基于OPG/RANKL信號通路探討補腎活血方改善骨質(zhì)疏松大鼠動脈鈣化的作用機(jī)制

林曉容，楊 娜，鄭 琲，趙 虎，徐軍霞，4*

1 福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建福州 350122；2 福建省軍區(qū)福州第六干休所，福建福州 350013；3 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院，福建福州 350025；4 福建中醫(yī)藥大學(xué)福總教學(xué)醫(yī)院，福建福州 350025

骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis，OP）是一種以骨量減少和骨組織微結(jié)構(gòu)退化為特征的進(jìn)行性、系統(tǒng)性疾病，其引發(fā)的骨質(zhì)脆弱和骨折易感性增加會使患者出現(xiàn)病理性疼痛、骨折甚至死亡［1］。血管鈣化（vascular calcification，VC）是血管系統(tǒng)發(fā)生病理性礦物質(zhì)沉積的過程。研究顯示，OP和VC密切相關(guān)，兩者均是伴隨衰老而發(fā)生的退行性病變，大大增加了病理性骨折和心腦血管事件發(fā)生的風(fēng)險［2-4］，是老年人主要的死亡和致殘原因之一［5］，給患者、家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)和健康負(fù)擔(dān)。中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院張寧團(tuán)隊研究發(fā)現(xiàn)，補腎活血方不僅能減輕骨丟失，還可影響血管鈣化的發(fā)展［6］。但其具體作用機(jī)制尚不明確。研究顯示，骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）/核因子κB 活化因子受體配體（receptoractivator of NF-κB ligand，RANKL）信號通路參與包括OP 在內(nèi)的多種骨骼疾病的發(fā)生、發(fā)展［7］，且在抑制VC 中起重要作用［8］。OPG/RANKL 信號通路可能是OP 和VC 共同發(fā)病機(jī)制之一［9-10］。因此本研究通過行雙側(cè)睪丸切除術(shù)制備雄性大鼠骨質(zhì)疏松模型［11］，給予補腎活血方進(jìn)行干預(yù)，觀察大鼠骨密度（bone mass density，BMD）水平、胸主動脈鈣化情況、血清骨代謝標(biāo)志物和胸主動脈OPG/RANKL 信號表達(dá)情況；基于OPG/RANKL 信號通路探討補腎活血方改善骨質(zhì)疏松大鼠動脈鈣化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇健康SPF 級雄性SD 大鼠32 只，7 月齡，體質(zhì)量（575±75）g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0011。所有大鼠在SPF 級標(biāo)準(zhǔn)動物實驗室中喂養(yǎng)，自由飲水與攝食，光照12 h，室溫20～25 ℃，相對濕度45%。本實驗方案經(jīng)中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批通過。

1.2 實驗藥物

補腎活血方主要由當(dāng)歸15 g、熟地黃10 g、淫羊藿10 g、丹參10 g、補骨脂10 g、生黃芪15 g和酒制大黃5 g 組成。將生藥浸于750 mL 蒸餾水30 min，武火煮沸后文火煎煮30 min，反復(fù)煎煮2 次，合并2次藥液，濃縮至3 g/mL，冷藏備用。以上藥物購自福建海藥股份有限公司，由中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院中藥房煎制。

1.3 主要試劑與儀器

茜素紅S 液（美國Sigma 公司）；大鼠Ⅰ型前膠原氨基端原肽（procollagen typeⅠN-terminal propeptide，PⅠNP）、骨鈣素（bone Gla-protein，BGP）、Ⅰ型膠原C-末端肽交聯(lián)（CTX-Ⅰ）ELISA 檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；OPG、RANKL 抗體（英國Abcam 公司）；羊抗兔二抗（美國Millipore 公司）；DAB顯色液（加拿大Fermentas公司）；戊巴比妥鈉（美國Sigma 公司）；雙能X 線吸收儀（美國Hologic公司）；4、-20、-70 ℃冰箱（青島海爾股份有限公司）；掌式離心機(jī)（江蘇林貝爾儀器制造有限公司）；蒸汽壓力滅菌鍋（上海三申醫(yī)療器械有限公司）；恒溫箱（常州國華電器有限公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；切片機(jī)（德國徠卡公司）；包埋機(jī)（英國Shandon公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組與模型制備 32 只SPF 級雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、假手術(shù)組、骨質(zhì)疏松組、補腎活血組，每組8 只。對照組無任何處理，假手術(shù)組僅暴露睪丸但不切除；骨質(zhì)疏松組和補腎活血組切除雙側(cè)睪丸。

