金耳多糖的研究進展

孫 濤，姜 浩，王燕玲，王詩雨，彭雯杰，雷 鵬*，王 瑞，徐 虹，李 莎，孫達鋒

（1 南京工業(yè)大學食品與輕工學院 南京 211816 2 中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所 昆明 650032）

金耳（Naematelia aurantialba）是擔子菌門銀耳目耳包革屬的一種膠體食用菌[1-2]。它是一種稀有的食用菌，因其良好的營養(yǎng)價值和生物活性，故在我國常被用作傳統(tǒng)醫(yī)藥和食品[3]。多糖是金耳中的主要活性成分之一。現(xiàn)已證明，金耳多糖（Naematelia aurantialba polysaccharide）具有多種功能，包括抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血脂、抗糖尿病和免疫調(diào)節(jié)等[4]。許多研究者采用不同的方法制備金耳多糖，以提高其應用價值。不同來源（金耳子實體、菌絲體發(fā)酵液、孢子發(fā)酵液）、不同提取方法（熱水提取、超聲提取、酶提取等方法）制備的金耳多糖的化學組成、結構及生物活性具有一定差異。本文闡述金耳多糖的制備、結構特征、生物活性以及工業(yè)應用等方面的研究進展，為金耳多糖的進一步開發(fā)提供參考。

1 金耳多糖的制備

1.1 金耳多糖的提取

獲得金耳多糖的途徑大致包括3 種：1） 從天然或者人工栽培的金耳子實體中提取，2） 從發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體或發(fā)酵液中提取，3） 從發(fā)酵培養(yǎng)的金耳孢子發(fā)酵液中提取。目前，擔子菌多糖的提取方法有溶液浸提法、酶解提取法、超聲提取法、微波提取法、超臨界萃取法以及多方法聯(lián)合[5-6]。從原理說上，以上方法均適用于金耳多糖的提取。然而，現(xiàn)有的金耳多糖的提取方法較為局限，主要采用以下3 種方法：水提取法、超聲波提取法和酶解法。

1.1.1 子實體提取途徑 金耳子實體是由金耳寄生于毛韌革菌（Stereum hirsutum）而形成的，野生金耳生長在高山櫟或高山剌櫟等樹干上，由于人類的大肆采集和生長環(huán)境惡劣造成野生金耳資源的匱乏。近年來，劉正南等[7]將目光放在了人工栽培金耳的方向上，通過解決金耳生長困難的兩個因素（其一是生長因子——金耳伴生菌，其二是其生存環(huán)境——高山櫟），成功完成了金耳的引種馴化。在此基礎上，不同研究者使用不同的提取方法并對金耳子實體多糖的提取工藝進行了優(yōu)化（表1）。

表1 金耳子實體多糖的提取方法Table 1 Extraction method of polysaccharides from N.aurantialba fruiting body

水提取法作為一種傳統(tǒng)的食用菌多糖提取方法，由于其具有操作簡單、所需設備少等優(yōu)點成為了提取金耳多糖（包括子實體多糖和菌絲體多糖）最常見的方法，然而，其存在處理時間較長、能耗高和操作溫度高等問題。高觀世等[8]采用熱水浸提法對子實體進行處理并通過正交試驗優(yōu)化了提取工藝，最終金耳多糖的得率為26.19%，最優(yōu)條件為熱水浸提1.1 h，溫度100 ℃，浸提3 次，料液比1∶40。

超聲波法是一種提取食用菌多糖的新型方法，該方法提取金耳多糖的原理是利用超聲波的空化效應釋放大量能量從而產(chǎn)生的高剪切力使得金耳細胞壁破裂，最終提高金耳多糖提取產(chǎn)率和效率。然而，該方法存在2 個問題：1）超聲波輔助提取期間的溫升難以監(jiān)控，這可能導致結果重現(xiàn)性低。2）超聲波處理會降低金耳多糖的分子質(zhì)量和破壞多糖的三維分子結構從而改變金耳多糖的生物活性。鐘姝霞等[9]采用超聲提取法對金耳子實體進行處理并通過正交試驗優(yōu)化了超聲波浸提溫度與超聲波浸提功率，最終金耳多糖的得率為17.36%，提取條件為超聲波處理30 min，超聲波處理功率400 W，浸提時間30 min,浸提溫度70 ℃，料液比為1∶80。

