口腔鱗狀細胞癌中PD-L1的表達與P16、HPV感染以及淋巴結轉移關系分析

杜靜冰，崔銀江，孔耀

（新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院 口腔科，河南 新鄉(xiāng)453000）

頭頸部是惡性腫瘤常發(fā)部位之一,頭頸部惡性腫瘤的發(fā)病率居于所有惡性腫瘤的第六位,其中口腔鱗狀細胞癌是其主要類型,全球每年新增口腔鱗狀細胞癌也在45萬[1]。口腔鱗狀細胞癌預后不良，且在過去50年內(nèi)其臨床治療預后并未得到明顯的改善。對于口腔鱗狀細胞癌這種實體腫瘤而言，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種免疫應答逃逸機制,如調(diào)節(jié)性T細胞的免疫聚集就是其中最常見的一種[2]。最新研究顯示，程序性死亡分子-L1(PD-1)可表達于腫瘤細胞膜表面,其配體如PD-L1可表達于抗原提呈細胞、活化的T細胞及腫瘤細胞中，PD-L1可調(diào)節(jié)T細胞免疫聚集來激活腫瘤細胞的炎性破壞，因此,阻斷PD-1/PD-L1通路可逆轉腫瘤免疫抑制，從而達到抗腫瘤治療的目的[3,4]。但PD-L1與口腔鱗狀細胞癌病情發(fā)展標志物的關系尚未見報道,鑒于此，本研究以本院近期收集到的口腔鱗狀細胞癌組織蠟塊為研究標本,觀察口腔鱗狀細胞癌中PD-L1的表達與乳頭瘤病毒-16(P16)、人乳頭瘤病毒(HPV)感染以及淋巴結轉移有關，并初步探討PD-L1在口腔鱗狀細胞癌病情發(fā)展中的作用，為口腔鱗狀細胞癌免疫療法提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本院于2017年6月至2018年6月期間手術治療的口腔鱗狀細胞癌51例，所有患者均經(jīng)臨床組織學病理證實為口腔鱗狀細胞癌，且臨床病理資料完整。51例口腔鱗狀細胞癌患者：性別比：男27例，女24例；平均年齡53.81±5.74周歲(年齡跨度36～64周歲)；美國癌癥聯(lián)合會淋巴結轉移臨床分期：Ⅰ期17例、Ⅱ期14例、Ⅲ期14例、Ⅳ期6例。

1.2 研究方法 所有患者手術病灶組織蠟塊標本均采用磷酸緩沖液配置的甲醛固定液固定,并采用乙醇梯度脫水,以石蠟包埋,于本院病理中心作4μm連續(xù)切片。采用免疫組化染色法檢測口腔鱗狀細胞癌組織標本PD-L1、P16及HPV表達情況，染色過程中兔抗人PD-L1單克隆抗體、兔抗人P16單克隆抗體、兔抗人HPV單克隆抗體均采用PBS溶液1：150稀釋，然后進行SP免疫組化染色。采用雙盲法由2名研究人員判定染色結果,每份染色結果觀察(×200)。染色結果判定方法為[8]：首先對染色結果的強度進行評價，并按顏色深淺度分為無著色(計 0 分)、淡黃色(計 1 分)、棕黃色(計 2 分)、棕褐色(計3分);然后按照每個視野陽性細胞占比進行計分,即占比≦5%計0分、占比5%～25%計1分、占比25%～50%計2分、占比50%～75%計3分、占比≧75%計4分;最后將兩種計分相加,所得分數(shù)0～4分為陰性,5～6分為弱陽性，7分為強陽性。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學處理與分析。陰性率、陽性率等分類資料采用頻率(%)表示，年齡等計數(shù)資料以均數(shù)±標準差表示。采用Spearman等級相關性分析法分析口腔鱗狀細胞癌中PD-L1的表達與P16、HPV感染以及淋巴結轉移關系的相關性,P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意見義。

