多肽復(fù)配組合物對(duì)皮膚結(jié)構(gòu)相關(guān)效應(yīng)蛋白促進(jìn)表達(dá)協(xié)同增效的研究

皮膚中存在眾多的ECM（extracellular matrix，細(xì)胞外基質(zhì)）蛋白，其中膠原蛋白、彈性蛋白是最重要的兩種

，它們?cè)谄つw抗衰老中起著非常重要的作用。除了膠原蛋白和彈性蛋白，還有非常多的結(jié)構(gòu)蛋白，結(jié)構(gòu)輔助蛋白

。在這些結(jié)構(gòu)輔助蛋白里，LOXL-1是一種很重要的細(xì)胞外依賴(lài)銅的胺氧化酶

，催化膠原蛋白和彈性蛋白中交叉鏈接形成的第一步，其表達(dá)量的增加能更好地促進(jìn)膠原蛋白和彈性蛋白纖維的生成

。

彈性蛋白是彈性纖維(elastic fbers)的主要成分。彈性纖維主要存在于韌帶和脈管壁。彈性纖維與膠原纖維共同存在， 賦予組織以彈性和抗張能力。盡管彈性蛋白只占真皮總蛋白的2%，但它對(duì)皮膚彈性起著重要作用

。

乙?；?1鯨蠟酯，乙?；碾?2，假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物都是各大化妝品公司經(jīng)常使用的核心原料，原料供應(yīng)商提供的之前的研究資料表明，乙?；?1鯨蠟酯能有效促進(jìn)彈力蛋白的再生，注重彈性纖維的修復(fù)，為肌膚打造一層健康、緊致的纖維網(wǎng)絡(luò)，抑制表情紋。它同時(shí)被稱(chēng)作肌膚的“彈力素”，可支撐松垮的皮膚，提供緊致上揚(yáng)的彈力。乙酰基四肽-2可以上調(diào)與膠原蛋白合成和黏著斑有關(guān)的基因表達(dá)，誘導(dǎo)彈性蛋白、I型膠原蛋白合成，從而增加皮膚緊實(shí)度。假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)I型，IV型膠原蛋白和彈性蛋白合成，提高皮膚屏障功能，減少炎性基因表達(dá)，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化等諸多功效，然而對(duì)這三者進(jìn)行的單獨(dú)和聯(lián)合的功效比較測(cè)試還未有研究，此次研究就評(píng)估了三個(gè)原料的聯(lián)合對(duì)皮膚相關(guān)結(jié)構(gòu)蛋白的協(xié)同增效促進(jìn)作用。

材料和方法

01 試劑與儀器

DMEM 培養(yǎng)基（20210121/20210406，Cellmax），血清（2132094P，Gibco），胰酶（20210113/20210323，碧云天），雙抗（20200828，北京索萊寶科技有限公司），TRIzon（03877/35120，康為世紀(jì)），三氯甲烷（20200105，國(guó)藥化學(xué)試劑），HiFiScript cDNA Synthesis Kit（100rxns34520，康為世紀(jì)），UltraSYBR（31420，康為世紀(jì)）, 噻唑藍(lán)（MTT，Sigma-Aldrich 公司， M2128-100MG），HFF-1人皮膚成纖維樣細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)上海細(xì)胞庫(kù), 培養(yǎng)條件：5% CO

，37℃恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)基：89% DMEM+10%FBS+1%雙抗）， 乙酰基二肽-1鯨蠟酯（1453629，Sederma），乙?；碾?2 （U19B013-20，Lipotec），假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物（U07K010-19，Lipotec），生物顯微鏡（LWD300-38LT，上海測(cè)維光電技術(shù)有限公司），恒溫水浴鍋（HH-1嘉興俊思電子有限公司），高速冷凍離心機(jī)（Sorvall Legend Micro 17R，Thermo），CO

培養(yǎng)箱（BB150，Thermo），純水儀（Smart-DUF，上海和泰儀器有限公司），多功能酶標(biāo)儀（SpectraMax iD3，Molecular Devices）。