1.4.2 干預(yù)方法 于睪丸切除術(shù)后第16 周開始干預(yù)，補腎活血組予補腎活血方灌胃，給藥劑量按體表面積比換算，按照臨床等效4倍劑量計算［12］，劑量55 g/（kg·d）。對照組、假手術(shù)組和骨質(zhì)疏松組均予等量生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)給藥8周。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 骨密度檢測 干預(yù)結(jié)束后處死大鼠，取大鼠右后側(cè)股骨，剔除附著于骨表面的軟組織，保持股骨完整，0.9% NaCl 溶液沖洗并用紗布包好置于-70 ℃冰箱待檢；采用雙能X 線吸收儀對大鼠股骨進(jìn)行掃描，用小動物測量軟件對股骨干骺端進(jìn)行BMD分析。

1.5.2 胸主動脈鈣化情況觀察 4 組大鼠胸主動脈段各剪取約0.5 cm，置于10%福爾馬林溶液中固定，乙醇梯度逐級脫水后二甲苯透明，進(jìn)行石蠟包埋，切片（厚度4 μm）后恒溫箱60 ℃烤片30 min，二甲苯脫蠟，乙醇梯度復(fù)水，2%茜素紅S 液染色1～5 min，1%鹽酸酒精分化，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，最后用中性樹脂進(jìn)行封片，置于顯微鏡下觀察拍照，并進(jìn)行大鼠胸主動脈血管壁鈣沉積積分光密度（integrated optical density，IOD）值分析。

1.5.3 大鼠血清PⅠNP、BGP、CTX-Ⅰ濃度檢測 以2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）深度麻醉大鼠，腹主動脈取血10 mL，靜置于肝素鈉抗凝管中，4 ℃3 500 r/min離心5 min，取上清液。采用ELISA法檢測血清PⅠNP、BGP 和CTX-Ⅰ的濃度，具體操作參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.4 大鼠胸主動脈OPG、RANKL蛋白表達(dá)水平檢測 取胸主動脈石蠟組織切片，進(jìn)行脫蠟和水洗后使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗，高壓修復(fù)抗原，再用3%過氧化氫室溫下封閉10 min，然后用PBS 沖洗，加非特異性血清30 min 后棄去，分別滴加一抗OPG（1∶100）、RANKL（1∶200），另外設(shè)置以PBS 代替一抗的切片為陰性對照，于4 ℃冰箱內(nèi)過夜，PBS漂洗3次，5 min/次，滴加二抗，37 ℃靜置30 min，DAB 顯色1～3 min，自來水沖洗5 min，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡下觀察拍照。采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行免疫組化染色半定量分析，每只大鼠胸主動脈組織取3張切片，每張切片隨機(jī)取10個高倍視野，計算每個視野陽性表達(dá)IOD 值，用陽性表達(dá)IOD 值表示胸主動脈組織OPG、RANKL蛋白的表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布以（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊時采用LSD-t法，方差不齊時采用Tamhane法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4 組BMD、胸主動脈血管壁鈣沉積IOD 值比較

與對照組比較，骨質(zhì)疏松組BMD 水平明顯降低，胸主動脈血管壁鈣沉積IOD 值明顯升高（P＜0.05）。與骨質(zhì)疏松組比較，補腎活血組BMD 水平明顯升高，胸主動脈血管壁鈣沉積IOD值明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 4組BMD、鈣沉積IOD比較（±s）Table 1 Comparison of BMD and IOD of calcium deposition in four groups（±s）

表1 4組BMD、鈣沉積IOD比較（±s）Table 1 Comparison of BMD and IOD of calcium deposition in four groups（±s）

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與骨質(zhì)疏松組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the control group, 1) P＜0.05; compared with the osteoporosis group,2)P＜0.05.

組別對照組假手術(shù)組骨質(zhì)疏松組補腎活血組n8888 BMD/（g/cm2）0.312 3±0.011 5 0.310 4±0.015 7 0.263 6±0.009 61）0.280 2±0.005 02）鈣沉積IOD值0.00±0.00 0.00±0.00 1 328.55±125.081）507.16±61.752）

胸主動脈茜素紅染色結(jié)果顯示，對照組和假手術(shù)組胸主動脈血管壁未見橘紅色顆粒沉著，骨質(zhì)疏松組胸主動脈血管壁可見大量散在小片狀深橘紅色顆粒樣沉積，補腎活血組胸主動脈血管壁只見少量散在淺橘紅色顆粒樣沉積。見圖1。

圖1 4組胸主動脈鈣化比較（×40）Figure 1 Comparison of calcification of thoracic aorta in four groups(×40)

