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      微波納米解凍對(duì)秘魯魷魚保水性和蛋白結(jié)構(gòu)的影響

      2022-09-07 07:42:30朱文慧郭慧芳單春雨李學(xué)鵬勵(lì)建榮宦海珍
      中國食品學(xué)報(bào) 2022年8期
      關(guān)鍵詞:肌原纖維魷魚巰基

      朱文慧,郭慧芳,單春雨,步 營,李學(xué)鵬,勵(lì)建榮,宦海珍

      (渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧省高校重大科技平臺(tái)食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心 遼寧錦州 121013)

      秘魯魷魚隸屬柔魚科,其肉質(zhì)比其它魷魚鮮嫩[1],可食部分高,是一種高蛋白、低脂肪的水產(chǎn)品種類[2]。秘魯魷魚是遠(yuǎn)洋海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物,捕撈后需立即凍結(jié)。冷凍水產(chǎn)品加工前必須經(jīng)過解凍,不恰當(dāng)?shù)慕鈨鰰?huì)給產(chǎn)品質(zhì)量造成很大的影響,如解凍過程冰晶破壞細(xì)胞組織結(jié)構(gòu),導(dǎo)致溶酶體、促氧化劑的釋放,加快蛋白氧化,使解凍品質(zhì)大大降低。理想的解凍方式是產(chǎn)品解凍快速、均勻。

      微波解凍(Microwave thawing,MT)是近年來報(bào)道的新型解凍方法之一,它的解凍效率高,能大大縮短解凍時(shí)間,然而其具有解凍不均勻,解凍過程中造成大量汁液流失的缺點(diǎn)。有研究表明,分散在溶液中的納米粒子在暴露于交流磁場(chǎng)時(shí)可以將電磁能轉(zhuǎn)化為熱量[3],胞外Fe3O4納米粒子磁感應(yīng)加熱(Magnetic induction heating,MIH)可以顯著抑制再加熱過程中的失透或重結(jié)晶[4]。有學(xué)者通過數(shù)值模擬研究了超順磁性納米粒子在低溫保存樣品中的微波復(fù)溫過程,結(jié)果表明,納米粒子顯著提高了升溫速率,對(duì)低溫保存樣品的復(fù)溫有積極作用[5]。本課題組前期已研究證明微波納米解凍(Microwave nanoparticles thawing,MNPT)能夠減少冰晶對(duì)肌肉纖維的損傷,提高肌肉的保水性,實(shí)現(xiàn)快速、均勻解凍[6]。然而,微波納米解凍對(duì)魷魚蛋白氧化和持水能力的影響尚未見報(bào)道。本研究建立羥自由基氧化體系,探討MNPT 對(duì)秘魯魷魚保水性、肌原纖維蛋白的影響,為其后續(xù)提高解凍品質(zhì),降低蛋白氧化提供一些理論參考。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      凍結(jié)的秘魯魷魚由錦州市古塔區(qū)海英水產(chǎn)商店提供,凍藏運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,快速分割成質(zhì)量約160 g 左右正方體,放于-80 ℃超低溫冰箱備用。

      三羥甲基氨基甲烷(Tris)、2,4-二硝基苯(2,4-Dinitrophenylhydrazone,DNPH)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司、乙二胺四乙酸 (Ethylene diaminete traacetic acid,EDTA)、鹽酸、三氯乙酸(TCA)、鹽酸胍(均為分析純級(jí))購自南京圣比奧生物科技公司;尿素、氯化鈉購自福晨化學(xué)試劑有限公司;Fe3O4磁性納米粒子 (Magnetic nanoparticles,MNPs)(粒徑20~50 nm)購自成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司。

      1.2 儀器與設(shè)備

      Testo 106 型高精度食品溫度計(jì),德國德圖集團(tuán);Bio-Rad 電泳儀,美國Bio-Rad 公司;FJ200-SH 型實(shí)驗(yàn)室均質(zhì)機(jī),上海標(biāo)本模型廠;ORVALL Stratos 型冷凍高速離心機(jī),美國Thermo 公司;970CRT 熒光分光光度計(jì),上海棱光公司;UV-2550 紫外-可見光分光光度計(jì),島津儀器(蘇州)有限公司;低場(chǎng)核磁共振分析儀,上海紐邁科技有限公司;NN-DF392B 微波爐,松下電器(中國)有限公司。

      1.3 試驗(yàn)方法

      1.3.1 樣品處理 在前期研究的基礎(chǔ)上,本試驗(yàn)選用MT 條件為微波功率500 W,MNPT 條件為微波功率500 W,MNPs 質(zhì)量濃度為1 mg/mL。以凍結(jié)的秘魯魷魚胴體為原料,將魷魚切分成6 cm×6 cm×2 cm 的長方體。

