劉學(xué)良,韓達(dá)斌,陳 鵬,年永琪,汪永明,王永晶,劉海青
(青海省藥品審評(píng)核查中心,青海 西寧 810007)
蒙藥清熱八味丸由石膏、人工牛黃、胡黃連、紅花等8 味藥材制成,有清熱解毒功效,主要用于熾熱、血熱、臟腑之熱、肺熱咳嗽、痰中帶血、肝火肋痛的治療。始載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊(cè)》[1],現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)《國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)》中,檢驗(yàn)項(xiàng)目有顯微鑒別、理化鑒別及膽酸的含量測(cè)定。為了更全面控制該制劑質(zhì)量,本研究中采用薄層色譜(TLC)法對(duì)方中人工牛黃、紅花進(jìn)行定性鑒別,同時(shí)采用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)方中胡黃連的有效成分胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ進(jìn)行含量測(cè)定?,F(xiàn)報(bào)道如下。
Waters 1525型高效液相色譜儀,包含Waters 2489型紫外檢測(cè)器、Empower 化學(xué)工作站(美國(guó)Waters 公司);AB204-S型、ME204E型、XS105DU型十萬(wàn)分之一電子天平(瑞士Mettler Toledo 公司);Lambda 35 型紫外 - 可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)PE 公司);硅膠H,G 薄層板(青島海洋化工有限公司)。
清熱八味丸(內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司,批號(hào)分別為 090424,090614,100217,100526,101022,101212,111214);胡黃連苷Ⅰ對(duì)照品(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心,批號(hào)為MUST - 11062102,含量98%);胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ?hào)為111596 - 201805,含量93.2%),膽酸對(duì)照品(批號(hào)為110775-201105,含量98.9%),豬去氧膽酸對(duì)照品(批號(hào)為110749-201316,含量99.7%),均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈、磷酸、甲醇為色譜純,其余試劑均為分析純,水為超純水。
2.1.1 人工牛黃[2-5]
取樣品適量,研細(xì),稱取粉末0.5 g,精密稱定,加乙醇10 mL,振搖15 min,離心,取上清液,作為供試品溶液。取豬去氧膽酸對(duì)照品、膽酸對(duì)照品各適量,分別加乙醇制成每1 mL 含2 種成分1 mg 的單一對(duì)照品溶液。按清熱八味丸處方和工藝制備缺人工牛黃的陰性樣品,并按供試品溶液方法制成陰性對(duì)照品溶液。按2020 年版《中國(guó)藥典(四部)》通則 0502 TLC 法,精密吸取上述溶液各5μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上,以乙酸乙酯 - 正己烷 - 甲醇 - 冰醋酸(8∶1.5∶0.25∶0.25,V/V/V/V)為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出,晾干,噴以10%磷鉬酸乙醇溶液,105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰,置日光燈下檢視。供試品溶液色譜中,在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn),且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖1。
圖1 人工牛黃薄層色譜圖Fig.1 TLC chromatogram of Bovis Calculus Artifatus
2.1.2 紅花[6-10]
取樣品適量,研細(xì),稱取粉末4 g,精密稱定,加80%丙酮溶液 20 mL,振搖 15 min,靜置 10 min 后,取上清液,作為供試品溶液。另取紅花對(duì)照藥材0.5 g,同供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液。按清熱八味丸處方和工藝制備缺紅花的陰性樣品,并按供試品溶液方法制成陰性對(duì)照品溶液。按2020 年版《中國(guó)藥典(四部)》通則0502 TLC 法,精密吸取上述溶液各10μL,分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上,以乙酸乙酯-水-甲酸-甲醇(7∶3∶2∶0.4,V/V/V/V)為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出,晾干,置日光燈下檢視。供試品溶液色譜中,在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上,顯相同顏色主斑點(diǎn),且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖2。
圖2 紅花薄層色譜圖Fig.2 TLC chromatogram of Carthami Flos
2.2.1 色譜條件
色譜柱:Hypersil - ODS 柱(250 mm × 4.6 mm,5μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-0.15%磷酸溶液(B),梯度洗脫(0~7 min 時(shí) 22%A→17%A,7~14 min 時(shí) 17%A,14~15 min 時(shí) 17%A→19%A,15~30 min 時(shí) 19%A→20%A,30~45 min時(shí)20%A→22%A);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):266 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10μL。
2.2.2 溶液制備
取胡黃連苷Ⅰ對(duì)照品10.86 mg、胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌?1.70 mg,精密稱定,分別置50 mL容量瓶中,加甲醇溶解、定容,搖勻,即得胡黃連苷Ⅰ,Ⅱ質(zhì)量濃度分別為0.212 9,0.218 0 mg/ mL 的單一對(duì)照品溶液。各取4 mL,置20 mL 容量瓶中,加甲醇定容,搖勻,即得胡黃連苷Ⅰ,Ⅱ質(zhì)量濃度分別為0.0425 8,0.0436 0 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。取樣品(批號(hào)100217)適量,研細(xì),取1 g,精密稱定,置錐形瓶中,精密加入甲醇50 mL,稱定質(zhì)量,超聲(功率250 W,頻率50 kHz)處理30 min,放冷,再稱定質(zhì)量,加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得供試品溶液。按清熱八味丸處方工藝制備缺胡黃連的陰性樣品,按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。
