TLR4/NF-κB 通路在慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉和不伴鼻息肉的黏膜上皮修復(fù)機制中的作用

劉亮亮，文 華，楊 瑾，盧媛媛，王正輝

（1.西安交通大學(xué)醫(yī)院眼耳鼻咽喉科，陜西 西安 710049；2.西安交通大學(xué)醫(yī)院公共衛(wèi)生中心，陜西 西安 710049；3.西安交通大學(xué)醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710049；4.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科病院，陜西 西安 710004）

慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉（chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP）和慢性鼻-鼻竇炎不伴鼻息肉（chronic rhinosinusitis without nasal polyps，CRSsNP）是臨床上常見的鼻腔、鼻竇炎性病癥慢性鼻-鼻竇炎（chronic rhinosinusitis，CRS）的2 個亞型。既往的研究表明CRSwNP 和CRSsNP 在發(fā)病機制、治療、預(yù)后等方面存在明顯差異[1]；但近來的研究證實[2]，鼻竇黏膜上皮細胞損傷、黏膜脫落是兩者共同的病理學(xué)特征改變。Stevens WW 等[3]研究證實，鼻竇黏膜損傷后，上皮細胞自行的異常修復(fù)直接導(dǎo)致鼻粘膜組織結(jié)構(gòu)的改變，進而影響鼻竇黏膜組織功能的改變以及鼻竇病變的產(chǎn)生。細胞中的多種蛋白因子或者參與，或者直接調(diào)控了上皮細胞損傷后的自行修復(fù)。表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）能夠刺激上皮細胞的增殖，調(diào)控細胞的粘附和遷移在鼻竇黏膜損傷后修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[4]。Toll 樣受體4/核轉(zhuǎn)錄因子-κB（TLR4/NF-κB）通路是廣泛存在細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細胞的增殖與凋亡，損傷與修復(fù)、炎性與應(yīng)激等生理過程中發(fā)揮了重要作用[5]。研究表明[6]，細胞損傷后，TLR4/NF-κB通路被激活，驅(qū)動炎性細胞因子的大量產(chǎn)生，進而加重炎性反應(yīng)。Zhang QI 等[7]通過臨床研究證實，TLR4在CRS 的2 個壓型CRSwNP 和CRSsNP 存在表達差異的現(xiàn)象。而TLR4/NF-κB 在CRS 中鼻竇黏膜上皮細胞增殖作用的報道罕見。本研究旨在探討TLR4/NF-κB 信號通路對CRSwNP 和CRSsNP 中鼻竇黏膜上皮細胞增殖的作用，以期為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本 收集2018 年3 月-2021 年9 月就診于西安交通大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科且在鼻內(nèi)鏡下接受手術(shù)治療的30 例患者的鼻篩竇黏膜上皮組織。將CRS 患者標(biāo)本組分為CRSsNP 組和CRSwNP 組，每組10 例。CRSsNP 組男6 例，女4 例；年齡19～56歲，中位年齡43 歲；CRSwNP 組男7 例，女3 例；年齡22～58 歲，中位年齡45 歲；對照組標(biāo)本來源于進行視覺性鼻整形術(shù)的10 例患者，男5 例，女5 例；年齡22～48 歲，中位年齡44 歲，術(shù)中所見均無鼻竇炎癥性疾病。各組患者的性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；且經(jīng)鼻竇CT 檢測，無支氣管哮喘、糖尿病并發(fā)癥、阿司匹林耐受不良、鼻竇真菌或細菌或病毒感染、妊娠、惡性腫瘤以及鼻絨毛不動綜合癥和免疫功能缺陷癥等，所有患者均未首次采用鼻內(nèi)鏡手術(shù)，術(shù)前均未曾使用激素或者抗組胺類藥物。本研究中患者的診斷均參照EPOS-2012（2012 歐洲CRS 科研與診斷意見書）的標(biāo)準(zhǔn)進行，對照組患者均無鼻竇炎性病癥。