02 測(cè)試方法

取指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以1×104 cells/mL的密度接種于96孔板上，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)終體積為0.2mL，而后吸棄上清，加入新鮮制備的不同濃度的藥物（無(wú)血清）或者不加藥物（無(wú)血清）孵育，培養(yǎng)終體積為0.2 mL。24 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞毒性情況。MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性，于490 nm測(cè)定吸光度，計(jì)算細(xì)胞活率。細(xì)胞活率 =A

/A

×100%。

取指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以1×105 cells/mL的密度接種于6孔板上，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)終體積為2 mL。而后吸棄上清，加入新鮮制備的不同濃度的藥物（無(wú)血清）或者不加藥物（無(wú)血清）孵育，培養(yǎng)終體積為2 mL。24 h后，按RNA提取標(biāo)準(zhǔn)操作流程提取各孔R(shí)NA，qPCR法檢 測(cè)HFF-1細(xì) 胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、Col-XVII、Elastin、Fibrillin-1 、Fibulin-5、Decorin、LOXL-1 、TGF-β、Integrin mRNA的表達(dá)影響。

行動(dòng)主張：建議學(xué)院專(zhuān)業(yè)再次結(jié)合現(xiàn)專(zhuān)業(yè)、行業(yè)背景確定什么是基本能力，什么是必要的擴(kuò)展能力，當(dāng)下行業(yè)緊俏的擴(kuò)展能力，但不能設(shè)置的太高，不然達(dá)不到技訓(xùn)的目的。

本研究選取5 μg/mL乙?；?1鯨蠟酯、5 μg/mL乙?；碾?2、5 μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物單獨(dú)或聯(lián)合對(duì)HFF-1細(xì)胞孵育24 h，提取細(xì)胞總RNA后，qPCR檢測(cè)膠原蛋白相關(guān)mRNA的表達(dá)，結(jié)果如圖2所示。5 μg/mL乙?；?1鯨蠟酯、5 μg/mL乙?；碾?2、5 μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物單獨(dú)給藥能促進(jìn)COL-I， COL-III，COL-IV, LOXL-1的表達(dá)，與單獨(dú)給藥相比，5 μg/mL 乙酰基二肽-1鯨蠟酯、5 μg/mL乙酰基四肽-2、5 μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物聯(lián)合給藥，協(xié)同增加HFF-1細(xì)胞Col-I、LOXL-1mRNA的表達(dá)（

＜0.05）。

受試物和對(duì)照品用DMSO或者ddH2O配制成母液，再用無(wú)血清培養(yǎng)基或者PBS稀釋至合適濃度。

本題是培養(yǎng)學(xué)生轉(zhuǎn)化能力的極佳素材，雖然條件一讀就懂、圖形一看就明，但一做卻又難以入手．不過(guò)，借助“知識(shí)溯源式目標(biāo)分析法”卻可巧妙地讓解題思維轉(zhuǎn)化路線(xiàn)圖水落石出．

分別用0.1、0.5、1、5、10、20、40 μg/mL 乙酰基二肽-1鯨蠟酯，乙酰基四肽-2，假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物，或乙?；?1鯨蠟酯：乙?；碾?2：假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物質(zhì)量比為1：1：1聯(lián)合給藥，MTT法評(píng)估細(xì)胞毒性，結(jié)果如圖1所示，由圖1可知，乙?；?1鯨蠟酯在20ug/mL下都沒(méi)有細(xì)胞毒性，乙?；碾?2在40ug/mL都沒(méi)有毒性，假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物在40ug/mL下都沒(méi)有細(xì)胞毒性，乙?；?1鯨蠟酯，乙酰基四肽-2，假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物三者1：1：1聯(lián)合給藥，在20ug/mL下非但沒(méi)有細(xì)胞毒性，而且還能促進(jìn)細(xì)胞增殖。

虛擬云桌面就是對(duì)計(jì)算機(jī)桌面進(jìn)行虛擬化，它是通過(guò)在數(shù)據(jù)中心服務(wù)器上創(chuàng)建虛擬桌面為載體，然后運(yùn)用一系列網(wǎng)絡(luò)傳輸協(xié)議將遠(yuǎn)端的操作系統(tǒng)和應(yīng)用發(fā)送給多媒體教室終端設(shè)備的過(guò)程。南京城市職業(yè)學(xué)院多媒體教學(xué)場(chǎng)景所采用的虛擬桌面是通過(guò)VMware vSphere構(gòu)建虛擬化平臺(tái)+瘦客戶(hù)機(jī)的方式實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)虛擬化技術(shù)的運(yùn)用，使整個(gè)部署過(guò)程變得十分簡(jiǎn)便，也讓遠(yuǎn)程統(tǒng)一管控變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。

