異甘草酸鎂對博來霉素誘導肺纖維化大鼠治療作用及其機制

高 瑕，代文靜，曾 軍，馮 同，李萬成

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種不可逆轉的慢性、進行性、致命性肺部疾病，預后較差，中位生存期2～4年[1]，5年生存率<30%[2]，最終多因呼吸衰竭死亡。IPF發(fā)生的主要病理機制是因毒物、射線和環(huán)境等各種因素導致肺泡上皮細胞持續(xù)受到損傷，隨后肺成纖維細胞不斷增殖和凋亡造成大量促炎、促纖維化因子釋放及大量細胞外基質沉積于肺，最后導致肺纖維化形成[3]。IPF的發(fā)病機制極其復雜，具體機制至今仍尚未完全明確，除了各種促纖維化因子異常表達外，有研究發(fā)現氧化-抗氧化失衡導致的氧化應激反應也參與了肺纖維化的形成[4]。近年，IPF發(fā)病率不斷升高[5]。雖現臨床對肺纖維化治療的研究已廣泛開展，但有效的治療選擇仍然有限[6]，糖皮質激素仍是治療IPF的主要藥物。因此，探尋肺纖維化發(fā)病機制及尋找其他治療肺纖維化有效藥物已成為臨床亟待解決的問題。

異甘草酸鎂(MgIG)是從藥用植物甘草根部提取的具有抗炎、抗凋亡、抗纖維化和抗腫瘤等多種生物活性的物質，是甘草酸第4代合成藥物[7]，在治療肝炎和肝纖維化方面有較好的效果[8]。近年有研究發(fā)現，MgIG對百草枯中毒導致的肺部損傷和放射誘導的肺纖維化也有一定治療作用[9-11]。然而，現MgIG應用于博來霉素(BLM)誘導的肺纖維化模型中的研究甚少，故本研究通過氣管內注射BLM構建肺纖維化大鼠模型，分析MgIG對其血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和肺組織轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)表達的影響，探討MgIG對肺纖維化治療作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物：清潔級成年健康雄性SD大鼠24只，體質量(220+20)g，由成都達碩實驗動物有限公司提供[實驗動物合格證號：SYXK(川)2019-189]。

1.1.2主要試劑：BLM粉劑購自成都梓誠奕博生物科技有限公司，MgIG注射液購自正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司，注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉(MTH)購自國藥集團容生制藥有限公司，Masson染色試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司，SOD和MDA檢測試劑盒均購自南京建成生物工程公司，TGF-β1、TNF-α和IFN-γ抗體購自英國Abcam公司，RIPA裂解液、廣譜蛋白酶抑制劑、BCA蛋白測定試劑盒購自武漢BOSTER生物公司。

1.1.3主要儀器：生物組織包埋機、全自動切片機(金華市益迪醫(yī)療設備有限公司生產)，熒光倒置顯微鏡(德國Leica公司生產)，凝膠成像儀(上海天能科技有限公司生產)。

1.2方法

1.2.1動物模型制備及藥物干預：將24只SD大鼠隨機分為Control組、BLM組、BLM+MgIG組和BLM+MTH組4組，每組6只。每只大鼠腹腔注射10%水合氯醛(劑量0.3 ml/100 g)進行麻醉，消毒大鼠頸部皮膚，按無菌原則切開頸部皮膚，逐層分離組織，暴露氣管。BLM組、BLM+MgIG組和BLM+MTH組向氣管內緩慢注射BLM溶液(劑量5 mg/kg)，Control組向氣管內注入等量0.9%氯化鈉注射液。注射后立即將大鼠旋轉幾分鐘，使藥物盡可能均勻分布于肺部。造模成功24 h后，BLM+MgIG組每日腹腔注射30 mg/kg MgIG注射液1次，BLM+MTH組每日腹腔注射4.5 mg/kg注射用MTH 1次，Control組和BLM組每日腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液。

1.2.2取材及病理組織學觀察：連續(xù)給藥28 d后，處死所有大鼠，切開腹腔，取腹主動脈全血5 ml，吸取離心后的上清液保存于-80℃，待全部血清采集完后按照SOD及MDA檢測試劑盒說明書步驟進行操作。取左肺下葉組織固定于4%多聚甲醛中，置于4℃冰箱過夜后進行組織脫水、包埋、切片，Masson染色進行病理組織學觀察。參照Szapiel等[12]報道的方法對肺纖維化程度進行評分:無纖維化為0分，纖維化面積<20%為1分，纖維化面積20%～50%為2分，纖維化面積≥50%為3分。

1.2.3免疫組織化學檢查：組織脫蠟、水化，3%過氧化氫孵育8 min消除內源性過氧化物酶活性，微波爐中火10 min修復抗原，滴加5% BSA封閉30 min，分別滴加TGF-β1(1∶200)、TNF-α(1∶400)和IFN-γ(1∶200)抗體，4℃冰箱過夜，滴加二抗37℃孵育30 min，滴加DAB顯色劑顯色，復染，乙醇脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡下觀察。