1.2 細胞及主要試劑和儀器 TLR4/NF-κB 信號通路抑制劑PDTC（美國Selleckchem 公司），多聚甲醛（南京卓普生物科技有限公司），DMEM 培養(yǎng)基（Gibco 公司）；HE 染色劑（Thermo Fisher scientific 公司）；胰蛋白酶（Amersco 公司）；TLR4、NF-κB 抗體（Santa Cruz，CA，USA）；免疫組化試劑盒、CCK-8 試劑盒（Thermo 公司）。CO2細胞培養(yǎng)箱（SHELLAB 公司，美國），細胞培養(yǎng)板（美國Costar 公司），MK3 酶標(biāo)儀（日本島津公司），超凈工作臺（北京六一儀器廠），LEICA激光共聚焦熒光顯微鏡（德國徠卡公司）。

1.3 HE 染色鼻黏膜組織病理學(xué)觀察 從樣品中取等量的后組篩竇黏膜上皮組織，10%多聚甲醛固定，HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組鼻黏膜組織病理學(xué)改變情況。

1.4 免疫組化法檢測TLR4 以及NF-κB 的蛋白表達從樣品中取等量的前組篩竇黏膜上皮組織，常規(guī)固定包埋并切片，用二甲苯和梯度乙醇脫蠟后置于檸檬酸鹽緩沖液中進行修復(fù)，以充分暴露抗原決定簇。然后用3%的雙氧水室溫下浸泡10 min，封閉，分別加稀釋好的一抗4 ℃過夜孵育，次日沖洗干凈，分別加入適量生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育30 min，清洗。加適量二氨基聯(lián)苯胺（DAB）作用2～5 min 后用去離子水終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染1.5～2 min，清洗后于乙醇梯度脫水，二甲苯浸泡并干燥后用中性樹膠封片，鏡檢觀察并記錄實驗結(jié)果；染色評判標(biāo)準(zhǔn)以腫瘤細胞細胞膜和細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性，每個切片隨機取10 個400 倍視野，以100 個細胞為計數(shù)單位，按染色面積及細胞被染色強度計分，計分原則如下：染色面積范圍≤10%為0 分，＞10%～25%為1 分，＞25%～50%為2 分，＞5%～75%為3 分，＞75%為4 分；細胞無染色0 分，弱黃色1 分，黃色染色2 分，棕黃色3 分。若兩者積分之和大于或等于3 分則為陽性，低于3 分則為陰性。切片的結(jié)果由腫瘤院病理科兩位醫(yī)師雙盲閱片，單獨評分，最后統(tǒng)一匯總，對有爭議的評分需要經(jīng)病理科兩位以上主任復(fù)核修訂，得到最終結(jié)果。

1.5 鼻粘膜上皮細胞的提取以及離體培養(yǎng) 從樣品中取等量的中組篩竇黏膜上皮組織，無菌生理鹽水清洗3 次，維持4 ℃置于胰蛋白酶（trypsin，濃度0.25%）和乙二胺四乙酸（EDTA，濃度0.01%）混合液中15～20 h，1000 rpm 離心3 min 去掉上清液，PBS緩沖液沖洗沉淀物3 次，加入200 ml 以3∶1 比例的含10%胎牛血清的DMEM 和Ham's F 的培養(yǎng)液以懸浮細胞，放置于溫度37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.6 CCK-8 法檢測鼻黏膜上皮細胞的增殖 當(dāng)細胞單層生長接近完全融合時，將細胞制成單細胞懸液，以1×105個/ml 的濃度接種在96 孔培養(yǎng)板中，置于溫度37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中24 h 后，分組依次進行CCK-8 實驗。本試驗分為4 組，各組添加等體積的相同濃度的細胞培養(yǎng)液，分別施加以下4 種刺激因素[8]：空白對照組；EGF 組（添加5 ng/ml EGF，劑量50 ml）；TLR4/NF-κB 組（依次添加5 ng/ml TLR4 和NF-κB 培養(yǎng)24 h 后，添加5 ng/ml EGF）；PDTC 組（添加5 ng/ml 信號通路抑制劑PDTC 培養(yǎng)12 h 后，添加5ng/ml TLR4 和NF-κB 培養(yǎng)12 h 后，添加5 ng/ml EGF），37℃，5%CO2生化培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后每孔加入20 μl CCK-8 溶液后再恒溫孵育5 h，待完全顯色后，100 rpm，10 min，棄掉上清液，Multiskan MK3 酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測吸光值A(chǔ)。

