蝦夷扇貝裙邊酶解物美拉德反應產(chǎn)物的自由基清除活性

崔小凡，杜椅楠，孫世廣，韓佳潤，閻佳楠，姜昕昱，李傲婷，吳海濤

（大連工業(yè)大學食品學院 國家海洋食品工程技術研究中心 遼寧大連 116034）

扇貝（Patinopecten yessoensis）屬雙殼軟體動物，具有豐富的營養(yǎng)價值。2018年，中國扇貝的水產(chǎn)養(yǎng)殖總量高達192 萬t。近年來，扇貝養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，在其加工過程中，裙邊大多作為副產(chǎn)物被丟棄，造成了嚴重的資源浪費。

大量研究表明酶解可有效回收水產(chǎn)品副產(chǎn)物的功能成分，其水解產(chǎn)物大多具有良好的抗氧化能力[1]，前期研究表明[2]，扇貝裙邊中富含豐富的蛋白質，可以通過酶解方式來制備其功能性酶解產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，蝦夷扇貝的肌肉[2]、扇貝邊[3]和馬氏珠母貝肉的酶解物[4]均具有良好的自由基清除能力。然而，有關蝦夷扇貝雄性生殖腺酶解產(chǎn)物抗氧化能力的研究未見報道。

美拉德反應是在加熱過程中肽、蛋白質、氨基酸與還原糖之間的反應，其所產(chǎn)生的風味物質會進一步影響食品風味[5]。此外，一些研究表明，美拉德反應可以用來提高大豆蛋白酶解物[6]、海參腸酶解物[7]、鯛魚鱗多肽[8]和牡蠣酶解物[9]的抗氧化活性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，美拉德反應有效增強了櫛孔扇貝裙邊酶解物的羥自由基和ABTS 自由基清除能力[10]。美拉德反應對蝦夷扇貝裙邊酶解物抗氧化活性的影響有待研究。

本文用蝦夷扇貝裙邊酶解物和核糖制備美拉德反應產(chǎn)物，探究反應過程中中間體物質的形成，顏色和揮發(fā)性化合物的變化。此外，探究酶解物和美拉德反應產(chǎn)物的羥自由基、DPPH 和ABTS 自由基清除能力，為蝦夷扇貝裙邊蛋白的高值化利用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料及主要試劑

蝦夷扇貝，購自大連長興市場；中性蛋白酶，購自南寧龐博生物工程有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和購自美國Sigma-Aldrich 公司；核糖、木瓜蛋白酶、L-酪氨酸、EDTANa2，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；二甲基吡咯啉氮氧化物（DMPO），購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；2，6-二叔丁基對甲酚（BHT），購自天津光復精細化工研究所；其它試劑均為生化試劑或分析純級。

1.2 主要儀器與設備

電子順磁共振波譜儀（ESR），購自德國Bruker BioSpin 公司；氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，購自安捷倫（中國）科技有限公司；高速低溫離心機，購自HITACHI；精密電子天平，購自美國雙杰兄弟（集團）有限公司；精密pH 計，購自上海雷磁儀器廠；酶標定量測定儀，購自TECAN；紫外-可見分光光度計，購自上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 制備蝦夷扇貝裙邊凍干粉 蝦夷扇貝裙邊經(jīng)沸水浴10 min 變性處理后冷凍干燥，粉碎后于-30 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 SDS-PAGE 分析 參照Zhao 等[11]的方法對蝦夷扇貝裙邊凍干粉的蛋白質分子質量分布進行分析。用1×上樣緩沖液制備蛋白質量濃度為1 mg/mL 的樣品溶液，經(jīng)沸水浴10 min 后搖動12 h，將蛋白質樣品（10 μL）加載到聚丙烯酰胺凝膠中（5%的濃縮膠，10%的分離膠）進行分析，濃縮膠電流為7 mA，分離膠電流為15 mA。試驗結束后，用考馬斯亮藍G250 染色液對凝膠進行染色，脫色后成像。