      將魷魚取出放在不同濃度的H2O2溶液(抗壞血酸濃度為0.1 mmol/L、FeCl3濃度為0.01 mmol/L,H2O2濃度分別為1,5,10,50 mmol/L) 的羥自由基氧化體系(各處理組設(shè)為MT-1,MT-5,MT-10,MT-50)模擬肌肉氧化,MT 解凍至中心溫度0 ℃。將魷魚取出放在不同濃度的H2O2溶液(抗壞血酸濃度為0.1 mmol/L、FeCl3濃度為0.01 mmol/L,H2O2濃度分別為0,1,5,10,50 mmol/L) 的羥自由基氧化體系 (各處理組設(shè)為MNPT-0,MNPT-1,MNPT-5,MNPT-10,MNPT-50) 模擬肌肉氧化,MNPT 解凍至中心溫度為0 ℃。

      1.3.2 肌原纖維蛋白的提取 根據(jù)李學(xué)鵬等[7]的方法略作修改。將解凍后的魷魚肉攪碎,加4 倍重量的Tris-HCl(pH 7.2,20 mmol/L),均質(zhì)20 s,接著在5 000 r/min 條件下離心15 min,重復(fù)2 次。去上清液,加入4 倍沉淀質(zhì)量的20 mmol/L Tris-HCl-NaCl 緩沖液 (含0.6 mol/L NaCl,pH 7.2)混勻均質(zhì),然后在5 000 r/min 條件下離心15 min,取上清液置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫? d 內(nèi)用完)。

      1.3.3 保水性的測(cè)定 蒸煮損失率和離心損失率參考宦海珍[1]的方法進(jìn)行測(cè)定。

      1.3.4 低場(chǎng)核磁共振 魷魚樣品解凍后,切成10 mm×10 mm×20 mm 的長方體,放入核磁管,采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)脈沖序列,在32 ℃下進(jìn)行橫向弛豫時(shí)間T2的測(cè)定。設(shè)定參數(shù):SFI=22 MHz,P90=16.5 μs,SW=200 KHz,TR=2 000 ms,NS=8,τ=100 μs,回波個(gè)數(shù)=4 000。

      1.3.5 羰基含量的測(cè)定 根據(jù)Oliver 等[8]的方法略作修改。取1 mL 1.0 mg/mL 肌原纖維蛋白溶液,加入1 mL 10 mmol/L DNPH 溶液(含2 mol/L HCl)。在室溫下避光靜置1 h (每15 min 振蕩一次)。加入4 mL、20%的TCA,10 000 r/min 條件下離心15 min,棄去上清液。取1 mL 乙酸乙酯和乙醇(V乙酸乙酯∶V乙醇=1∶1)沖洗沉淀3 次,加入3 mL 6 mol/L 鹽酸胍溶液,37 ℃水浴25 min 使沉淀溶解,然后在10 000 r/min 離心5 min,棄掉沉淀,測(cè)定上層清液在波長370 nm 處的吸光度。分子吸光系數(shù)22 000 L/(molocm),計(jì)算每mg 蛋白中羰基含量。

      1.3.6 巰基含量的測(cè)定 采用DTNB 法[9]測(cè)定并稍作修改,用0.6 mol/L 的NaCl 溶液將肌原纖維蛋白配成1.0 mg/mL 的溶液,取0.5 mL 稀釋后的蛋白溶液加入4.5 mL Tris-甘氨酸緩沖溶液(8 mol/L 尿素,1% Tris,92 mmol/L 甘氨酸,4 mmol/L EDTA,pH 8.0),均質(zhì)后加入0.5 mL 10 mmol/L DTNB,25 ℃反應(yīng)30 min,于波長412 nm 處測(cè)定吸光值。其中13 600 L/(molocm)為巰基摩爾消光系數(shù),稀釋倍數(shù)是11。

      1.3.7 二聚酪氨酸的測(cè)定 參考Davies 等[10]的方法稍作修改,用20 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液(0.6 mol/L KCl,pH 6.0) 將肌原纖維蛋白配成1.0 mg/mL 的溶液。采用雙縮脲法測(cè)定蛋白濃度。利用熒光分光光度計(jì)測(cè)定二聚酪氨酸含量,狹縫寬度(激發(fā)光2.5 nm,發(fā)射光5 nm),發(fā)射波長420 nm,激發(fā)波長325 nm。二聚酪氨酸含量用相對(duì)熒光值(A.U.)表示。

