疏風解毒膠囊經(jīng)miR-155/JAK1-STAT1信號通路發(fā)揮對甲型流感病毒H1N1肺炎模型小鼠的保護作用*

李振華， 張 華△， 陳建麗， 徐 超， 謝林森， 張 藝， 張 倩

（1鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，河南 鄭州 450007；2鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州 450007）

甲型流感病毒H1N1 肺炎是由單股RNA 病毒引起的急性呼吸道傳播疾病，可通過飛沫、氣溶膠、接觸傳染，傳染性強，感染后患者重癥轉歸不良的風險較高，部分患者惡化后造成呼吸窘迫或衰竭，危及生命［1］，及時有效的干預對于患者至關重要。以往研究主要以西藥治療為主，奧司他韋作為其中一種西藥，由于廣泛使用，患者體內往往產(chǎn)生了耐藥性，造成效果不佳［2］，而中藥藥效持久且副作用小，為甲型流感病毒H1N1 肺炎提供了新的治療方向。疏風解毒膠囊（Shufeng-Jiedu capsule，SFJDC）中有虎杖、連翹等多種中藥成分，對病原菌具有廣泛抑制作用［3-5］，能夠減輕感染導致的局部炎癥，增強組織抵抗力和修復能力［6］，但鮮有關于甲型流感病毒H1N1 肺炎的研究。微小RNA（microRNA，miR）-155 參與肺部損傷過程［7］，可通過調控 Janus 激酶（Janus kinase，JAK）-信號轉導及轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）通路介導炎癥反應，影響牙周炎發(fā)生［8］。本研究探討SFJDC對甲型流感病毒H1N1肺炎模型小鼠的影響，并初步探討其作用機制。

材料和方法

1 動物及病毒株

50 只 SPF 級雄性 BALB/c 小鼠，6～7 周齡，體重（20±2）g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006。在溫度（26±1）℃、濕度（55±5）%、12 h 光照12 h 黑暗環(huán)境中飼養(yǎng)。本實驗經(jīng)本院倫理委員會審核并通過。甲型流感病毒鼠肺適應株（A/FM/1/47-MA）由中國預防醫(yī)學科學院病毒研究所提供。

2 主要藥品及試劑

SFJDC 由天津藥物研究所有限公司提供，每粒0.52 g，由虎杖、連翹、板藍根、馬鞭草、敗醬草、柴胡、蘆根和甘草組成，各藥材均符合2015 年版《中國藥典》相關標準。miR-155 siRNA及miR-155和U6引物由上海生工生物有限公司合成；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；小鼠轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒，抗 JAK1、p-JAK1、STAT1 和 p-STAT1抗體，羊抗兔Ⅱ抗，BCA蛋白試劑盒（Abcam）；cDNA 第一條鏈合成試劑盒（上海佰易聚生物有限公司）；2× SYBR qPCR Mix（北京莊盟國際生物有限公司）；DAB 工作液（杭州浩克生物科技有限公司）。QuantStudio 3 實時熒光定量PCR 儀（ABI）；UVP Gel-Solo蛋白凝膠成像儀（Jenapharm）。

3 主要方法

3.1 分組及建模 小鼠按隨機數(shù)字法分為對照組、模型組、低劑量SFJDC 組、高劑量SFJDC 組和SFJDC+miR-155 siRNA 組，每組10 只。除對照組外，其余各組參考文獻［9］將小鼠用乙醚輕度麻醉，以15×LD50流感病毒液鼻滴感染小鼠，每只0.035 mL，對照組鼻滴等體積蒸餾水。從感染當天起，低、高劑量SFJDC 組分別灌胃0.1 和0.5 g/（kg·d）SFJDC［10］，SFJDC+miR-155 siRNA 組灌胃0.5 g/（kg·d）SFJDC并尾靜脈注射miR-155 siRNA，對照組和模型組灌胃等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)5 d。