1.3.3 制備蝦夷扇貝裙邊酶解物 采用中性蛋白酶（酶活為204 326 U/g）對蝦夷扇貝裙邊凍干粉進行酶解，酶解條件為：加酶量3 000 U/g 蛋白、底物質量分數(shù)4%、pH 7.0、酶解溫度50 ℃，酶解時間分別為0.5，1，2，3 h。酶解后的溶液于沸水浴10 min 后離心4 000×g，10 min，將上清液收集后冷凍干燥，制得不同酶解時間的蝦夷扇貝裙邊酶解物（SMHs）并通過pH-stat 法計算其水解度（DH）[12]，其計算公式如下：

式中，B——保持pH 不變所消耗堿（NaOH）的體積，mL；Nb——堿的物質的量濃度，mol/L；Mp——底物中蛋白總量，g；htot——底物蛋白質中肽鍵總數(shù)，mmol/g，其中本研究中htot為7.5；α——水解過程中α-氨基的解離度，具體計算公式如下：

式中，pH——溶液的酸堿度；pK——電離平衡常數(shù)。

1.3.4 制備美拉德反應產(chǎn)物 用去離子水配制20 mg/mL 的酶解物溶液和40 mg/mL 的核糖溶液，將兩種溶液按體積比1∶1 混合后調至pH 7.0，分裝于4 mL 旋蓋玻璃瓶中，然后置于干浴器中在95 ℃條件下加熱4 h 或12 h 以獲得蝦夷扇貝裙邊酶解物-核糖美拉德反應產(chǎn)物（MRPs），將美拉德反應產(chǎn)物冷凍干燥后于-30 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 美拉德反應產(chǎn)物的褐變程度 將制得的美拉德反應產(chǎn)物溶液用去離子水稀釋到合適倍數(shù)后用紫外分光光度計測定其在波長294 nm （稀釋100 倍）和420 nm（稀釋5 倍）處的吸光值。

1.3.6 美拉德反應產(chǎn)物揮發(fā)性物質組成 取3 mL 美拉德產(chǎn)物原液于10 mL 分析小瓶中，加入20 μL 的內(nèi)標物（環(huán)己酮，100 mg/L） 后通過HSSPME/GC/MS 進行檢測，色譜柱為HP-5MS 5%聚苯基甲基硅氧烷30 m×250 μm×0.25 μm，升溫程序為：初溫35 ℃，保持3 min；以3 ℃/min 的速度升溫到70 ℃，以10 ℃/min 的速度升溫至200℃，以20 ℃/min 的速度升溫至260 ℃，保持5 min；分流進樣，載氣流量（He）為l.5 mL/min，進樣量為1 μL。掃描條件為：全譜掃描：質量掃描范圍29～400 amu；電子能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；四極桿溫度150 ℃；離子源溫度230 ℃。

1.3.7 DPPH 自由基的清除能力測定 利用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）（pH 6.0，0.1 mol/L）配制不同的樣品溶液，取300 μL 樣品溶液與200 μL DPPH（200 μmol/L）溶液混合均勻后避光反應30 min，2 000×g 離心10 min 后收集上清，轉移至毛細管中，將毛細管的一端用凡士林封口后，放入諧振腔中檢測其ESR 波譜，測試條件為：中心磁場強度3 317.71 G，微波功率5.07 mW，微波頻率0.44 GHz，調制幅度1.00 G，調制頻率為100.00 kHz，時間常數(shù)327.68 ms，轉換時間160.00 ms。同時以BHT 為對照，DPPH 的清除率（E）的計算公式如下：

式中，ho——將PBS 溶液替代樣品溶液后測得ESR 圖譜中間最高峰的峰高；hx——樣品溶液測得的ESR 圖譜中間最高峰的峰高。

1.3.8 羥自由基清除能力測定 參照Wu 等[13]方法對蝦夷扇貝酶解物美拉德反應產(chǎn)物的羥自由基清除能力進行檢測。利用磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.4，0.15 mol/L）配制不同的樣品溶液。取樣品溶液78 μL，DMPO 溶液（1 mmol/L）5 μL，EDTANa2和FeSO4混合液 （6 mmol/L）10 μL，H2O2（6%）8 μL，混合均勻于40 ℃條件下反應30 min 后轉移到毛細管中，將毛細管的一端用凡士林封口后，放入諧振腔中檢測羥自由基信號譜圖，測試條件為中心磁場強度3 368.99 G，微波功率0.721 mW，微波頻率9.44 GHz，調制幅度1.00 G，調制頻率為100 kHz，時間常數(shù)81.92 ms，轉換時間40 ms，同時以維生素C 為對照，羥自由基清除率（E）計算公式如下：