金耳子實體生長于樹木上，其子實體上含有大量的纖維素及果膠，利用纖維素酶、果膠酶等酶可以裂解細胞使得金耳多糖被釋放出來。該技術具有操作簡便、特異性高、環(huán)保、高效、低能耗、操作溫度低等優(yōu)點。通常不破壞多糖的三維分子結構，從而有助于維持其生物活性。然而，高成本是酶提取法的主要缺點之一。此外，由于酶活性會受到多個因素的影響，如溫度、溶解氧、金屬離子等，因此該方法在規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)中的應用具有很大局限性。游金坤等[10]采用酶法處理金耳子實體并通過響應面試驗優(yōu)化了提取方法，最終金耳多糖的得率為（12.69±0.52）%，最優(yōu)條件為復合酶（果膠酶和纖維素酶）添加量20.50 mg/g，液料比347∶1，提取溫度52 ℃，提取時間52 min。

同樣由于天然或者人工栽培的金耳子實體資源的匱乏，使得相關研究人員較少，從而導致金耳多糖提取方法較為局限，未涉及到一些更加高效、智能化的現(xiàn)代新興技術，如微波輔助提取法、亞臨界水提取法、三相提取法、脈沖電場輔助提取法、納米顆粒研磨提取法和高壓勻漿提取法等。尋找一種或者幾種從金耳子實體中獲取金耳多糖的高效新興提取方法仍然十分重要。

1.1.2 菌絲體深層發(fā)酵途徑 深層液體發(fā)酵技術常被用于蘑菇類真菌的研究[16-17]。深層發(fā)酵技術培養(yǎng)的菌絲體較人工栽培的子實體，具有周期短、不受季節(jié)限制、便于工業(yè)化等優(yōu)點[18-20]，金耳菌絲體液體深層發(fā)酵技術具有良好的發(fā)展前景。一些研究者在菌絲體深層發(fā)酵制備金耳多糖方向做出了一些工作，致力于探索最佳發(fā)酵優(yōu)化條件和提取條件。鄧超等[21]以馬鈴薯、葡萄糖為發(fā)酵培養(yǎng)基，在培養(yǎng)14 d 后通過離心、醇沉、復溶、除蛋白、醇沉、冷凍干燥后得到了66 mg/L 的金耳多糖。董昌金[22]優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基的配方，發(fā)現(xiàn)金耳菌絲體液體深層發(fā)酵最適碳源為玉米粉，最適氮源為蛋白胨。在此條件下，通過堿提取法得到了3.136 g/L 的金耳多糖。菌絲體發(fā)酵是混菌的形式，很難分離出純的金耳菌絲，這會造成發(fā)酵過程不穩(wěn)定，產(chǎn)物結構不穩(wěn)定等現(xiàn)象。

1.1.3 孢子發(fā)酵途徑 銀耳綱食用菌能夠產(chǎn)生類似酵母的擔孢子，無共生真菌存在時，孢子不會發(fā)育成菌絲，而是像酵母一樣通過出芽的方式增殖，相較于傳統(tǒng)食用真菌的菌絲體發(fā)酵更容易調(diào)控，這也是一種大規(guī)模制備食用菌多糖的策略[23-24]。目前，這一策略已被應用于銀耳多糖的生產(chǎn)[25-26]。金耳孢子的深層液體發(fā)酵技術是生產(chǎn)有價值的胞外多糖的一種穩(wěn)定并且有效的替代方法。柴紅梅等[27]首次將金耳孢子應用于金耳多糖的發(fā)酵以及提取，以玉米粉、白糖、黃豆粉為培養(yǎng)基，最終經(jīng)過發(fā)酵得到了14.3 g/L 的多糖。蔣益等[28]采用低能N離子誘變法得到了一株突變的金耳孢子，在25 ℃下培養(yǎng)5 d 得到2.7 g/L 的金耳多糖。Sun 等[24]在7.5 L 的發(fā)酵罐中，以40 g/L 葡萄糖和稀釋了10倍的豆腐廢水作為培養(yǎng)基，得到了最大產(chǎn)量為（15.02±0.40）g/L 的金耳多糖，這意味著孢子發(fā)酵法制取金耳多糖有非常樂觀的工業(yè)化前景。