1.2.4蛋白質印跡法檢測：取150 mg肺組織，在液氮中不斷研磨組織，裂解液和廣譜蛋白酶抑制劑裂解組織，離心，提取組織蛋白，配置蛋白標準配置液和BCA工作液，按照說明書進行蛋白濃度測定，制備分離膠和濃縮膠，將聚合好的濃縮膠玻璃板放入電泳槽，加入樣品，打開電泳儀跑膠，跑膠結束后準備PVDF膜、濾紙及海綿立即進行轉膜，轉膜結束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中進行封閉，滴加一抗GAPDH(1∶200)、TGF-β1(1∶800)、TNF-α(1∶800)和IFN-γ(1∶400)，4℃冰箱過夜，加入二抗，洗膜，滴加發(fā)光液，凝膠掃描成像曝光成像。

2 結果

2.1Masson染色及肺纖維化評分比較 Masson染色結果顯示，Control組肺組織未出現病理改變，肺泡結構清晰，形態(tài)正常，未見膠原纖維沉積；BLM組肺組織出現明顯病理改變，肺泡正常結構消失，肺組織重建，可見大量藍色膠原纖維沉積，纖維化程度明顯；BLM+MgIG組和BLM+MTH組肺泡結構破壞和纖維組織增生程度較BLM組均有所減輕，藍色膠原纖維相較于BLM組也均有所減少，但BLM+MgIG組病變減輕程度較BLM+MTH組更明顯，見圖1。肺纖維化程度評分結果顯示，Control組、BLM組、BLM+MgIG組和BLM+MTH組分別為(0.02±0.001)、(2.94±0.03)、(1.62±0.06)和(1.85±0.05)分，4組總體比較差異有統計學意義(P<0.05)；Control組低于其他3組，BLM組高于BLM+MgIG組和BLM+MTH組，BLM+MgIG組低于BLM+MTH組，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 采用不同處理方式大鼠4組肺組織病理組織學檢查結果(Masson×200)

2.2血清SOD和MDA含量比較 Control組、BLM組、BLM+MgIG組和BLM+MTH組4組血清SOD和MDA含量總體比較差異有統計學意義(P<0.05)。Control組血清SOD高于其他3組，血清MDA低于其他3組；BLM組血清SOD低于BLM+MgIG組和BLM+MTH組，血清MDA高于BLM+MgIG組和BLM+MTH組；BLM+MgIG組血清SOD高于BLM+MTH組，血清MDA低于BLM+MTH組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 采用不同處理方式大鼠4組血清SOD和MDA含量比較

2.3免疫組織化學檢查結果比較 TGF-β1：Control組肺泡結構正常，未見或極少有棕黃色TGF-β1表達；BLM組肺組織破壞明顯，可見大量棕黃色TGF-β1表達；BLM+MgIG組和BLM+MTH組肺組織棕黃色表達區(qū)域較BLM組減少，見圖2。TNF-α：Control組未見或有少許TNF-α表達；BLM組TNF-α表達較Control組明顯增加；BLM+MgIG組和BLM+MTH組TNF-α棕黃色表達區(qū)域較BLM組減少，見圖3。IFN-γ：Control組可見大量IFN-γ棕黃色表達；BLM組肺組織破壞明顯，可見少許棕黃色IFN-γ表達；BLM+MgIG組和BLM+MTH組棕黃色表達區(qū)域較BLM組增加，見圖4。Control組、BLM組、BLM+MgIG組和BLM+MTH組4組肺組織TGF-β1、TNF-α和IFN-γ表達總體比較差異有統計學意義(P<0.05)。Control組肺組織TGF-β1和TNF-α表達低于其他3組，肺組織IFN-γ表達高于其他3組；BLM組肺組織TGF-β1和TNF-α表達高于BLM+MgIG組和BLM+ MTH組，肺組織IFN-γ表達低于BLM+MgIG組和BLM+MTH組；BLM+MgIG組肺組織TGF-β1和TNF-α表達低于BLM+MTH組，肺組織IFN-γ表達高于BLM+MTH組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 采用不同處理方式大鼠4組肺組織TGF-β1、TNF-α和IFN-γ表達平均積分光密度)

圖2 采用不同處理方式大鼠4組肺組織TGF-β1免疫組織化學檢查結果(免疫組織化學×400)

圖3 采用不同處理方式大鼠4組肺組織TNF-α免疫組織化學檢查結果(免疫組織化學×400)

圖4 采用不同處理方式大鼠4組肺組織IFN-γ免疫組織化學檢查結果(免疫組織化學×400)

2.4蛋白質印跡法檢測結果比較 大鼠肺組織TGF-β1和TNF-α蛋白Control組表達量較低，BLM組表達量升高，BLM+MgIG組和BLM+MTH組表達量低于BLM組；大鼠肺組織IFN-γ蛋白Control組表達量較高，BLM組表達量降低，BLM+MgIG組表達量較BLM組明顯增加，BLM+MTH組和BLM組表達量比較無明顯差異，見圖5。