2.2 4組大鼠血清PⅠNP、BGP和CTX-Ⅰ水平比較

與對照組比較，骨質(zhì)疏松組血清PⅠNP、BGP 水平明顯降低，骨吸收標(biāo)志物CTX-Ⅰ水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與骨質(zhì)疏松組比較，補腎活血組PⅠNP、BGP 水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而CTX-Ⅰ水平無明顯區(qū)別，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2、圖2。

圖2 4組血清PⅠNP、BGP和CTX-Ⅰ濃度比較Figure 2 Comparison of PⅠNP,BGP and CTX-Ⅰof serum in four groups

表2 4組血清PⅠNP、BGP和CTX-Ⅰ濃度比較（±s） ng/mLTable 2 Comparison of PⅠNP，BGP and CTX-Ⅰof serum in four groups（±s） ng/mL

表2 4組血清PⅠNP、BGP和CTX-Ⅰ濃度比較（±s） ng/mLTable 2 Comparison of PⅠNP，BGP and CTX-Ⅰof serum in four groups（±s） ng/mL

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與骨質(zhì)疏松組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1)P＜0.05;compared with the osteoporosis group,2)P＜0.05.

組別對照組假手術(shù)組骨質(zhì)疏松組補腎活血組n8888 PⅠNP 59.48±13.70 58.50±14.88 42.37±7.631）56.72±11.502）BGP 10.75±1.39 10.48±1.72 8.39±1.451）10.33±1.762）CTX-Ⅰ5.08±1.23 5.60±1.09 8.39±1.451）5.87±1.61

2.3 4 組胸主動脈OPG、RANKL 蛋白表達(dá)水平比較

OPG 免疫組化染色結(jié)果顯示，對照組、假手術(shù)組大鼠血管壁平滑肌層細(xì)胞質(zhì)可見大量深染棕黃色顆粒沉著；骨質(zhì)疏松組大鼠血管壁平滑肌層細(xì)胞質(zhì)只見少量淺染棕黃色顆粒；補腎活血組大鼠血管壁平滑肌層細(xì)胞質(zhì)可見中等量棕黃色顆粒沉著。RANKL 免疫組化染色結(jié)果顯示，對照組、假手術(shù)組大鼠血管壁平滑肌層細(xì)胞質(zhì)只見少量淺染棕黃色顆粒沉著；骨質(zhì)疏松組大鼠血管壁平滑肌層細(xì)胞質(zhì)可見大量深染棕黃色顆粒；補腎活血組大鼠血管壁平滑肌層細(xì)胞質(zhì)可見中等量棕黃色顆粒沉著。見圖3。

圖3 4組胸主動脈OPG/RANKL蛋白表達(dá)情況（×20）Figure 3 Expression of OPG/RANKL protein of thoracic aorta in four groups(×20)

與對照組比較，骨質(zhì)疏松組大鼠胸主動脈OPG表達(dá)水平明顯降低，RANKL 表達(dá)水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與骨質(zhì)疏松組比較，補腎活血組大鼠胸主動脈OPG 表達(dá)水平明顯增加，RANKL 表達(dá)水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 4組胸主動脈OPG、RANKL IOD值比較（±s）Table 3 Comparison of IOD of OPG and RANKL of thoracic aorta in four groups（±s）

表3 4組胸主動脈OPG、RANKL IOD值比較（±s）Table 3 Comparison of IOD of OPG and RANKL of thoracic aorta in four groups（±s）

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與骨質(zhì)疏松組比較，2）P＜0.05。Notes:Compared with the control group, 1) P＜0.01; compared with the osteoporosis group,2)P＜0.05.

組別對照組假手術(shù)組骨質(zhì)疏松組補腎活血組n8888 OPG IOD值10 531.63±1 308.15 11 086.47±1 259.55 3 508.52±425.691）7 635.48±1 168.552）RANKL IOD值2 518.87±310.06 2 704.37±325.91 4 532.85±526.751）3 526.11±467.852）

3 討 論

中醫(yī)學(xué)將OP 歸于“骨痹”“骨痿”等范疇，其病因病機(jī)與腎息息相關(guān)。腎藏精，主骨生髓，骨骼的生長發(fā)育需要腎精氣的濡養(yǎng)，腎精不足，髓失所養(yǎng)，易發(fā)骨痿。而VC 與“瘀血”“痰濁”等病癥相似，血管屬中醫(yī)學(xué)“脈”的范疇。心主血脈，心失所養(yǎng)，血行不暢，日久因虛而生瘀血痰濁。《景岳全書》曰：“心本乎腎，所以上不寧者，未有不由乎下，心氣虛者，未有不因乎精。”O(jiān)P、VC 與“心腎”功能密切相關(guān)。二者共同發(fā)病的中醫(yī)病機(jī)為腎虛血瘀，以補腎活血法治療符合OP和VC腎虛血瘀的發(fā)病病機(jī)。