1.2 金耳多糖的分離純化

上述方法處理金耳子實體、菌絲體和孢子發(fā)酵液所獲得的多糖為粗多糖，其中會存在蛋白質(zhì)、色素、脂質(zhì)、無機鹽、單糖、氨基酸等化合物[6]。由于這些化合物會對金耳多糖后續(xù)的結構解析、生物活性研究造成影響，因此，粗多糖的分離純化工藝是提高多糖純度的關鍵步驟。多糖常用分離純化方法及其特點如表2所示。過氧化氫法和Sevag法分別是粗多糖脫色和脫蛋白最常用的化學方法[25]。之后，可使用凍融、沉淀、超濾或柱層析等方法進一步純化多糖。在這些純化方法中，柱色譜由于成本低和效率高，成為最常用的方法[29]。多糖可首先通過基于不同離子性質(zhì)的陰離子交換色譜分離，并根據(jù)不同分子質(zhì)量通過凝膠過濾色譜進一步純化，獲得具有相同聚合度和空間構象的單一多糖組分[30]。

表2 多糖常用分離純化方法及其特點Table 2 Common separation and purification methods of polysaccharides and its characteristics

金耳多糖分離純化工藝總結見表3。劉春卉等[11]使用H2O2法結合透析法對金耳多糖進化脫色處理，隨后進一步使用Sevage 法脫蛋白，最后使用SephadexG-100 得到了精制金耳多糖TAf1、TAf2。李衛(wèi)旗等[31]采用蛋白酶和Sevage 法脫蛋白、苯酚脫色獲得了多糖半純品，而后使用Sephadex G-200 得到了均一組分多糖JP-1 和JP-2。Du 等[32]使用超濾膜一步完成了脫色和除蛋白步驟，依次將金耳多糖經(jīng)過DEAE-Sepharose 和Sephacryl S-500 柱層析得到了5 個組分均一的金耳多糖，分別是TAPA、TAPB、TAPC、TAPD 和TAPE。鄭俊麗[33]在使用醇沉法得到粗多糖后，將粗多糖通過D101 大孔樹脂脫色，通過DEAE FF 16/10 陰離子交換層析和Sephacryl S-400 HR 凝膠層析得到不同組分均一純多糖TAP-1、TAP-2、TAP-3。不同的分離純化方法會對金耳多糖的結構解析以及其生物活性造成很大的影響，優(yōu)化并建立不同來源金耳多糖的提取分離及其純化的方法庫是一個急需解決的問題。

表3 金耳多糖的分離純化方法Table 3 Separation and purification of N.aurantialba polysaccharide

2 金耳多糖的結構特征

擔子菌多糖是一種結構復雜的天然高分子物質(zhì)，其活性會受結構的影響，且據(jù)報道不同來源、不同提取方法以及不同提取條件都會造成多糖結構的差異，從而影響其生物活性[35-36]。一般來說，多糖的結構表征需要明確多糖的分子質(zhì)量、單糖組成、糖苷鍵類型以及糖殘基的連接順序[37]。這些特征可以通過一些先進的分析儀器結合現(xiàn)代分析方法來確定，包括氣相色譜 （GC）、高效液相色譜（HPLC）、傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）、紫外分析、核磁共振（NMR）、原子力顯微鏡（AFM）和掃描電鏡（SEM）等[38]。不同來源的金耳多糖結構特征見表4。