1.7 ELISA 檢測各組鼻黏膜上皮細胞中IL-β、IL-5的表達 調(diào)整細胞濃度至1×104個/ml 接種于24 孔板中，分組處理1.6，37 ℃，5%CO2生化培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，ELISA 試劑盒檢測各組細胞中IL-β、IL-5 的水平；每個樣本獨立重復(fù)測量3 次。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 本研究數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0，作圖工具采用Graphpad 5.01，免疫組化結(jié)果采用秩和檢驗，3 組樣本間的差異比較采用Kruskal-Wallis分析，兩兩樣本間的比較采用Mann WhitneyU檢驗。不同刺激條件下的結(jié)果分析采用方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRS 患者CT 檢查 CRSsNP 和CRSwNP 組典型的實體和CT 檢查見圖1，依照[9]Lund-Mackay 方法進行評分。對兩組患者鼻竇以及其復(fù)合體分別評分，正常記為0 分，部分陰影記為1 分，全部陰影記為2分。評分結(jié)果顯示，與CRSsNP 組（7.76±4.66）分相比，CRSwNP 組的鼻竇CT 評分為（16.82±8.25）分。從CT 檢查來看CRSwNP 組患者具有更為嚴重的鼻腔、鼻竇黏膜病變。

圖1 典型的CRSsNP 和CRSwNP 實體圖（SP×200）及其對應(yīng)CT 圖

2.2 HE 鼻黏膜組織病理學(xué)觀察 對照組患者的鼻粘膜組織結(jié)構(gòu)完整，假復(fù)層柱狀纖毛清晰可辨，纖毛粗細均勻，排列整齊，黏膜下層的纖維結(jié)締組織少量分布，黏膜上皮細胞排列均勻，結(jié)構(gòu)完整；CRSsNP 組患者的鼻粘膜組織纖毛紊亂，粗細不一，假復(fù)層柱狀和復(fù)層鱗狀結(jié)構(gòu)同時存在，上皮細胞基質(zhì)增厚明顯，細胞間質(zhì)明顯水腫，大量炎性細胞浸潤，以中性粒細胞浸潤為主，成纖維細胞明顯增多，杯狀細胞數(shù)量明顯增多；CRSwNP 組患者的鼻粘膜組織上皮細胞結(jié)構(gòu)不完整，甚至有脫落現(xiàn)象，杯狀細胞數(shù)量增多，黏膜基膜增厚，黏膜固有層可見嗜酸性炎性細胞大量浸潤，腺體腫大明顯，數(shù)量明顯減少，息肉中無神經(jīng)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)且無新生血管，見圖2。

圖2 HE 染色病理圖片（SP×400）

2.3 免疫組化法檢測TLR4 以及NF-κB 的蛋白表達免疫組化法檢測TLR4 以及NF-κB 的蛋白表達結(jié)果見圖3，TLR4 主要在胞膜和胞質(zhì)內(nèi)大量表達，鼻黏膜假復(fù)層柱狀纖毛上皮中大量分布，染成棕黃色；NF-κB 主要在胞核和胞質(zhì)內(nèi)大量表達，鼻黏膜假復(fù)層柱狀纖毛上皮以及固有腺體細胞中大量分布。與對照組患者相比，CRSsNP 組、CRSwNP 組患者的鼻粘膜組織中TLR4、NF-κB 的表達量升高（P＜0.05）；與CRSsNP 組患者相比，CRSwNP 組患者的鼻粘膜組織中TLR4、NF-κB 的表達量升高（P＜0.05）。

