大麻二酚對急性放射性肺損傷保護(hù)作用及機(jī)制研究

武忠寶， 閻 英， 徐 瑩， 呂東陽， 柳云恩

1.沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽 110016；2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 放療科，遼寧 沈陽 110016

放射治療是一種應(yīng)用廣泛且有效的非手術(shù)治療方法。 超過50%的肺癌患者在病程中至少接受過一次的放射治療[1]，但放射治療常會造成放射性肺損傷，主要表現(xiàn)為急性放射性肺炎和纖維化[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，放射會造成肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞聚集在組織損傷部位[3]。 這些炎癥細(xì)胞會產(chǎn)生細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β、干擾素(interferon，INF)-γ 和白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-13 等，從而聚集更多的炎癥細(xì)胞，破壞細(xì)胞間的緊密連接，過量的細(xì)胞外基質(zhì)沉積，最終導(dǎo)致肺纖維化[4-5]。 目前，放射性肺損傷發(fā)病機(jī)制尚不明確，且缺乏有效的治療手段，尋找新的可減輕放射性肺損傷的有效手段是亟待解決的難題之一。大麻二酚(cannabidiol，CBD)是從大麻中提取的一種無毒成分，具有抗炎、抗細(xì)胞凋亡和抗氧化應(yīng)激的能力[6-8]。 近年來，歐美國家在非精神活性成分大麻提取物CBD 的藥理研究和藥物開發(fā)應(yīng)用方面取得了較大進(jìn)展，純CBD 的制備已用于腫瘤、急慢性疼痛、風(fēng)濕性疾病、精神類疾病、多發(fā)性硬化癥和兒童癲癇的治療[9-12]。 CBD 的用藥安全性具有保障，但CBD 在放射性肺損傷中的作用卻少見報(bào)道。 本研究通過構(gòu)建放射性急性肺損傷動物模型，腹腔注射CBD，旨在闡明CBD 對放射性急性肺損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。 現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 40 只健康雄性SD 大鼠(6 ~8 周齡，體質(zhì)量280 ~300 g)購自本溪長生生物科技公司。 大鼠飼養(yǎng)于北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院重癥戰(zhàn)創(chuàng)傷實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室溫度為22℃~24℃，相對濕度40% ~70%，12 h 晝夜交替。 大鼠可自由飲水、飲食。 經(jīng)過7 d 環(huán)境適應(yīng)后，將40 只將大鼠隨機(jī)分成對照組、放射組、CBD 低劑量組(15 mg/kg)和CBD高劑量組(30 mg/kg)，每組各10 只。 所有實(shí)驗(yàn)操作和實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動物倫理委員會審批通過。

1.2 放射性急性肺損傷動物模型制備 采用10%水合氯醛3 ml/kg 腹腔注射麻醉，麻醉過程中密切關(guān)注大鼠行為和呼吸變化，待肌肉完全松弛后固定在自制泡沫板上，腹部向上，在泡沫板上畫好標(biāo)記。麻醉后，立即送至Phillips CT 模擬定位機(jī)下模擬定位，CT 圖像通過網(wǎng)絡(luò)以DICOM 格式傳輸至Elekta Monaco 治療計(jì)劃系統(tǒng)，在TPS 上對大鼠肺部進(jìn)行勾畫并生成放射治療計(jì)劃。 按TPS 制定計(jì)劃行直線加速器單次照射20 Gy。 照射結(jié)束待大鼠恢復(fù)行動能力后送至動物實(shí)驗(yàn)室繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.3 給藥方式及取材 照射結(jié)束后第2 天開始，每天同一時(shí)間測量并記錄大鼠的體質(zhì)量。 CBD 低劑量組和CBD 高劑量組大鼠分別腹腔注射15 mg/kg 和30 mg/kg 的CBD，連續(xù)注射6 d。 腹腔注射時(shí)傾斜進(jìn)針，使藥物進(jìn)入腹腔避免刺破腸腔，整個(gè)過程不需要麻醉。 取大鼠血液，在EP 管中室溫靜置1 h以上，3 000 r/min 離心10 min，取血清并做好標(biāo)記。3%苯巴比妥鈉麻醉后處死大鼠。