劉春卉等[11]采用了薄層層析、柱層析和FT-IR法初步探究了子實體多糖的多糖組成。薄層層析結果表明，子實體多糖由木糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸等單糖組成；SephadexG-100 柱層析的結果表明，金耳多糖的分子質(zhì)量范圍為3.0×105～5.0×105u；FT-IR 的結果表明金耳多糖存在吡喃環(huán)，α-（1→3）和β-糖苷鍵。Du 等[32，39-40]采用FT-IR 和NMR 分別探究了兩種均一組分（TAPA1和TAPB1）的金耳多糖的多糖結構。結果表明兩種多糖在單糖種類保持一致，均含有甘露糖、木糖和葡萄糖醛酸，然而在單糖比例上有所區(qū)別。在糖苷鍵的連接方式上，兩種多糖的主要連接方式都為α-（1→3）-甘露糖。由于金耳多糖的分子質(zhì)量過大，導致結構難以解析，Yuan 等[34]使用自由基對金耳多糖進行解聚處理得到低分子質(zhì)量的金耳多糖，然后運用NMR 技術對低分子質(zhì)量的金耳多糖的結構進行了詳細地解析。結果顯示，金耳多糖主鏈的連接方式為α-（1→3）-甘露糖-α-（1→2），側鏈由β-木糖和β-葡萄糖醛酸形成的鏈連接到α-甘露糖的C-2 位置，乙?；B接到甘露糖的第6個羥基位置。

從表4中可以發(fā)現(xiàn)一個有意思的現(xiàn)象，來源于金耳子實體和孢子發(fā)酵液的金耳多糖其主要單糖組成主要為木糖、甘露糖和葡萄糖醛酸，而來源于金耳菌絲體的多糖其主要單糖組成和上述兩種不一致且自身有無規(guī)律可言，這是因為菌絲體發(fā)酵是混菌的形式很難分離出純的金耳菌絲，會造成發(fā)酵過程不穩(wěn)定，產(chǎn)物結構不穩(wěn)定。綜上所述，來源于金耳孢子的發(fā)酵型金耳發(fā)酵多糖更有替代金耳子實體提取型金耳多糖的潛力。

表4 不同來源的金耳多糖的結構特征Table 4 Structural features of N.aurantialba polysaccharide from different sources

目前對金耳多糖的分子質(zhì)量、單糖組成、糖苷鍵連接方式等結構的研究結果存在差異，這可能是由于多種因素影響造成的，如多糖來源、子實體產(chǎn)地、樣品生長狀態(tài)、提取方法、分離純化方法等。

3 金耳多糖的生物活性

從金耳中分離出的結構多樣的多糖已被眾多研究者證明具有多種生物活性，包括免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、降血糖血脂等作用[4]。本文對國內(nèi)外關于金耳多糖生物活性的研究成果進行歸納總結，旨在為金耳多糖的進一步研究提供理論基礎。

3.1 免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用

金耳多糖最主要的生物學活性就是能夠加強機體的免疫功能[42]。近年來，研究學者通過大量的試驗對比后發(fā)現(xiàn)，以最常使用的小白鼠為對象，金耳多糖能顯著增強小白鼠細胞的吞噬能力和免疫能力，并且發(fā)現(xiàn)機體免疫調(diào)節(jié)的效用和金耳多糖的使用量成正比[43-44]。同樣，也有一些研究員將粗多糖的提取用在動物實驗中，觀察其免疫調(diào)節(jié)作用，結果顯示皮下注射會稍遜于口服所獲得的效果[45]。Yuan 等[34]發(fā)現(xiàn)TAP-3（金耳子實體多糖）具有明顯的免疫增強活性，可促進巨噬細胞分泌NO，IL-1β 和TNF-α。TAP-3 的關鍵膜受體被鑒定為TLR4，其鏈長對其免疫調(diào)節(jié)活性至關重要。