圖3 免疫組化法檢測TLR4 以及NF-κB 的蛋白表達（SP×400）

2.4 CCK-8 法檢測各組黏膜上皮細胞的增殖活性利用CCK-8 法檢測TLR4/NF-κB 信號通路及抑制劑對鼻黏膜上皮細胞增殖的作用，結(jié)果見圖4，與對照組相比，CRS 患者鼻粘膜上皮細胞的增殖基線降低（P＜0.05）；與CRSsNP 組相比，CRSwNP 組患者鼻粘膜上皮細胞的增殖基線升高（P＜0.05）；對照組和CRS 組加入EGF 后，與空白對照相比，鼻粘膜上皮細胞的增殖基線升高（P＜0.05）；加入TLR4 和NFκB 后，與空白對照相比，鼻粘膜上皮細胞的增殖基線降低（P＜0.05），說明加入TLR4 和NF-κB 明顯抑制了EGF 對鼻粘膜上皮細胞的增殖作用；加入PDTC 后，EGF 誘導(dǎo)細胞增殖的作用有所恢復(fù)（P＜0.05）。說明TLR4 和NF-κB 抑制了對照組和CRS組鼻粘膜上皮細胞的增殖，但是PDTC 可以減弱這種抑制作用，。

圖4 CCK-8 法檢測各組黏膜上皮細胞的增殖活性

2.5 各組黏膜上皮細胞炎性因子IL-β、IL-5 的表達情況 ELISA 試劑盒檢測各組細胞中IL-β、IL-5 的水平，結(jié)果見圖5，與對照組相比，CRS 組患者鼻粘膜上皮細胞中IL-β、IL-5 的水平升高（P＜0.05）；與CRSsNP 組相比，CRSwNP 組患者鼻粘膜上皮細胞中IL-β、IL-5 的水平升高（P＜0.05）；對照組和CRS 組加入EGF 后，與空白對照相比，鼻粘膜上皮細胞中IL-β、IL-5 的水平降低（P＜0.05）；加入TLR4 和NFκB 后，與空白對照相比，鼻粘膜上皮細胞中IL-β、IL-5 的水平升高（P＜0.05），說明加入TLR4 和NFκB 明顯激活了鼻粘膜上皮細胞的炎癥作用；加入PDTC 后，鼻粘膜上皮細胞中IL-β、IL-5 的水平明顯有所降低（P＜0.05）。說明TLR4 和NF-κB 明顯激活了鼻粘膜上皮細胞的炎癥作用，但是PDTC 可以減弱這種激活作用。

圖5 ELISA 試劑盒檢測各組細胞中IL-β、1L-5 的水平

3 討論

CRSsNP 和CRSwNP 都是上呼吸道系統(tǒng)炎性疾病，目前關(guān)于CRSsNP 和CRSwNP 的發(fā)病機制存在變態(tài)反應(yīng)、免疫失衡、微生物膜感染等多種假說[10]，具體發(fā)病機制仍未明確。由于兩者在患者主觀感受、臨床表現(xiàn)、組織病理、治療以及預(yù)后方面的諸多差異，將兩者同時同步研究的報道較少[11]。近來研究表明[12]，諸多信號通路在CRSsNP 和CRSwNP 的上皮細胞修復(fù)中發(fā)揮趨勢一致的作用。本研究中亦從CRSsNP 和CRSwNP 兩種疾病的鼻粘膜上皮細胞損傷與修復(fù)的角度出發(fā)，尋找可以治療CRSsNP 和CRSwNP 兩者的靶向位點。