1.4 組織病理學(xué)觀察 肺組織用10%中性甲醛固定、脫水、透明、石蠟包埋，然后制成3 ~4 μm 切片。將切片攤鋪并在室溫下烘焙過夜。 自然干燥后，用蘇木精-伊紅(HE)對切片進(jìn)行染色，并在顯微鏡下觀察肺組織的病理變化。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測肺組織IL-1β、IL-6 和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的濃度。 在450 nm 波長處測定IL-1β、IL-6 和TNF-α 在微板閱讀器中的濃度，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，繪制最佳密度值與標(biāo)準(zhǔn)濃度的關(guān)系圖，計(jì)算并測定樣品濃度的曲線方程和r 值。

1.6 蛋白免疫印跡法 通過添加冷蛋白裂解物和蛋白酶抑制劑，從冷凍的肺組織中提取總蛋白。 用BCA 法測定各組大鼠的總蛋白濃度。 組織蛋白經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上。 膜用TBST 清洗3 次，室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h，用TBST 清洗，參照Marker 切割。 添加 一 抗(IL-1β、 IL-4、 IL-6、 IL-17、 TNF-α、 IREα、MDA5、CHOP、Semaphorin 7α、AHSG 和Uteroglobin)在4℃孵育過夜。 用TBST 清洗3 次，每次10 min。加入二抗反應(yīng)液，在室溫下孵育2 h，然后用TBST清洗3 次，每次10 min。 采用ECL 化學(xué)發(fā)光顯影，置于化學(xué)凝膠成像系統(tǒng)(伯樂，美國)中進(jìn)行掃描曝光。 采用Image J 軟件測量灰度值，以相應(yīng)的內(nèi)部參數(shù)作為測量和分析標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。 計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析和Fisher 精確檢驗(yàn)。 以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理結(jié)果 對照組大鼠肺組織未見明顯改變，放射組大鼠肺組織明顯水腫、變性/壞死、炎癥細(xì)胞浸潤，而CBD 低劑量組和CBD高劑量組放射導(dǎo)致的急性肺損傷明顯改善。 見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理結(jié)果(HE×200)

2.2 各組大鼠血清炎癥因子表達(dá)水平比較 與對照組比較，放射組血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平明顯升高(P <0.05)；與放射組比較，CBD 低劑量組和CBD 高劑量組血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平明顯降低(P<0.05)。 見圖2。

圖2 各組大鼠血清炎癥因子表達(dá)水平

2.3 各組大鼠肺組織炎癥因子蛋白表達(dá)水平比較 與對照組比較，放射組肺組織IL-1β、IL-4、IL-6、IL-17 和TNF-α 蛋 白 表 達(dá) 明 顯 增 加(P <0.05)；與放射組比較，CBD 低劑量組和CBD 高劑量組肺組織IL-4、IL-6、IL-17 和TNF-α 蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與放射組比較，CBD 高劑量組肺組織IL-1β 蛋白表達(dá)明顯降低(P < 0.05)。見圖3。

2.4 各組大鼠肺組織氧化應(yīng)激蛋白表達(dá)水平比較 與對照組比較，放射組肺組織IREα、MDA5 和CHOP 蛋白表達(dá)明顯增加(P <0.05)；與放射組比較，CBD 高劑量組肺組織IREα、MDA5 和CHOP 蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。 見圖4。

2.5 各組大鼠炎癥浸潤調(diào)控關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平比較 與對照組比較，放射組大鼠炎癥浸潤調(diào)控蛋白Semaphorin 7α、AHSG 和Uteroglobin 表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與放射組比較，CBD 高劑量組肺組織Semaphorin 7α、AHSG 和Uteroglobin 蛋白表達(dá)明顯降低(P <0.05)；與放射組比較，CBD 低劑量組肺組織Semaphorin 7α 蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見圖5。