癌癥是現(xiàn)代社會最嚴重的疾病之一，其具有高發(fā)病率和高死亡率[46]。在小鼠腫瘤模型中通常使用腹腔注射法和口服法來評價多糖抑制腫瘤的效果[46]，苑小林等[12]發(fā)現(xiàn)腹腔注射的抑瘤效果更佳。

金耳多糖的免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用機制如圖1所示，金耳多糖可以通過激活且增強吞噬細胞的活性，促進細胞因子和細胞毒性成分的釋放，進而發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用。

圖1 金耳多糖的免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用機制Fig.1 Immune regulation and anti-tumor mechanism of N.aurantialba polysaccharides

3.2 抗氧化作用

鄧云霞等[47]的研究表明，金耳多糖不僅可以通過增強紅細胞的羥自由基清除能力抑制紅細胞溶血，而且能夠通過降低肝細胞內(nèi)的丙二醛含量抑制肝線粒體腫脹。王宣東[30]研究發(fā)現(xiàn)金耳多糖具有優(yōu)良的清除DPPH 自由基和羥自由基的能力且在一定質(zhì)量濃度范圍（0～1 500 μg/mL）內(nèi)金耳多糖的抗氧化能力與添加量成正比。Du 等[32]發(fā)現(xiàn)金耳子實體提取多糖TAPB1 具有清除超氧陰離子自由基和H2O2的能力。

活性氧（ROS）是一類由氧組成或包含氧并且在自然界中具有活性的物質(zhì)。體內(nèi)常見的ROS 包括超氧陰離子（O2-），過氧化氫（H2O2），高活性羥基（-OH），脂質(zhì)過氧化物和氮氧化物等[46]。很多疾病都是由于氧化應激造成的，具有抗氧化作用的物質(zhì)——金耳多糖可以改善這種情況。金耳多糖的抗氧化作用機制如圖2所示。金耳多糖通過顯著提高抗氧化活性物質(zhì)【如過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）等】水平，清除活性氧（ROS）自由基，從而降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如丙二醛（MDA）的含量，表現(xiàn)出較高的抗氧化活性。

圖2 金耳多糖的抗氧化作用機制Fig.2 Antioxidant mechanism of N.aurantialba polysaccharides

3.3 降血糖及降血脂作用

蘇檳楠等[48]發(fā)現(xiàn)，金耳發(fā)酵液多糖會降低家兔的血糖升高數(shù)值，表現(xiàn)為血糖波動不大，表明金耳多糖具有降血糖的作用。翟偉菁等[49]和Kiho等[50]發(fā)現(xiàn)金耳多糖的降血糖機制為使葡萄糖代謝加速，即在不影響磷酸果糖激酶的同時，金耳多糖會降低葡萄糖-6-磷酸酶的活性，令高血糖大鼠肝中的已糖激酶活性到明顯提高。汪虹[51]發(fā)現(xiàn)金耳菌絲體多糖可以有效降低小鼠血液中膽固醇和甘油三酯的含量。金耳多糖的降血糖及降血脂的作用機制如圖3所示，金耳多糖在調(diào)節(jié)腸道菌群、改善宿主代謝和調(diào)節(jié)細胞信號通路等幾個方面，發(fā)揮了降血糖以及降血脂的作用，而更加深入和具體機制尚不清楚。

圖3 金耳多糖的降血糖及降血脂作用機制Fig.3 Hypoglycemic and hypolipidemic mechanism of N.aurantialba polysaccharides

3.4 其它作用

金耳多糖還具有抗炎癥[52-53]、抗輻射[54]、抗血栓[55-56]、護肝[57-58]、祛痰止咳[59-60]、促進造血[61]和改善腸胃道[62]等生物活性。目前，關于金耳多糖生物活性研究仍然處于初級階段，主要是因為其研究方面較廣但是深度不夠。為了加強金耳多糖的理論基礎，可以使用生物學模型并結合現(xiàn)代技術如代謝組學、轉錄組學以及蛋白組學等方法進一步研究并評價金耳多糖的生物活性。