3.2 肺指數(shù)檢測 立即處死小鼠，迅速解剖摘取肺，生理鹽水清洗干凈，吸干表面水分，稱重，參考文獻［11］檢測各組小鼠肺指數(shù)。肺指數(shù)=小鼠肺質量（mg）/體質量（g）。

3.3 HE 檢測肺組織病理情況 部分肺組織置于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)脫水、二甲苯透明后，石蠟包埋，切片機切片，切片厚度4 μm。切片經(jīng)染色，依次進入二甲苯和乙醇中脫蠟，蘇木精染色、1%鹽酸乙醇分化、伊紅復染，二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察肺組織情況。

3.4 ELISA 檢測肺組織中 TGF-β、IL-6 和 TNF-α 水平 部分肺組織添加蛋白裂解液，冰上勻漿并充分裂解20 min，11 180×g、4 ℃離心20 min，上清液為總蛋白。參考小鼠TGF-β、IL-6和TNF-α ELISA 試劑盒檢測肺組織中TGF-β、IL-6和TNF-α水平。

3.5 實時熒光定量PCR 檢測肺組織中miR-155 水平 部分肺組織手術剪在冰上剪碎、添加Trizol冰上研磨，提取總RNA，cDNA 第一條鏈合成試劑盒合成cDNA，實時熒光定量PCR 檢測肺組織中miR-155 水平。miR-155的上游引物序列為5'-CGGCGGTTAATGCTAATTGTGAT-3'，下游引物序列為5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6 的上游引物序列為5'-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3'，下游引物序列為5'-AAATATGGAACGCTTCACGA-3'。20 μL 反應體系：2 μL cDNA，10 μL 2×SYBR qPCR Mix，上、下游引物（均為 10 μmol/L）各 1 μL，6 μL ddH2O。反應條件：94 ℃ 20 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，40個循環(huán)。2-ΔΔCt法計算miR-155相對表達水平。

3.6 蛋白免疫印跡檢測肺組織中JAK1、p-JAK1、STAT1 和p-STAT1 蛋白水平 部分肺組織手術剪剪碎，添加蛋白裂解液冰上研磨并裂解，11 180×g、4 ℃離心20 min，上清為總蛋白，BCA 蛋白試劑盒檢測蛋白濃度，20 μg 上樣量經(jīng)凝膠電泳分離蛋白，硝酸纖維素膜280 mA轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，對應加入 JAK1、p-JAK1、STAT1、p-STAT1 和 GAPDH 抗體，4 ℃孵育過夜；加入對應Ⅱ抗，室溫孵育1 h。DAB 工作液避光顯色，蛋白凝膠成像儀拍照和灰度分析。

4 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 7 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。多組間比較行單因素方差分析，進一步兩兩比較行SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 SFJDC對肺指數(shù)的影響

與對照組相比，模型組肺指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，低、高劑量SFJDC 組肺指數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與SFJDC 低劑量組相比，SFJDC 高劑量組肺指數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與SFJDC 高劑量組相比，SFJDC+miR-155 siRNA 組肺指數(shù)顯著升高（P＜0.05），見圖1。

Figure 1. Comparison of lung index in the 5 groups. Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs low-dose SFJDC group；▲P＜0.05 vs high-dose SFJDC group.圖1 5組肺指數(shù)水平比較

2 SFJDC對肺組織的影響

對照組小鼠肺組織肺泡結構完整、清晰，間質間無充血、壞死、炎癥浸潤等病理現(xiàn)象；模型組小鼠肺結構消失，肺泡出現(xiàn)明顯斷裂、融合、滲出，肺間質出現(xiàn)明顯炎癥浸潤、水腫、充血現(xiàn)象；隨著SFJDC 劑量的升高，肺泡斷裂現(xiàn)象減少，肺泡融合及肺間質炎癥浸潤現(xiàn)象減輕，組織水腫緩解；在高劑量SFJDC 基礎上使用miR-155 siRNA 后，大鼠肺組織病變較SFJDC高劑量組加重，見圖2。