3 討論

放射性肺損傷常見于肺癌、食管癌及其他胸部腫瘤的放射治療中，易造成早期急性放射性肺炎及晚期肺纖維化[13]。 有研究發(fā)現(xiàn)，放射治療4 ~24 h內(nèi)，肺組織常出現(xiàn)非特異性的急性反應(yīng)，受損的肺組織和內(nèi)皮細(xì)胞會吸引巨噬細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞釋放大量炎癥細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子[14]。 本研究發(fā)現(xiàn)，放射導(dǎo)致大鼠血清炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 明顯增加，同時(shí)肺組織IL-1β、IL-4、IL-6、IL-17 和TNF-α 蛋白表達(dá)也明顯增加，提示放射可以造成血清和組織炎癥因子表達(dá)水平升高。

圖3 各組大鼠肺組織炎癥因子蛋白表達(dá)水平

圖4 各組大鼠肺組織氧化應(yīng)激蛋白表達(dá)水平

圖5 各組大鼠炎癥浸潤調(diào)控關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平

CBD 作為非甾體類抗炎藥，通過刺激多種特異性介質(zhì)被動停止促炎介質(zhì)，增加了免疫炎癥細(xì)胞的細(xì)胞程序性死亡，阻止信號激活，刺激炎癥消退。有研究報(bào)道，CBD 可抑制牙齦假單胞菌誘導(dǎo)的IL-12p40、IL-6、IL-8 和TNF-α 的釋放，同時(shí)提高抗炎細(xì)胞因子IL-10 水平[15]。 而另有研究發(fā)現(xiàn)，CBD可降低足底注射弗氏完全佐劑誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)大鼠模型血清IL-1β、IL-10 和IFN-γ 水平，提高IL-6 表達(dá)[16]。 這提示，CBD 對不同動物模型的抗炎效果并不完全一致。 此外，CBD 可抑制脂多糖誘導(dǎo)的BV-2 細(xì)胞中NF-κB 的激活，但不能抑制MAPKs 的激活，從而阻斷脂多糖誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥[17]。 本研究發(fā)現(xiàn)，放射可以造成肺組織氧化應(yīng)激蛋白IREα、MDA5 和CHOP 表達(dá)增高，炎癥浸潤調(diào)節(jié)蛋白Semaphorin7α、AHSG 和Uteroglobin 表達(dá)增高，而CBD 可以顯著降低放射導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，并改善炎癥浸潤蛋白表達(dá)。 有研究發(fā)現(xiàn)，CBD 直接針對線粒體并保護(hù)關(guān)鍵的線粒體功能，包括氧化還原調(diào)節(jié)、鈣攝取、膜電位和生物能量學(xué)調(diào)節(jié)，這些功能在催產(chǎn)素/鐵死亡誘導(dǎo)后被破壞。 CBD 的這些保護(hù)作用部分通過促進(jìn)內(nèi)源性抗氧化防御和激活A(yù)MP 激活的蛋白激酶信號實(shí)現(xiàn)[18]。 而CBD 類似物在抑制中性粒細(xì)胞滲透方面發(fā)揮了與強(qiáng)的松龍相當(dāng)?shù)挠行Э寡鬃饔肹19]。 此外，在Thp-1 巨噬細(xì)胞中，CD36僅被CBD 上調(diào)，與αTan 或αTAR 共同作用可降低CD36 的表達(dá)。 這些結(jié)果提示，CBD 可以改善放射性導(dǎo)致的急性肺損傷，可能與其抗炎和抗氧化活性有關(guān)。

綜上所述，CBD 對放射性急性肺損傷有保護(hù)作用，其作用可能通過降低炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激以及改變炎癥調(diào)控蛋白表達(dá)密切相關(guān)。