4 金耳多糖在食品行業(yè)的應用

金耳多糖具有許多良好的生理、藥理效用，在現(xiàn)在市面上能看到的以金耳多糖為原料開發(fā)出的食品中，保健產(chǎn)品在其中占據(jù)較大的比例。

4.1 金耳多糖飲料

1） 創(chuàng)新型營養(yǎng)保健飲料 這種新型營養(yǎng)保健飲料以優(yōu)質(zhì)量的金耳菌種作為主要的原料。李艷琴[63]研究出了其最佳的發(fā)酵條件，在此條件下發(fā)酵得到的粗多糖菌絲較多、味淡，發(fā)酵液呈現(xiàn)金黃色，同時還具有蜂蜜與蘋果的氣味。

2） 金耳液發(fā)酵飲料 金耳發(fā)酵液不易腐敗、香味濃厚，能夠保持長時間不變色[64]。用相關原料制成的培養(yǎng)基在合適的溫度、碳氮比、酸堿度等條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)得到代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)物，然后調(diào)節(jié)其酸甜比例和改良基質(zhì)，這樣得到的金耳發(fā)酵液十分適合制成飲料。這種飲料的品質(zhì)優(yōu)良，金耳的活性多糖含量極高，也具有良好的保健效益，能止咳化痰，具有很高的營養(yǎng)價值[65]。

3） 金耳發(fā)酵豆乳 雷鵬[66]以金耳為發(fā)酵菌株制備了一種富含金耳多糖、蛋白質(zhì)、膳食纖維等營養(yǎng)物質(zhì)的金耳發(fā)酵豆乳。

4.2 金耳多糖咀嚼片

嚴明[67]發(fā)明了一款以金耳多糖為原料的咀嚼片，該咀嚼片具有味道清新、能增強免疫功能等優(yōu)點。

4.3 食品添加劑

高觀世等[68]研究發(fā)現(xiàn)，當金耳子實體的粗多糖含量達到一定數(shù)值（質(zhì)量分數(shù)：l%～3%）后，可以作為一種功能型食品添加劑以改善面團的膠體性能，增加面團的吸水性和持水性，使面包口感柔軟。

5 結語

金耳作為一種中國獨有的、珍稀的膠質(zhì)食用真菌，其富含各種活性物質(zhì)，其中最主要的成分為金耳多糖，金耳多糖具有多種生理功能如免疫調(diào)節(jié)、抗炎癥、抗氧化和抗腫瘤功能。國內(nèi)外學者對于金耳多糖的研究多集中于探究子實體多糖的提取、純化和生物活性。然而，金耳子實體多糖的研究仍然存在一些問題，如金耳子實體多糖的結構仍然不夠清晰，其原因包括但不限于：1）金耳子實體是由金耳與伴生菌共同發(fā)育而來，其產(chǎn)生的金耳多糖為非均質(zhì)多糖，含有大量纖維素、半纖維素等物質(zhì)，這給金耳子實體多糖的結構解析增加了很多困難；2）多糖來源、子實體產(chǎn)地、樣品生長狀態(tài)、提取方法、分離純化方法等不同造成金耳子實體多糖的結構具有一定的差異。

深層液體發(fā)酵有很大的研究前景，其具有發(fā)酵時間短、多糖性質(zhì)穩(wěn)定、提取工藝簡單等優(yōu)點。然而，目前利用發(fā)酵法制備金耳多糖的研究比較少。綜上所述，金耳多糖未來應著眼于優(yōu)化并建立不同來源金耳多糖的提取分離及其純化的方法庫，加強金耳多糖結構研究及其活性評價，在分子以及細胞水平上解析金耳多糖的作用機制，在金耳深層液體發(fā)酵技術的基礎上開發(fā)適合工業(yè)化生產(chǎn)金耳多糖的工藝，開發(fā)更多的金耳多糖產(chǎn)品，使其走進人們的生活中，改善人們的生活品質(zhì)。