      1.3.8 內(nèi)源熒光的測(cè)定 參考Liu 等[11]的方法稍作改動(dòng),用50 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)將肌原纖維蛋白配成0.1 mg/mL 的溶液。采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定光譜。激發(fā)波長295 nm,狹縫寬度(激發(fā)光2.5 nm,發(fā)射光5 nm),掃描范圍320~460 nm。

      1.3.9 紫外光譜的測(cè)定 將得到的蛋白溶液用20 mmol/L Tris-HCl-NaCl 緩沖液 (含0.6 mol/L NaCl,pH 7.2)稀釋至0.4 mg/mL,緩沖溶液作為空白,測(cè)定在220~360 nm 的紫外吸收光譜。

      1.3.10 濁度的測(cè)定 將肌原纖維蛋白稀釋到1 mg/mL,25 ℃水浴20 min,在波長340 nm 處測(cè)其吸光度,每個(gè)樣品做3 次平行試驗(yàn)。

      1.3.11 硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARS)的測(cè)定參考Benjakul 等[12]的方法并略微改動(dòng),稱取解凍好的魷魚10.00 g,依次加入蒸餾水25 mL、5%TCA 溶液25 mL,均質(zhì)后攪拌混勻過濾。取過濾后的溶液5 mL,加入相同體積0.02 mol/L 的TBA 溶液,80 ℃水浴40 min,快速冷卻至室溫,在波長532 nm 處測(cè)定其吸光度,TBARS 值用丙二醛(MDA)表示,單位為mg MDA/kg。

      1.3.12 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行ANOVA 分析,P<0.05 代表差異顯著,P<0.01 代表差異極顯著。采用Origin 進(jìn)行作圖,試驗(yàn)均最少重復(fù)3 次。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 自由基氧化對(duì)秘魯魷魚保水性的影響

      蒸煮損失率和離心損失率可以反應(yīng)樣品的保水性情況,圖1為自由基氧化對(duì)蒸煮損失率和離心損失率的影響。由圖可知,MT 和MNPT 各處理組的蒸煮損失率和離心損失率均隨著H2O2濃度的升高而升高,不同氧化濃度之間差異顯著(P<0.05),且MNPT 各處理組的蒸煮損失率和離心損失率均低于同等H2O2濃度的MT 各處理組,進(jìn)一步證實(shí)了MNPT 優(yōu)于MT,同時(shí)說明MNPT 可以減緩秘魯魷魚的水分損失。在微波加熱過程中,MNPS 會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)轫槾判誀顟B(tài),加大熱量在組織的傳導(dǎo)[13],使秘魯魷魚解凍相對(duì)均勻,減少了水分的流失,提高了解凍品質(zhì);另外,微波加熱使納米粒子變暖,抑制了冰晶的再生,降低解凍過程對(duì)組織的損傷[14]。

      圖1 自由基氧化對(duì)秘魯魷魚蒸煮損失和離心損失的影響Fig.1 Effect of free radical oxidation on cooking loss and centrifugal loss of jumbo squid

      2.2 自由基氧化對(duì)秘魯魷魚水分分布與組成的影響

      秘魯魷魚T2弛豫時(shí)間如圖2所示,隨著H2O2濃度的升高自由水越來越高,說明隨著氧化的進(jìn)行,體內(nèi)其它水分轉(zhuǎn)化為自由水,使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,影響了蛋白質(zhì)與水的結(jié)合。

      圖2 秘魯魷魚水分T2 弛豫時(shí)間圖譜Fig.2 Transverse relaxation time T2 of water in jumbo squid

      圖3是各組分水分所占有的百分含量。由圖可知,MT 和MNPT 各處理組的P21均隨著H2O2濃度的增加呈下降趨勢(shì),P23呈上升趨勢(shì),P22呈平穩(wěn)趨勢(shì)。相同H2O2濃度下,MNPT 各處理組比MT 組自由水含量低、結(jié)合水含量高,說明MNPT 解凍過程中減緩了結(jié)合水向自由水轉(zhuǎn)化,MNPS 使解凍均勻抑制了魷魚自由水的生成。另外,有研究表明納米解凍可以提高蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,增強(qiáng)水和蛋白質(zhì)分子之間的相互作用[15],提高肌肉的保水性。