式中，h1——將PBS 溶液替代樣品溶液后測得ESR 圖譜中第2 個峰的峰高；h2——樣品溶液測得的ESR 圖譜中第2 個峰的峰高。

1.3.9 ABTS 自由基清除能力測定 參照Han 等[10]的方法進行試驗。將過硫酸鉀 （2.4 mmol/L）與ABTS 溶液（7.0 mmol/L）按照體積比1∶1 的比例混合均勻后于室溫下避光反應12 h 制備ABTS 自由基儲備液。使用前以pH 7.4 的PBS 溶液（0.2 mol/L） 為溶劑稀釋ABTS 自由基儲備溶液至波長734 nm 處吸光值為0.7±0.02。將10 μL 樣品溶液與1 mL 稀釋后的ABTS 溶液混合避光反應6 min 后在波長734 nm 處測定其吸光值并使用如下公式計算樣品的ABTS 自由基清除率（S）：

式中，A0——超純水代的吸光值；As——樣品的吸光值。

1.3.10 統(tǒng)計方法 試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。采用http：//www.physics.csbsju.edu/stats/t-test.html 在線軟件進行student's t 檢驗，P<0.05 表示結果具有顯著性差異。

2 結果討論

2.1 蝦夷扇貝裙邊蛋白質分子質量分布

凱氏定氮結果表明，蝦夷扇貝裙邊凍干粉中含有約77%的蛋白質。由圖1可知，蝦夷扇貝裙邊中蛋白質主要分布于200 ku （肌球蛋白重鏈），97 ku（副肌球蛋白）和42 ku（肌動蛋白）。肌球蛋白重鏈和肌動蛋白是水產(chǎn)動物中常見的蛋白質組分，比如竹莢魚（Trachurus trachurus）[14]和大黃魚[15]。Nozawa 等[16]發(fā)現(xiàn)蝦夷扇貝肌肉中的蛋白質組分主要分布在230，210，100 ku 和45 ku。此外，分子質量約為97～110 ku 的副肌球蛋白也廣泛存在于海洋動物肌肉中[17]，比如章魚[18]和海參[11]。

圖1 蝦夷扇貝裙邊的SDS-PAGE 分析Fig.1 SDS-PAGE of scallop （P.yessoensis） mantle

2.2 蝦夷扇貝裙邊的酶解曲線

由圖2所示，在酶解前30 min 內(nèi)水解度快速上升，分別達到了17.33%和8.37%，在30～120 min 緩慢升高，120 min 后趨于穩(wěn)定。在水解3 h后，蝦夷扇貝裙邊酶解物的水解度（DH）達到28.95%。Wu 等[13]也發(fā)現(xiàn)用中性蛋白酶酶解蝦夷扇貝雌性生殖腺3 h 后，其水解度能夠達到34.25%，這些結果表明中性蛋白酶對蝦夷扇貝裙邊具有良好的酶解作用。

圖2 蝦夷扇貝裙邊粉酶解過程中的水解度曲線Fig.2 DH curve of scallop （P.yessoensis）skirt powder in the process of hydrolysis

2.3 蝦夷扇貝裙邊酶解物-核糖美拉德反應產(chǎn)物的紫外吸光度及褐變程度

美拉德反應產(chǎn)物在波長294 nm 和420 nm 處的吸光值可以分別用來表示美拉德反應中間產(chǎn)物的生成和褐變程度。如圖3a 所示，隨著加熱時間的延長，美拉德反應產(chǎn)物在波長294 nm 下的吸光度顯著升高，加熱4 h 和12 h 后獲得的美拉德反應產(chǎn)物的吸光度是酶解物的3.33 倍和10.67 倍。海參腸酶解物-核糖美拉德反應產(chǎn)物也呈現(xiàn)出了相似的結果[7]。