3.1 補腎活血方可以有效改善去勢大鼠骨質(zhì)疏松并抑制動脈鈣化

BMD 是國際公認(rèn)的診斷骨質(zhì)疏松的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，骨質(zhì)疏松組BMD水平明顯降低，胸主動脈可見大量散在的鈣化沉積。這提示，切除大鼠睪丸可導(dǎo)致BMD 下降，引發(fā)骨質(zhì)疏松和胸主動脈鈣化的發(fā)生。這可能與去睪丸大鼠骨代謝失衡引起異常的鈣磷礦物質(zhì)在血管系統(tǒng)中沉積，促進(jìn)血管鈣化形成有關(guān)［13-14］。骨形成標(biāo)志物PⅠNP、BGP 和骨吸收標(biāo)志物CTX-Ⅰ水平是臨床上常用于評估老年性骨質(zhì)疏松治療效果的重要指標(biāo)，具有較高敏感性和特異性［15］。本研究結(jié)果顯示，與骨質(zhì)疏松組比較，補腎活血組大鼠BMD 水平、血清PⅠNP 和BGP 水平明顯升高，這提示補腎活血方可通過提高骨質(zhì)疏松大鼠的骨形成水平，調(diào)節(jié)骨代謝失衡，從而有效改善大鼠骨質(zhì)疏松。此外，補腎活血組大鼠胸主動脈鈣化沉積較骨質(zhì)疏松組明顯減少，這提示補腎活血方可在一定程度上抑制骨質(zhì)疏松大鼠胸主動脈血管壁鈣化。這初步證實了補腎活血方用于治療OP 和VC 具有良好的效果。這可能與以下原因有關(guān)：補腎活血方中淫羊藿和熟地黃合用，陰陽雙補；補骨脂溫腎壯陽；丹參活血化瘀；黃芪益氣活血；當(dāng)歸活血通經(jīng)；大黃祛瘀泄?jié)?。全方壯筋骨通血脈，補腎活血以去除腎虛血瘀之證，從而抑制OP 和VC 的發(fā)生、發(fā)展。這與肖亞平等［16-17］研究發(fā)現(xiàn)補腎中藥可生精壯骨、活血通脈的結(jié)果一致。

3.2 補腎活血方改善OP 大鼠骨質(zhì)疏松、動脈鈣化可能與OPG/RANKL信號通路有關(guān)

RANKL 與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的核因子кB活化因子受體（receptor activator of nuclear factorkappa B，RANK）結(jié)合，可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化成熟，促進(jìn)骨吸收，而通過刺激OPG 競爭性與RANKL 結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞生長活性和骨吸收，平衡骨代謝水平，改善骨微結(jié)構(gòu)［18］。本研究結(jié)果顯示，與骨質(zhì)疏松組比較，補腎活血方組BMD 水平、OPG 表達(dá)水平明顯上升，RANKL 表達(dá)水平明顯下降。這提示，補腎活血方可提高OPG 表達(dá)，降低RANKL 表達(dá)，改善去勢大鼠骨質(zhì)疏松和動脈鈣化情況。其具體機(jī)制可能與以下因素有關(guān)：①補腎活血方中淫羊藿苷能夠上調(diào)OPG 表達(dá)，補骨脂素提高OPG 表達(dá)和降低RANKL 表達(dá)，從而抑制破骨細(xì)胞的分化成熟，促進(jìn)骨形成［19］。②血管鈣化的發(fā)生與OPG 低表達(dá)、RANKL 高表達(dá)密切相關(guān)［20］，RANKL 與RANK 結(jié)合可上調(diào)骨堿性磷酸酶活性，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞成骨樣變，形成血管鈣化。補腎活血方可使OPG 表達(dá)上升，RANKL 表達(dá)下降，而OPG 與RANKL 結(jié)合可抑制骨質(zhì)疏松大鼠胸主動脈鈣化的發(fā)生與進(jìn)展［8］。這提示，補腎活血方改善OP 大鼠動脈鈣化可能與OPG/RANKL信號通路調(diào)控有關(guān)。

4 小 結(jié)

綜上所述，補腎活血方能提高骨質(zhì)疏松大鼠BMD 水平，促進(jìn)骨形成，改善其誘導(dǎo)的動脈鈣化情況。作用機(jī)制可能與其能上調(diào)OPG 表達(dá)，抑制RANKL 表達(dá)，調(diào)控胸主動脈中OPG/RANKL 信號通路的表達(dá)有關(guān)。本研究為補腎活血方的臨床應(yīng)用提供了一定理論依據(jù)，但補腎活血方具有多靶點、整體調(diào)節(jié)效應(yīng)，其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。