2 結果

2.1 PD-L1及P16在口腔鱗狀細胞癌組織中表達情況分析 51例口腔鱗狀細胞癌組織中，PD-L1呈陽性表達44例 (86.27%)，PD-L1呈陰性表達7例 (13.72%),其中PD-L1強陽性表達31例(60.78%),PD-L1弱陽性表達 11例(21.57%)，見圖1。51例口腔鱗狀細胞癌組織中，P16呈陽性表達22例(43.14%)，P16 呈陰性表達 29 例(56.86%)，其中 P16強陽性表達9例 (17.65%)，P16弱陽性表達13例(25.49%)，見圖 2。

圖1 PD-L1在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達(×200)

圖2 P16在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達(×200)

2.2 口腔鱗狀細胞癌組織中PD-L1與P16的相關性分析 經(jīng)Spearman等級相關性分析顯示,口腔鱗狀細胞癌組織中的PD-L1表達與P16表達呈負相關 (rs=-0.819，P=0.000)，即口腔鱗狀細胞癌組織PD-L1陽性表達44例中，29例P16表達呈陰性，而口腔鱗狀細胞癌組織PD-L1陰性表達7例中，全部P16表達呈陽性。見表1。

表1 口腔鱗狀細胞癌組織中PD-L1及P16之間的相關性分析表

2.3 口腔鱗狀細胞癌組織中PD-L1與淋巴結轉移分期的相關性分析 經(jīng)Spearman等級相關性分析顯示:口腔鱗狀細胞癌組織中的PD-L1表達與淋巴結轉移分期之間呈負相關（rs=-0.736，P=0.000），即口腔鱗狀細胞癌組織PD-L1陽性表達44例中，17例為NO分期0期，14例為NO分期1期，13例為NO分期2期,而口腔鱗狀細胞癌組織PD-L1陰性表達7例中，1例為NO分期2期，6例為NO分期3期。見表2。

表2 口腔鱗狀細胞癌組織中PD-L1及淋巴結轉移分期之間的相關性分析表

2.4 口腔鱗狀細胞癌組織中PD-L1與HPV感染的相關性分析 經(jīng)Spearman等級相關性分析顯示：口腔鱗狀細胞癌組織中的PD-L1表達與HPV感染呈正相關(rs=0.653，P=0.000)，即口腔鱗狀細胞癌組織PD-L1陽性表達44例中，39例為HPV表達陽性，5例為HPV表達陰性，而口腔鱗狀細胞癌組織PD-L1陰性表達7例中，1例為HPV表達陽性，6例為HPV表達陰性。見表3。

表3 口腔鱗狀細胞癌組織中PD-L1與HPV感染之間的相關性分析表

3 討論

口腔鱗狀細胞癌被認為是一種免疫性疾病，其病情發(fā)展與高度的免疫抑制密切相關[5]。而最新研究顯示細胞表面PD-L1的高表達是口腔鱗狀細胞癌潛在的發(fā)病機制,其通過PD-L1與PD-1結合觸發(fā)抑制性信號,從而抑制T細胞免疫效益或消弱其腫瘤細胞殺傷能力[6]。當前,以PD-L1與PD-1信號通路為靶向的免疫治療在臨床試驗中已經(jīng)取得了一定的進展,同時也有研究顯示這種免疫治療的臨床取決于腫瘤細胞膜中PD-L1的表達情況，表明PD-L1的有效控制在口腔鱗狀細胞癌免疫治療中起到重要作用[7,8]。但PD-L1與口腔鱗狀細胞癌病情進展的關系尚未見報道,對此進行研究可為抑制性分子PD-L1來介導免疫抑制提供理論參考。

本研究采用免疫組化染色法檢測了51例口腔鱗狀細胞癌患者組織中PD-L1表達情況,結果顯示：51例口腔鱗狀細胞癌組織中，PD-L1呈陽性表達44例(86.27%)，這與既往研究報道[9,10]基本吻合（76.4～91.0%）。對于PD-L1在口腔鱗狀細胞癌組織中高表達的機制,有如下推測：PD-1/PD-L1通路可在惡性腫瘤進展期間對免疫功能具有一定的抑制作用,但是由于主要淋巴器官能激發(fā)強烈免疫應答的外源性抗原,因此導致T淋巴細胞的反向應力作用，導致特異性的調(diào)高PD-L1表達[11]。P16是一種HPV感染而形成的替代性指標,在許多實體腫瘤研究已經(jīng)證實于口腔鱗狀細胞癌病情進展有關，其低表達可導致HPV感染加重[12]。本研究51例口腔鱗狀細胞癌組織中，P16呈陽性表達22例(43.14%)，P16 呈陰性表達 29 例(56.86%)，而在口腔鱗狀細胞癌組織PD-L1陽性表達44例中，29例P16表達呈陰性,而口腔鱗狀細胞癌組織PD-L1陰性表達7例中，全部P16表達呈陽性，可見口腔鱗狀細胞癌組織中的PD-L1表達與P16表達存在一定的相關性，這一研究結果與Farrow[13]研究結果相符。同時本研究還顯示，口腔鱗狀細胞癌組織中的PD-L1表達與P16表達呈負相關(rs=-0.819，P=0.000),提示PD-L1高表達在一定程度上可促進P1 6低表達，從而促進口腔鱗狀細胞癌病情進展。