褐變程度也經(jīng)常用來表征食物的美拉德反應程度。由圖3b 所示，加熱時間為0 h 的美拉德反應產(chǎn)物在波長420 nm 處的吸光值僅有0.07，然而，加熱4 h 和12 h 后，吸光度顯著增加，尤其是加熱12 h 后美拉德反應產(chǎn)物的吸光度是未加熱的13 倍。Sun 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，雞肉副產(chǎn)物的MRPs褐變程度隨著加熱時間延長而增大。這些結果表明在美拉德反應過程中，有大量的中間產(chǎn)物和褐色物質生成。

圖3 蝦夷扇貝裙邊酶解物-核糖美拉德產(chǎn)物在294 nm（a）、420nm（b）的UV 吸光度Fig.3 The UV-vis spectra of the MRPs of scallop （P.yessoensis） skirt hydrolysates were obtained at 294 nm （a） and 420 nm （b）

2.4 蝦夷扇貝裙邊酶解物及其美拉德產(chǎn)物揮發(fā)性成分分析

利用GC-MS 對酶解物及其美拉德產(chǎn)物的揮發(fā)性成分進行分析，結果如表1所示，酶解物中只有25 種揮發(fā)性成分，包括13 種醛類、3 種酮類、1種醇類、1 種酸類、1 種酯類、3 種雜環(huán)類和3 種烷烴類，而美拉德反應產(chǎn)物中揮發(fā)性成分分別達到32 種（美拉德反應4 h）和30 種（美拉德反應12 h），與酶解物相比，經(jīng)美拉德反應后有1 種醛類、2種酮類、6 種醇類、4 種酯類、11 種雜環(huán)類和2 種烷烴類生成。此外不同加熱時間獲得的美拉德產(chǎn)物，生成的風味物質組成也有差異。由表1可知，雜環(huán)化合物的含量隨著反應時間的增加而升高，尤其是糠醛（美拉德反應的標志性產(chǎn)物[20]）。經(jīng)美拉德反應4 h 后醇類的種類增加，但繼續(xù)進行美拉德反應至12 h 時，醇類的種類呈現(xiàn)降低的趨勢，這可能是由于長時間的加熱導致醇類物質的揮發(fā)，使其檢出量降低[21]。

醛是蝦夷扇貝裙邊酶解物及其美拉德產(chǎn)物中的主要揮發(fā)性成分。苯甲醛與甜味、果味、焦糖味有關[22]。在蝦夷扇貝裙邊酶解物及其美拉德產(chǎn)物中共鑒定出了5 種酮，這些酮可以散發(fā)出令人愉悅的氣味[23]。此外，其它揮發(fā)性化合物也可以改善食品的風味，例如苯甲醛（水果味、甜味）和1，1-十二烷二醇（水果味），這些結果表明，美拉德反應可以用來改善蝦夷扇貝裙邊酶解物的風味。

由表1可知，雜環(huán)化合物是12 h 后美拉德反應產(chǎn)物中的主要風味物質，尤其是糠醛，含量最高。Han 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，糠醛含量與美拉德產(chǎn)物DPPH 自由基清除能力之間的相關系數(shù)為0.958。此外，美拉德反應后2H-吡喃-6-羧酰胺2H-吡喃-2-酮的含量也明顯增加，這可能也會改善其自由基清除能力[7]。蝦夷扇貝裙邊酶解物及其美拉德產(chǎn)物的自由基清除能力需要進一步研究。

表1 蝦夷扇貝裙邊酶解物及其美拉德產(chǎn)物的GC-MS 分析結果Table 1 GC-MS analysis result of the scallop （P.yessoensis） mantle hydrolysates and MRPs

（續(xù)表1）

2.5 蝦夷扇貝裙邊酶解物及其美拉德反應產(chǎn)物的自由基清除能力

2.5.1 羥自由基的清除能力 羥自由基是重要的活性氧，具有很強的氧化能力。進一步通過ESR的方法來檢測蝦夷扇貝裙邊酶解物及其美拉德反應產(chǎn)物的羥自由基清除能力[13]。由圖4可知在同一酶解時間下，羥自由基清除能力呈現(xiàn)MRPs-12 h>MRPs-4 h>SMHs 的趨勢，并且酶解1 h 以后，酶解物本身的羥自由基清除能力也顯著提高。另外，美拉德反應12 h 后獲得的反應產(chǎn)物的羥自由基清除能力是酶解物的1.51～1.80 倍。通過酶解3 h 后的酶解物及其相應的美拉德反應產(chǎn)物的ESR信號可以看出，酶解物和美拉德反應產(chǎn)物的ESR信號強度均顯著下降，且隨著美拉德反應時間延長，信號強度降低的越明顯，這與櫛孔扇貝裙邊酶解物的美拉德反應產(chǎn)物的研究結果一致[24]。這些結果表明，美拉德反應可以有助于提高蝦夷扇貝裙邊酶解物的羥自由基清除能力。