結(jié)果

01 受試物對(duì)HFF-1細(xì)胞毒性的影響

細(xì)胞給藥后提取總RNA，qPCR，檢測(cè)HFF-1細(xì)胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、Col-XVII、Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、Decorin、LOXL-1、TGF-β、IntegrinmRNA的表達(dá)影響。

乙?；?1鯨蠟酯， 乙?；碾?2，假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物單獨(dú)或聯(lián)合給藥24 h對(duì)HFF-1細(xì)胞增殖的影響。

= 3, Mean ± SEM?！?＊＊＊ ”表示與對(duì)照組相比

＜ 0.001。

02 受試物對(duì)HFF-1細(xì)胞膠原蛋白相關(guān)基因表達(dá)的影響

近幾天來(lái)，楊力生做生意特別賺錢(qián)，他心里高興，想起了老婆一些好處，便想和老婆親熱一番。晚上九點(diǎn)以后，孩子到西間睡去了。楊力生湊到老婆身邊，討好地說(shuō)：“怎么樣，今天很累嗎？”

采用Excel錄入和 GraphPad Prism 7 軟件包統(tǒng)計(jì)處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。各組間做單因素方差分析（ANOVA）。認(rèn)為

＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

乙酰基二肽-1鯨蠟酯、乙?；碾?2、假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物單獨(dú)或聯(lián)合給藥24 h對(duì)HFF-1細(xì)胞膠原蛋白相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響。

= 3, Mean ± SEM?！埃北硎九c聯(lián)合給藥組相比

＜ 0.05， “ ＊＊ ”表示與聯(lián)合給藥組相比

＜ 0.01， “ ＊＊＊ ”表示與聯(lián)合給藥組相比

＜ 0.001。

給予康復(fù)訓(xùn)練，首先是采用冷刺激閥，刺激患者的口腔、咽喉部，如采用冷凍棉簽按摩口唇、咽頰部與咽腭弓，幫助患者練習(xí)吞咽動(dòng)作，提高其舌體的力量及靈活度等；其次幫助患者進(jìn)行屏氣、發(fā)聲運(yùn)動(dòng)，指導(dǎo)其在坐椅上，并用雙手支撐、推壓，同時(shí)做屏氣動(dòng)作，注意應(yīng)保持胸廓的固定，聲門(mén)也應(yīng)緊閉，再突然松手、開(kāi)聲門(mén)、呼發(fā)聲；最后訓(xùn)練其自行攝食，應(yīng)選擇30～60°頸前屈、仰臥位進(jìn)食[3] 。以上訓(xùn)練方法時(shí)間為30 min，1次/d。訓(xùn)練時(shí)間為2周。

03 受試物對(duì)HFF-1細(xì)胞彈性蛋白相關(guān)基因表達(dá)的影響

5 μg/mL乙?；?1鯨蠟酯、5 μg/mL乙?；碾?2、5 μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物單獨(dú)或1：1：1聯(lián)合對(duì)HFF-1細(xì)胞孵育24 h，提取細(xì)胞總RNA后，qPCR檢測(cè)彈性蛋白相關(guān)mRNA的表達(dá)，結(jié)果如圖3所示。5 μg/mL乙?；?1鯨蠟酯、5 μg/mL乙酰基四肽-2、5 μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物單獨(dú)給藥能促進(jìn)Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、TGF-β、Integrin 的mRNA表達(dá)，與單獨(dú)給藥相比，5 μg/mL 乙?；?1鯨蠟酯、5 μg/mL乙?；碾?2、5 μg/mL 假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物聯(lián)合給藥協(xié)同增加HFF-1細(xì)胞Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、TGF-βmRNA 的表達(dá)（

＜0.05）。

乙?；?1鯨蠟酯，乙?；碾?2，假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物單獨(dú)或聯(lián)合處理24 h對(duì)HFF-1細(xì)胞相關(guān)mRNA表達(dá)的影響。