圖5 采用不同處理方式大鼠4組肺組織TGF-β1、TNF-α和IFN-γ蛋白表達比較

3 討論

IPF是一種以肺泡上皮細胞損傷、炎性細胞浸潤、成纖維細胞增殖、細胞外基質異常積聚和肺組織重建異常為特征的致命性進展性肺部疾病[13]。氣管內注射BLM誘導的肺纖維化動物模型與人類IPF的進程最為相似，這也是目前應用最經典的實驗性肺纖維化動物模型[14]。本研究通過大鼠氣管內注射BLM構建肺纖維化模型，Masson染色結果顯示，Control組肺組織未出現病理改變，肺泡結構清晰，形態(tài)正常，未見膠原纖維沉積；BLM組肺組織出現明顯病理改變，肺泡正常結構消失，肺組織重建，可見大量藍色膠原纖維沉積，纖維化程度明顯，表明本研究模型構建是成功的。

雖然肺纖維化的發(fā)病機制現尚未完全明確，但越來越多的研究表明，氧化應激在IPF中起著重要作用[15-16]。分析其原因主要是由于氧化劑和抗氧化蛋白功能不平衡，氧化應激通過激活氧化還原敏感信號通路、改變免疫細胞功能和激活成纖維細胞，進而參與肺纖維化形成。正常的肺內穩(wěn)態(tài)需要細胞內和細胞外氧化劑和抗氧化劑之間的適當平衡。保護性抗氧化劑和抗氧化酶可保護肺免受氧化劑侵害[17]。SOD和MDA是反映機體抗氧化能力和細胞氧化劑對機體損傷的2個重要指標[18]。SOD是人體內重要的抗氧化金屬酶。MDA是膜脂過氧化最重要的產物之一，可間接反映細胞損傷的程度。楊軍[19]研究發(fā)現，在BLM誘導肺纖維化大鼠模型中，中藥黃芪可通過增加SOD活性，降低MDA含量，達到治療肺纖維化的作用。本研究結果顯示，Control組血清SOD高于其他3組，血清MDA低于其他3組；BLM組血清SOD低于BLM+MgIG組和BLM+MTH組，血清MDA高于BLM+MgIG組和BLM+MTH組；BLM+MgIG組血清SOD高于BLM+MTH組，血清MDA低于BLM+MTH組，差異有統計學意義。表明BLM誘導肺纖維化大鼠模型血清SOD含量明顯下降，血清MDA含量明顯增加，且給予藥物干預后血清SOD含量有所升高，MDA含量有所下降。進一步證明氧化應激參與了BLM致肺纖維化的形成，并提示MgIG可能通過減輕氧化應激緩解肺纖維化。

TGF-β1是肺纖維化進展過程中主要促纖維化細胞因子，誘導肺成纖維細胞向肌成纖維細胞分化，產生高水平膠原，導致肺彈性和功能的喪失[20]。黃坤等[21]研究發(fā)現，TGF-β1在BLM誘導的肺纖維化模型組中表達明顯增加，甘草酸二胺聯合骨髓間充質干細胞移植治療后TGF-β1表達降低，且肺纖維化得到一定程度的緩解。此外，TNF-α也是參與肺纖維化形成的重要細胞因子。張興和張煒[22]研究表明在肺間質纖維化模型中，TNF-α表達明顯升高，給予生地提取物干預后TNF-α表達有所下降。本研究結果顯示，Control組肺組織TGF-β1和TNF-α表達低于其他3組，BLM組肺組織TGF-β1和TNF-α表達高于BLM+MgIG組和BLM+MTH組，BLM+MgIG組肺組織TGF-β1和TNF-α表達低于BLM+MTH組，差異有統計學意義。說明BLM誘導的肺纖維化大鼠模型肺組織TGF-β1和TNF-α表達均升高，給予藥物干預后肺組織TGF-β1和TNF-α表達有所下降。IFN-γ是一種抗纖維化細胞因子，殷宗寶等[23]實驗發(fā)現，在肺纖維化大鼠模型中，大鼠肺組織IFN-γ染色較淡，表達水平顯著下降，甘草酸二銨干預后IFN-γ染色反應增強且表達水平較模型組有所增加。本研究結果顯示，Control組肺組織IFN-γ表達高于其他3組，BLM組肺組織IFN-γ表達低于BLM+MgIG組和BLM+MTH組，BLM+MgIG組肺組織IFN-γ表達高于BLM+MTH組，差異有統計學意義。說明BLM誘導的肺纖維化大鼠模型肺組織IFN-γ表達下降，經藥物干預后肺組織IFN-γ表達上調。

總之，MgIG能改善BLM誘導肺纖維化大鼠肺纖維化，機制可能與減輕氧化應激，抑制炎性因子表達，促進抗纖維化因子分泌有關。