      圖3 秘魯魷魚水分分布及組成Fig.3 Water distribution and composition of jumbo squid

      2.3 自由基氧化對(duì)秘魯魷魚肌原纖維蛋白羰基的影響

      羥基通過進(jìn)攻氨基酸的側(cè)鏈或直接作用于肽鏈,使肽鏈斷裂形成羰基[16]。羰基含量的升高使肌原纖維蛋白發(fā)生聚集、交聯(lián),也會(huì)引起肽鏈結(jié)構(gòu)的改變。由圖4可知,MT 和MNPT 各處理組的羰基含量均隨著H2O2濃度的增加而增加,不同氧化濃度之間差異顯著(P<0.05),且MNPT 各處理組結(jié)果均低于同等H2O2濃度的MT 各處理組。當(dāng)H2O2濃度為50 mmol/L 時(shí),MT 和MNPT 組羰基含量分別為8.56 nmol/mg MP 和7.95 nmol/mg MP,降低了7.13%,表明了MNPS 可以在解凍過程中緩解魷魚蛋白氧化,當(dāng)暴露在交變磁場(chǎng)中時(shí),分散在溶液中的MNPS 可以將電磁能量轉(zhuǎn)化為熱量[3],顆粒均勻地嵌入使冰晶融化更加均勻,降低對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的破壞,實(shí)現(xiàn)均勻解凍。在器官保存的凍融循環(huán)中,MNPs 的加入保持了均勻的升溫,增加了組織的存活力[5]。

      圖4 自由基氧化對(duì)魷魚肌原纖維蛋白羰基含量的影響Fig.4 Effect of free radical oxidation on carbonyl content in myofibrillar protein of jumbo squid

      2.4 自由基氧化對(duì)秘魯魷魚肌原纖維蛋白巰基的影響

      肌原纖維蛋白包括肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白,巰基是肌原纖維蛋白非常重要的基團(tuán),當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被氧化時(shí)巰基轉(zhuǎn)變?yōu)槎蜴I,導(dǎo)致總巰基含量下降,因此總巰基含量是表征蛋白氧化的一個(gè)重要指標(biāo)。由圖5可知,MT 和MNPT 各處理組的巰基含量均隨著H2O2濃度的增加而降低,不同氧化濃度之間差異顯著(P<0.05),且MNPT 各處理組結(jié)果均高于同等H2O2濃度的MT 各處理組。當(dāng)H2O2濃度為50 mmol/L 時(shí),MT 和MNPT 組巰基含量分別為53.36 nmol/mg 和64.36 nmol/mg,MNPS 顯著抑制了巰基的減少,提高了蛋白的穩(wěn)定性。

      圖5 自由基氧化對(duì)秘魯魷魚肌原纖維蛋白巰基含量的影響Fig.5 Effect of free radical oxidation on sulfhydryl content in myofibrillar protein of jumbo squid

      2.5 自由基氧化對(duì)秘魯魷魚肌原纖維蛋白二聚酪氨酸的影響

      酪氨酸是蛋白質(zhì)中的一種重要的氨基酸,受到自由基的攻擊極容易被氧化,通過共價(jià)作用等產(chǎn)生酪氨酸殘基、酪氨酰自由基,進(jìn)一步形成二聚酪氨酸[17]。由圖6可知,MT 和MNPT 各處理組的二聚酪氨酸含量均隨著H2O2濃度的增加而增加,不同氧化濃度之間差異顯著(P<0.05),且MNPT各處理組結(jié)果均低于同等H2O2濃度的MT 各處理組。當(dāng)H2O2濃度達(dá)到50 mmol/L,MT 組二聚酪氨酸含量是對(duì)照組(MNPT-0)的1.75 倍,MNPT 組是對(duì)照組的1.38 倍,MNPT 顯著減緩了二聚酪氨酸的生成,穩(wěn)定了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),減緩了秘魯魷魚肌原纖維蛋白的氧化。

      圖6 自由基氧化對(duì)秘魯魷魚肌原纖維蛋白二聚酪氨酸含量的影響Fig.6 Effect of free radical oxidation on the content of dityrosine in myofibrillar protein of jumbo squid

      2.6 自由基氧化對(duì)秘魯魷魚肌原纖維蛋白中內(nèi)源熒光含量的影響

      蛋白質(zhì)中的一些芳香族氨基酸,對(duì)氧化較敏感,如色氨酸容易被自由基攻擊,進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)槿虬彼?,使熒光?qiáng)度下降[18]。秘魯魷魚內(nèi)源熒光變化如圖7所示,空白MNPT-0 組內(nèi)源熒光含量最高,此時(shí)肌肉組織受到自由基攻擊最弱,所以熒光強(qiáng)度最高。隨著H2O2濃度的升高產(chǎn)生更多的·OH,內(nèi)源熒光呈下降的趨勢(shì),色氨酸逐漸暴露在外部,肌原纖維蛋白氧化使得色氨酸殘基從親水性環(huán)境逐漸變?yōu)槭杷原h(huán)境[19],蛋白氧化越來越嚴(yán)重。H2O2濃度低時(shí)內(nèi)源熒光含量高,說明·OH 促進(jìn)了秘魯魷魚肌原纖維蛋白的氧化。MNPT 各處理組的內(nèi)源熒光均高于同等H2O2濃度的MT 各處理組,說明MNPT 有一定減緩蛋白氧化的作用。