= 3, Mean ± SEM?！埃北硎九c聯(lián)合給藥組相比

＜ 0.05，“ ＊＊ ”表示與聯(lián)合給藥組相比

＜ 0.01， “ ＊＊＊ ”表示與聯(lián)合給藥組相比

＜ 0.001。

軟土路基處理技術(shù)在我國(guó)公路工程建設(shè)中發(fā)揮了重要作用。公路軟土路基處理技術(shù)發(fā)展歷史較長(zhǎng)，經(jīng)多年的發(fā)展積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。路基處理技術(shù)的發(fā)展可分為兩個(gè)時(shí)期，建國(guó)初期應(yīng)用路基處理技術(shù)主要為擠密土樁，砂石墊層等。80年代后期，隨著改革開(kāi)放的發(fā)展，建筑工程建設(shè)不斷進(jìn)步。在公路工程建設(shè)中引進(jìn)了大量的國(guó)外先進(jìn)技術(shù)，促進(jìn)了我國(guó)建筑事業(yè)建設(shè)發(fā)展。

小結(jié)與討論

化妝品中的生物多肽類(lèi)化合物具有高生物活性、易吸收、安全無(wú)毒的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)其在美容護(hù)膚、抗衰老研究課題中的生理作用與生物效應(yīng)逐漸引發(fā)關(guān)注

；多肽的生物學(xué)活性取決于其氨基酸組成和序列，人體內(nèi)各種生理進(jìn)程幾乎都是由特定的氨基酸序列組成的多肽或者蛋白質(zhì)調(diào)控的。因此，生物活性肽為化妝品研發(fā)和應(yīng)用提供了全新方向和思路，并且功能越來(lái)越細(xì)分，如抗衰老、抗過(guò)敏、修復(fù)、抗氧化、抗水腫、促進(jìn)毛發(fā)再生、抑制黑色素生成等。添加多肽到化妝品中能夠幫助改善、修復(fù)皮膚的各種問(wèn)題，但目前單種多肽活性物質(zhì)應(yīng)用報(bào)道較多，而多種多肽和活性物的組合應(yīng)用研究開(kāi)發(fā)較少

，特別是多種不同類(lèi)型的肽類(lèi)和活性物組合針對(duì)抗衰老的靶點(diǎn)協(xié)同增效作用報(bào)道較少。本研究中的多肽提取物組合協(xié)同增效結(jié)果，在活性物組合的研究中，具備較強(qiáng)的創(chuàng)新性。在本研究中，我們采用乙?；?1鯨蠟酯、乙?；碾?2、假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物聯(lián)合給藥，發(fā)現(xiàn)協(xié)同給藥能協(xié)同促進(jìn)HFF-1細(xì) 胞Col-I、LOXL-1、Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5 mRNA的表達(dá)，獲得更強(qiáng)、更顯著的抗衰老效果。

本罪為情節(jié)犯，由法條可以看出，分為情節(jié)嚴(yán)重和情節(jié)特別嚴(yán)重，相對(duì)應(yīng)的有兩種輕重不同的法定刑。至于何謂“情節(jié)嚴(yán)重”或“情節(jié)特別嚴(yán)重”，并沒(méi)有明確規(guī)定。一般認(rèn)為，多次、大量非法獲取他人計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)的為情節(jié)嚴(yán)重。

綜上所述，本研究采用乙?；?1鯨蠟酯、乙?；碾?2和假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物三種活性組份，針對(duì)抗衰老的靶點(diǎn)進(jìn)行協(xié)同增效作用，能夠顯著地增加對(duì)抗衰老相關(guān)的重要蛋白的表達(dá)。因而，本研究中的抗衰老組合物、乙?；?1鯨蠟酯、乙?；碾?2、假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物的聯(lián)合應(yīng)用，具有更好的協(xié)同增效的抗衰老活性，因?yàn)槁?lián)合作用功效增強(qiáng)了，在同等的功效下，聯(lián)合作用原料可以用量更小，所以這樣的組合具備在化妝品產(chǎn)品中少量添加就能達(dá)到更好效果的應(yīng)用前景。

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