Figure 2. Morphological changes of lung tissues of the mice in the 5 groups. The scale bar=50 μm. Control group：the structure was complete without pathological phenomenon；model group：lungs showed destruction of the structure，and the arrow showed generous phenomenon of inflammatory infiltration and congestion；low-dose SFJDC group：alveolus pulmonis appeared，and arrow showed that phenomena of inflammatory infiltration and congestion were reduced；high-dose SFJDC group：the phenomenon of alveolar rupture was basically disappeared，and arrow showed there was almost no phenomenon of inflammatory infiltration and congestion，and the bronchial wall became significantly thinner than that in low-dose SFJDC group；SFJDC+miR-155 siRNA group：arrow showed that inflammatory infiltration and congestion increased compared with highdose SFJDC group.圖2 5組小鼠肺組織形態(tài)

3 SFJDC 對肺組織中 TGF-β、IL-6 和 TNF-α 水平的影響

與對照組相比，模型組肺組織中TGF-β、IL-6 和TNF-α 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，低、高劑量SFJDC 組肺組織中TGF-β、IL-6和TNF-α水平顯著降低（P＜0.05）；與低劑量SFJDC 組相比，高劑量SFJDC 組肺組織中 TGF-β、IL-6 和 TNF-α 水平顯著降低（P＜0.05）；與高劑量SFJDC 組相比，SFJDC+miR-155 siRNA 組肺組織中 TGF-β、IL-6 和 TNF-α 水平顯著升高（P＜0.05），見圖3。

4 SFJDC 對肺組織中 miR-155 及 JAK1、p-JAK1、STAT1和p-STAT1蛋白水平的影響

與對照相比，模型組肺組織中miR-155 水平顯著降低（P＜0.05），p-JAK1/JAK1 和 p-STAT1/STAT1比值顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，低、高劑量SFJDC 組肺組織中miR-155 水平顯著升高（P＜0.05），p-JAK1/JAK1 和 p-STAT1/STAT1 比值顯著降低（P＜0.05）；與低劑量SFJDC 組相比，高劑量SFJDC組肺組織中 miR-155 水平顯著升高（P＜0.05），p-JAK1/JAK1 和 p-STAT1/STAT1 比值顯著降低（P＜0.05）；與高劑量SFJDC 組相比，SFJDC+miR-155 siRNA 組肺組織中miR-155 水平顯著降低（P＜0.05），p-JAK1/JAK1 和 p-STAT1/STAT1 比值顯著升高（P＜0.05），見圖4。

討 論

甲型流感病毒H1N1 肺炎在2009 年全球爆發(fā)，患者表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、惡心、嘔吐等流感樣癥狀。中醫(yī)認為這屬于“寒毒疫”，邪毒侵入人體，正邪相爭而發(fā)熱，故發(fā)熱而口微渴或不渴，飲水少，后期高熱耗傷而出現(xiàn)口渴喜飲；吳又可《溫病條辨》指出：“世多言寒疫者，究其病狀，則憎寒狀熱，頭痛骨節(jié)煩疼，雖發(fā)熱而不甚渴……”［12］。為探索治療甲型流感病毒H1N1 肺炎的有效藥物，本研究利用H1N1 流感病毒建立該疾病的小鼠模型，顯示小鼠肺部肺泡出現(xiàn)明顯斷裂、融合、滲出，肺間質出現(xiàn)明顯炎癥浸潤、充血、水腫，這些病理改變導致肺部重量增加，導致肺指數(shù)升高，提示模型中小鼠肺組織出現(xiàn)明顯的病理損傷，模型建立成功。

Figure 3. The levels of TGF-β（A），IL-6（B）and TNF-α（C）in lung tissues of the mice in the 5 groups. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs low-dose SFJDC group；▲P＜0.05 vs high-dose SFJDC group.圖3 5組肺組織中TGF-β、IL-6和TNF-α水平比較