在口腔鱗狀細胞癌臨床危險因素研究中，除吸煙和酗酒外，HPV感染也是口腔鱗狀細胞癌的重要的危險因素[14]。在美國，口咽鱗狀細胞癌的發(fā)病有40%～80%是由于HPV感染所引起，其機制被認為是長期HPV感染所引起的免疫功能下降所導致的癌變[15]。有研究指出，HPV感染也是導致口腔鱗狀細胞癌患者趨于年輕化的重要原因,且HPV陽性的口腔鱗狀細胞癌患者臨床治療預后明顯差于HPV陰性的口腔鱗狀細胞癌患者[16]。本研究結果顯示,口腔鱗狀細胞癌組織中的PD-L1表達與HPV感染呈正相關(rs=0.653，P=0.000)，即口腔鱗狀細胞癌組織PD-L1陽性表達 44例中，39例為HPV表達陽性，5例為HPV表達陰性，而口腔鱗狀細胞癌組織PD-L1陰性表達7例中，1例為HPV表達陽性，6例為HPV表達陰性。這研究結果表明，PD-L1高表達與HPV感染有一定的關系，其可能機制為口腔鱗狀細胞癌患者的HPV感染起源于扁桃體,即通過扁桃體感染來調(diào)節(jié)口腔中的主要淋巴器官,導致HPV感染的扁桃體隱窩深部淋巴組織細胞長期與高濃度的外來免疫抗原接觸，從而導致扁桃體隱窩處高表達的HPV并對下調(diào)T細胞的功能，最終促進PD-L1的高表達，從而形成HPV病毒感染后的口腔鱗狀細胞癌免疫逃避機制和惡性轉化機制[17]?？梢奌PV感染可促進PD-L1高表達,從而促進口腔鱗狀細胞癌病情進展。本研究進一步研究還顯示口腔鱗狀細胞癌組織中的PD-L1表達與淋巴結轉移分期之間呈負相關 (rs=-0.736，P=0.000)，即口腔鱗狀細胞癌組織中的PDL1高度表達,在一定程度上可促進淋巴結轉移。在國內(nèi)外文獻中對此缺乏統(tǒng)一結論，多數(shù)研究認為口咽鱗狀細胞癌PD-L1的高表達與淋巴結轉移分期有關[18,19]，另有研究報道認為口腔鱗狀細胞癌組織中PD-L1高表達僅與遠處轉移,其作用機制也與長期HPV感染所導致的口腔鱗狀細胞癌免疫逃避機制和惡性轉化機制有關[20]，因此PD-L1的高表達也可促進淋巴結轉移,也與口腔鱗狀細胞癌病情進展密切相關。

綜上所述，本文結果顯示，PD-L1在口腔鱗狀細胞癌組織中呈高度表達，且與P16低表達、HPV感染以及淋巴結轉移密切相關,與P16低表達、HPV感染以及淋巴結轉移共同促進口腔鱗狀細胞癌病情進展。盡管PD-L1可通過P16、HPV感染及淋巴結轉移來抑制口腔鱗狀細胞癌患者免疫功能，在臨床免疫靶向治療中也得到了重視，但由于PD-L1生物學特征及信號轉導途徑尚未完全明確,因此仍然需要以更大的前瞻性研究來證實PD-L1在口腔鱗狀細胞癌病情發(fā)展的作用,才能真正有助于口腔鱗狀細胞癌免疫療法的完善。