      圖7 自由基氧化對(duì)秘魯魷魚肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光含量的影響Fig.7 Effect of free radical oxidation on endogenous fluorescence content in myofibrillar protein of jumbo squid

      2.7 自由基氧化對(duì)秘魯魷魚肌原纖維蛋白紫外吸收光譜的影響

      紫外吸收光譜可以反應(yīng)芳香族氨基酸的側(cè)鏈變化并揭示明蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化[20]。由圖8可知,隨著H2O2濃度的增加,·OH 自由基數(shù)量增大,使得芳香氨基酸色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等生色基團(tuán)被氧化,從而導(dǎo)致紫外光譜下降,吸光值整體呈下降的趨勢(shì)。MNPT 各處理組的紫外吸收均高于同等H2O2濃度的MT 各處理組,說明MNPS 可以在解凍過程穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu),減緩蛋白氧化。

      圖8 自由基氧化對(duì)秘魯魷魚肌原纖維蛋白中紫外吸收光譜的影響Fig.8 Effect of free radical oxidation on ultraviolet absorption in myofibrillar protein of jumbo squid

      2.8 自由基氧化對(duì)秘魯魷魚肌原纖維蛋白濁度的影響

      濁度用來反映蛋白質(zhì)的大小和多少,當(dāng)肌原纖維蛋白聚集后粒徑變大,吸光度變大,濁度增加[21]。由圖9可知,MT 和MNPT 各處理組的濁度均隨著H2O2濃度的增加而增加,不同氧化濃度之間差異顯著(P<0.05),說明H2O2形成的羥自由基體系促進(jìn)了蛋白氧化、聚集。MNPT 各處理組結(jié)果均低于同等H2O2濃度的MT 各處理組,濁度越低,粒徑越小,意味著蛋白有著更大的表面積,蛋白質(zhì)與水的相互作用也越高,說明MNPT 可以均勻解凍有效抑制肌原纖維蛋白的氧化,與上述保水性結(jié)果一致,因此MNPT 能更好的維持蛋白結(jié)構(gòu),利于產(chǎn)品質(zhì)量的保持。

      圖9 自由基氧化對(duì)秘魯魷魚肌原纖維蛋白濁度的影響Fig.9 Effect of free radical oxidation on turbidity in myofibrillar protein of jumbo squid

      2.9 自由基氧化對(duì)秘魯魷魚肌原纖維蛋白脂肪氧化的影響

      硫代巴比妥酸(TBARS)值為脂質(zhì)二級(jí)氧化產(chǎn)物丙二醛的含量,TBARS 值的高、低用來表示魷魚脂肪的氧化情況。如圖10所示,MT 和MNPT 各處理組的TBARS 值均隨著H2O2濃度的增加而增加,不同氧化濃度之間差異顯著(P<0.05),說明H2O2形成的羥自由基體系促進(jìn)了脂肪氧化。MNPT各處理組結(jié)果均低于同等H2O2濃度的MT 各處理組,說明MNPT 可抑制秘魯魷魚脂肪氧化。蛋白氧化和脂肪氧化存在一定的依存關(guān)系,蛋白氧化進(jìn)行的同時(shí),脂肪氧化也在發(fā)生,可能是脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的丙二醛與肌球蛋白發(fā)生反應(yīng)生成羰基[22],具體的機(jī)理還要進(jìn)一步研究。

      圖10 自由基氧化對(duì)秘魯魷魚肌原纖維蛋白TBARS 值的影響Fig.10 Effect of free radical oxidation on TBARS value in myofibrillar protein of jumbo squid

      3 結(jié)論

      通過構(gòu)建羥自由基氧化體系,發(fā)現(xiàn)MNPT 可以有效維持秘魯魷魚的保水性,維持蛋白結(jié)構(gòu)降低蛋白和脂肪氧化,減緩蛋白的聚集,提高解凍肌肉品質(zhì),實(shí)現(xiàn)了快速、均勻解凍,是一種有效的解凍方式。

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