出，多次浸洗再脫水盡可能去除瓊脂凝膠中殘留的磷酸鹽，干燥是將壓榨脫水后的瓊脂凝膠于45～55℃烘干，粉碎是用粉碎機(jī)將干燥后的瓊脂粉碎過80 目篩。假設(shè)在年產(chǎn)量1000t、每天生產(chǎn)三班、每班為8h制、每班需要1h設(shè)備清洗時間、設(shè)備不均勻系數(shù)取0.75、產(chǎn)品損耗率5%、年工作總天數(shù)300 天的條件下，如式(6)所示，班產(chǎn)量計(jì)算為1.11t。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，1t 國產(chǎn)瓊脂條經(jīng)過處理后可生產(chǎn)0.95t 消除磷酸鹽沉淀的生化瓊脂。根據(jù)阿里巴巴平臺價格，國產(chǎn)瓊脂條售價為13萬元/噸，生化瓊脂的市場售價為24 萬元/噸。根據(jù)年產(chǎn)量1000t 生化瓊脂的工藝設(shè)計(jì)，對生產(chǎn)車間投資總費(fèi)用包括總設(shè)備投資及廠房建設(shè)投資進(jìn)行核算（表1），總設(shè)備投資費(fèi)用為53.48 萬元，廠房建設(shè)投資費(fèi)用為150 萬元。設(shè)備按10 年折舊，余值5%計(jì)算設(shè)備折舊費(fèi)為5.08 萬元，對年生產(chǎn)成本包括水電汽消耗，原材料成本，易耗品成本及其他成本進(jìn)行核算（表2），計(jì)算出年生產(chǎn)成本及年銷售總額分別為14508.75 萬元和24000 萬元。根據(jù)年息稅前利潤[式(7)]及年利潤[式(8)]計(jì)算投資利潤率[式(9)]和靜態(tài)投資回收期[式(10)]分別為64.01%和3.3年，該結(jié)果說明本研究消除瓊脂磷酸鹽沉淀的工藝具有經(jīng)濟(jì)可行性，產(chǎn)業(yè)化前景良好。

圖5 消除磷酸鹽沉淀的工藝流程（單位：mm）

表1 消除瓊脂磷酸鹽沉淀的車間建設(shè)總投資成本核算

表2 年產(chǎn)1000t消除磷酸鹽沉淀的瓊脂生產(chǎn)成本核算

3 結(jié)論

通過采用不同方法處理Sigma瓊脂、國產(chǎn)瓊脂粉及國產(chǎn)瓊脂條，探索消除瓊脂磷酸鹽沉淀的方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入磷酸氫二鉀處理后Sigma瓊脂和國產(chǎn)瓊脂條，可以將瓊脂的透明度提高至94%以上，將濁度降低至20NTU，符合生化瓊脂的要求。工藝設(shè)計(jì)及經(jīng)濟(jì)成本核算表明，采用磷酸氫二鉀法處理國產(chǎn)瓊脂條消除磷酸鹽沉淀，每處理1t國產(chǎn)瓊脂條可增加收益約9.8 萬元，總投資利潤率為64.01%，靜態(tài)投資回收期為3.3年。該研究建立的消除瓊脂磷酸鹽沉淀的工藝具有經(jīng)濟(jì)可行性，為國產(chǎn)化微生物培養(yǎng)基所用的生化瓊脂的提供技術(shù)參考。