圖4 蝦夷扇貝裙邊酶解物及其美拉德反應產(chǎn)物的羥自由基清除能力和ESR 圖譜Fig.4 Hydroxyl radical scavenging capacity and the ESR spectra of the scallop （P.yessoensis） mantle hydrolysates and MRPs

2.5.2 DPPH 自由基清除能力 圖5顯示了在不同酶解時間下，蝦夷扇貝裙邊酶解物及其美拉德反應產(chǎn)物的DPPH 自由基清除能力。低濃度的酶解物在不同酶解時間下DPPH 自由基清除能力均為0%，無明顯DPPH 自由基清除能力。然而，經(jīng)過美拉德反應后，MRPs 表現(xiàn)出了較強的DPPH 自由基清除能力。此外，酶解1～3 h 后的酶解物對應的美拉德產(chǎn)物具有更高的DPPH 自由基清除能力。通過酶解3 h 后的酶解物及其相應的美拉德反應產(chǎn)物的ESR 信號可以看出，酶解物的ESR 信號強度與空白組相比沒有明顯變化，而美拉德反應產(chǎn)物的ESR 信號強度顯著下降，且隨著美拉德反應時間延長，信號強度降低的越明顯。進一步對蝦夷扇貝裙邊酶解物及其美拉德反應產(chǎn)物進行凍干后分析，發(fā)現(xiàn)其IC50值分別為10.3（SMHs），0.57 mg/mL（MRPs-4 h）和0.37 mg/mL（MRPs-12 h），均高于BHT（0.016 mg/mL）。

圖5 蝦夷扇貝裙邊酶解物及其美拉德反應產(chǎn)物的DPPH 自由基清除能力和ESR 圖譜Fig.5 DPPH radical scavenging capacity and the ESR spectra of the scallop （P.yessoensis）mantle hydrolysates and MRPs

2.5.3 ABTS 自由基的清除能力 圖6顯示了蝦夷扇貝裙邊酶解物及其美拉德反應產(chǎn)物的ABTS自由基清除能力。在同一酶解時間下，ABTS 自由基清除能力呈現(xiàn)MRPs-12 h>MRPs-4 h>SMHs的趨勢，并且酶解1 h 以后，酶解物本身的ABTS自由基清除能力也顯著提高。酶解3 h 后獲得的酶解物具有最高的ABTS 由基清除能力（31.64%）。此外，經(jīng)美拉德反應后，不同酶解時間獲得的酶解物的ABTS 自由基清除能力均有了顯著提高，其中美拉德反應12 h 獲得的酶解物的ABTS 自由基清除能力是酶解物的2.18～2.49 倍，海參腸酶解物-核糖美拉德產(chǎn)物也顯示出相似的結果[25]。綜上，美拉德反應可以用作提高蝦夷扇貝裙邊酶解物抗氧化能力的有效方法。

圖6 蝦夷扇貝裙邊酶解物及其美拉德反應產(chǎn)物的ABTS 自由基清除能力Fig.6 The ABTS radical scavenging capacity of the scallop （P.yessoensis） mantle hydrolysates and MRPs

3 結論

美拉德反應后，蝦夷扇貝裙邊酶解物的中間產(chǎn)物數(shù)量、褐變程度和風味物質均有所增加。并且其羥自由基、DPPH 和ABTS 自由基清除能力也得到顯著改善。綜上，美拉德反應可用于增強蝦夷扇貝裙邊酶解物的自由基清除能力，而蝦夷扇貝裙邊酶解物的美拉德反應與自由基清除能力之間的關系尚需進一步研究。