臨床研究表明[13]，CT 檢查評分以及HE 染色觀察是目前針對CRS 患者病變程度的客觀評價的重要手段。本研究針對CRSsNP 和CRSwNP 的CT 檢查表明，與CRSsNP 組（7.76±4.66）分相比，CRSwNP組的鼻竇CT 評分為（16.82±8.25）分，推斷CRSwNP組患者具有更為嚴重的鼻腔、鼻竇黏膜病變。HE 觀察結(jié)果對照組患者的鼻粘膜組織結(jié)構(gòu)完整，CRSsNP組患者鼻粘膜組織纖毛紊亂，以中性粒細胞浸潤為主，成纖維細胞明顯增多，杯狀細胞數(shù)量明顯增多，CRSwNP 組患者的鼻粘膜組織杯狀細胞數(shù)量增多，黏膜基膜增厚，黏膜固有層可見嗜酸性炎性細胞大量浸潤，腺體腫大明顯，數(shù)量明顯減少，息肉中無神經(jīng)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)且無新生血管。因此，推斷CRSwNP 組患者的鼻粘膜病理更為嚴重。

對CRS 的信號通路的研究能更從更深層次的揭示患者的發(fā)病機制，推斷基因靶向治療或者更準(zhǔn)確的探針診斷。目前炎癥信號通路TLR4/NF-κB 和炎癥因子在CRS 中的作用引起廣泛關(guān)注[14]。Hirschberg A 等[15]研究表明上調(diào)或者下調(diào)TLR4 的表達能明顯CRSsNP 和CRSwNP 患者的發(fā)病和治療及預(yù)后。Kaczmarek M 等[16]通過臨床研究表明，Toll 樣受體具有靶向治療CRS 的潛力。華麗等[17]報道，抑制TLR4/NF-κB 信號通路能下調(diào)炎性遞質(zhì)的產(chǎn)生和釋放。林甦等[18]研究證實，下調(diào)TLR4/NF-κB 信號通路的表達能明顯減輕鼻粘膜的損害，抑制鼻粘膜的炎性反應(yīng)，改善變應(yīng)性鼻炎癥狀。但未見有TLR4/NF-κB 通路在鼻粘膜上皮細胞修復(fù)中的作用。

本研究中采用CCK-8 法檢測各組鼻粘膜上皮細胞的增殖活性，結(jié)果表明對照組和CRS 組加入EGF 后，與空白對照相比，鼻粘膜上皮細胞的增殖基線升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；單獨加入TLR4 和NF-κB 后，與空白對照相比，鼻粘膜上皮細胞的增殖基線降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明加入TLR4 和NF-κB 明顯抑制了EGF 對鼻粘膜上皮細胞的增殖作用；加入PDTC 后，EGF 誘導(dǎo)細胞增值的作用有所恢復(fù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。說明TLR4 和NF-κB 抑制了對照組和CRS 組鼻粘膜上皮細胞的增殖，但是PDTC 可以阻斷這種抑制作用。

炎癥性病變是CRS 鼻粘膜上皮中最重要的病理改變。研究顯示[19]，IL-β、IL-5 屬于脂肪蛋白因子，也是黏膜上皮中重要的促炎因子，炎性因子的大量積累能夠介導(dǎo)氧化應(yīng)激、反饋激活炎癥TLR4/NF-κB信號通路，使上皮細胞的損傷加劇[20]。胡琛等[21]研究表明，活化后的TLR4 能進一步誘導(dǎo)更廣泛的級聯(lián)反應(yīng)激活NF-κB，使NF-κB 發(fā)生核移位，轉(zhuǎn)導(dǎo)信號進入細胞核內(nèi)，激活更多的細胞內(nèi)炎癥通路。研究顯示[22]，NF-κB 被激活后，調(diào)控更多相關(guān)炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)IL-β、IL-5 等細胞因子的釋放，更進一步放大炎癥反應(yīng)。本研究中采用ELISA 法檢測炎性因子的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制TLR4/NF-κB 信號通路后能降低IL-β、IL-5 的表達（P＜0.05）。

總之，本研究證明TLR4/NF-κB 信號通路影響CRS 中CRSsNP 和CRSwNP 兩者鼻粘膜上皮細胞損傷后的修復(fù)，抑制TLR4/NF-κB 信號通路能明顯增強CRS 患者鼻粘膜上皮細胞的增殖作用。但是如何將這其中的作用機制應(yīng)用到臨床治療CRSsNP 和CRSwNP 兩者上阿托伐他汀還待進一步的研究。