中醫(yī)在治療甲型流感病毒H1N1 肺炎中表現(xiàn)出獨特優(yōu)勢，中藥SFJDC 以虎杖和連翹為君藥，虎杖具有祛風、利濕、破淤、清肝涼血之功效，連翹可清熱解毒、散結、涼血清腫；諸藥配伍，板藍根清熱解毒、清血利咽，馬鞭草活血化瘀，敗醬草祛瘀止痛、除癰腫結熱，柴胡結表，蘆根清降肺胃、生津止渴；甘草為使，調和諸藥［13］。本研究檢測顯示，經(jīng) SFJDC 治療后，模型小鼠肺組織炎癥浸潤、充血、水腫現(xiàn)象減少，肺指數(shù)降低，提示SFJDC 能夠減輕肺組織損傷，實現(xiàn)對甲型流感病毒H1N1肺炎小鼠肺損傷的緩解，具體機制尚需進一步研究。

TGF-β、IL-6 和 TNF-α 與甲型 H1N1 流感病毒關系密切，甲型H1N1流感病毒侵入機體后募集多種免疫細胞，免疫細胞中單核巨噬細胞可產(chǎn)生TGF-β、IL-6 和TNF-α，逐步入侵肺部，刺激內皮細胞和白細胞釋放一系列炎癥因子，引起免疫損傷［14-15］。本研究結果亦顯示，模型組肺組織中炎癥因子TGF-β、IL-6 和TNF-α均處于高表達狀態(tài)，SFJDC能夠降低以上因子水平，起到抑炎作用。有研究觀察到miR-155 作為多功能miRNA，可參與天然免疫、特異性免疫過程，可調控小膠質 BV-2 細胞炎癥因子分泌［16］；JAK1-STAT1 通路是眾多細胞因子信號轉導中的共同途徑，參與細胞增殖、分化、凋亡、炎癥等多種過程，參與炎癥因子的傳導與調控［17］，其激活在甲型流感病毒FM1 誘導肺炎發(fā)生過程中發(fā)揮促進作用［18］。此外，miR-155 可調控下游靶標SOCS1 表達，導致JAK1-STAT1 通路磷酸化激活，進而使巨噬細極化、釋放炎癥因子，促進動脈粥樣硬化進展［19］。以上研究表明，miR-155/JAK1-STAT1 可是在甲型流感病毒FM1 誘導肺炎發(fā)生發(fā)展機制中發(fā)揮重要作用。本研究顯示，模型組肺組織中miR-155 低表達，JAK1-STAT1 通路處于激活狀態(tài)，提示miR-155/JAK1-STAT1 通路參與肺損傷炎癥過程，與上述研究一致。另添加SFJDC 后，隨著劑量的升高，小鼠肺組織中miR-155 水平逐漸升高，JAK1-STAT1 通路激活程度降低，提示SFJDC 可升高miR-155、抑制JAK1-STAT1通路，這可能是SFJDC 緩解甲型流感病毒H1N1肺炎小鼠體內炎癥發(fā)應的調控途徑。故本研究在高劑量SFJDC 基礎上進一步使用miR-155 siRNA 下調miR-155，結果顯示JAK1-STAT1通路激活程度升高，炎癥因子水平升高，SFJDC 對甲型流感病毒H1N1 肺炎小鼠的肺組織損傷的緩解作用減弱，表明SFJDC 通過升高miR-155，進而抑制JAK1-STAT1通路激活，降低炎癥反應，緩解甲型流感病毒H1N1肺炎。

Figure 4. The miR-155 level，and the JAK1，p-JAK1，STAT1 and p-STAT1 protein levels in lung tissues of the mice in the 5 groups. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs low-dose SFJDC group；▲P＜0.05 vs high-dose SFJDC group.圖4 5組肺組織中miR-155及JAK1、p-JAK1、STAT1和p-STAT1蛋白水平

綜上所述，SFJDC 可緩解甲型流感病毒H1N1 肺炎小鼠炎癥損傷，其機制與升高miR-155、抑制JAK1-STAT1通路有關。