2.2.3 方法學(xué)考察
專屬性試驗(yàn):精密吸取2.2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各10μL,按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖。結(jié)果待測(cè)成分與樣品中其他成分分離良好,理論板數(shù)按胡黃連苷Ⅱ峰計(jì)應(yīng)不低于3 000,陰性對(duì)照品溶液在與對(duì)照品溶液相同保留時(shí)間處無(wú)干擾峰,表明專屬性良好。詳見(jiàn)圖3。
圖3 高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms
線性關(guān)系考察:分別精密吸取2.2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1,2,4,8,12,20 μL,按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積。以待測(cè)成分進(jìn)樣量(X,μg)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程,胡黃連苷Ⅰ為Y1= 1 738 693X1+ 9 175(r= 0.999 8),胡黃連苷Ⅱ?yàn)閅2=1 286 879X2+1 344(r=0.999 7)。結(jié)果表明,胡黃連苷Ⅰ和Ⅱ進(jìn)樣量分別在0.042 58~0.851 6μg和0.043 60~0.872 0 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。
精密度試驗(yàn):精密吸取2.2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10μL,按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次,記錄峰面積。結(jié)果胡黃連苷Ⅰ和Ⅱ峰面積的RSD分別為0.65%和0.52%(n=6),表明儀器精密度良好。
穩(wěn)定性試驗(yàn):取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液10μL,室溫下按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件分別于第0,3,6,12,18,24 h進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積。結(jié)果胡黃連苷Ⅰ和Ⅱ峰面積的RSD分別為1.22%和1.06%(n= 6),表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
重復(fù)性試驗(yàn):取同一批樣品(批號(hào)100217)適量,精密稱定,共5 份,按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果胡黃連苷Ⅰ和Ⅱ的平均含量分別為1.049 0 mg/g和1.722 4 mg/g,RSD分別為1.12%和0.86%(n=5),表明該方法重復(fù)性良好。
加樣回收試驗(yàn):稱取樣品(批號(hào)100217)適量,研細(xì),精密稱定,共6 份,分別精密加入2.2.2 項(xiàng)下胡黃連苷Ⅰ和Ⅱ單一對(duì)照品溶液,各適量,按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.1 Results of the recovery test(n=6)
2.2.4 樣品含量測(cè)定
取7 批樣品各適量,分別按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,平行測(cè)定3次,記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.2 Results of content determination of picroside Ⅰand picroside Ⅱ in samples(n=3)
清熱八味丸方中,人工牛黃可清熱解毒、化痰定驚[18],紅花可活血通經(jīng)、散瘀止痛[19],胡黃連可清熱燥濕、瀉火解毒、通經(jīng)利尿,且胡黃連中胡黃連苷Ⅰ和Ⅱ是其主要活性成分,具有較好的清熱、殺菌及利尿作用[20],與清熱八味丸清熱解毒功效一致。本研究中基于預(yù)試驗(yàn)中對(duì)提取溶劑、提取方法、提取時(shí)間等因素進(jìn)行的考察,建立了清熱八味丸方中人工牛黃、紅花的TLC鑒別方法,胡黃連中胡黃連苷Ⅰ和Ⅱ的HPLC 定量檢測(cè)方法,可為今后研究清熱八味丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。
含量測(cè)定預(yù)試驗(yàn)中,參考相關(guān)文獻(xiàn),同時(shí)結(jié)合胡黃連苷Ⅰ和Ⅱ?qū)φ掌啡芤旱淖贤夤庾V掃描結(jié)果,選擇紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為266 nm。同時(shí)分別對(duì)甲醇- 0.10%冰醋酸溶液、甲醇-0.15%磷酸溶液、乙腈-0.15%磷酸溶液3種流動(dòng)相進(jìn)行考察,結(jié)果以乙腈-0.15%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)基線較平穩(wěn),對(duì)待測(cè)組分峰無(wú)干擾,故選擇。
清熱八味丸方中八味藥材處方量相同,均為藥材原粉入藥制成水丸,胡黃連占處方總量的12.5%,2020 年版《中國(guó)藥典(一部)》中規(guī)定,胡黃連中胡黃連苷Ⅰ與胡黃連苷Ⅱ的總量不得少于9.0%[21],原粉入藥轉(zhuǎn)移率按90%計(jì)算,得樣品中兩者總量的理論值下限為10.125 0 mg/ g,而本研究中7 批樣品的含量為2.718 2~3.842 2 mg/g,明顯低于理論值下限。分析原因,清熱八味丸現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未對(duì)胡黃連進(jìn)行控制,企業(yè)在生產(chǎn)過(guò)程中可能存在以次充好或投料不足的情況。
清熱八味丸與清熱八味散、清熱八味膠囊均收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊(cè)》,藥味相同,處方量略有差異,但清熱八味系列3種制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制項(xiàng)目差異較大,部分項(xiàng)目制定的控制指標(biāo)不盡合理。2020 年版《中國(guó)藥典》中對(duì)胡黃連苷Ⅰ和Ⅱ的含量進(jìn)行控制,然而,清熱八味膠囊現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中僅以肉桂酸的含量作為質(zhì)量控制指標(biāo),不合理,也缺少代表性。后續(xù)制訂的控制指標(biāo)要考慮與其功能主治緊密結(jié)合,可考慮同時(shí)對(duì)3 種劑型的清熱八味制劑進(jìn)行研究,盡量建立較統(tǒng)一、完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。