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    Apelin-36對魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡及線粒體功能的影響*

    2022-08-19 06:55:26竇姍姍高麗穎林馨怡程葆華
    關(guān)鍵詞:魚藤酮培養(yǎng)箱比率

    竇姍姍 高麗穎 林馨怡 孟 堯 董 康 程葆華

    (濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,濟(jì)寧 272067)

    帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種常見的僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的神經(jīng)退行性疾病[1],其主要病理特征是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生退行性變,并伴有路易氏小體(Lewy body,LB)出現(xiàn)。LB主要是由于α-突觸核蛋白(α-synuclein)的異常積累形成的[2]。PD的發(fā)病機(jī)制還不清楚,而線粒體功能障礙與PD發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[3-4]。

    魚藤酮(rotenone)是一種細(xì)胞毒性物質(zhì),可選擇性地抑制細(xì)胞呼吸鏈 NADH 脫氫酶(即復(fù)合物I,complex I)的活性,使NADH氧化為NAD的過程受阻,減少ATP生成,阻礙質(zhì)子傳遞,細(xì)胞中活性氧的含量進(jìn)而增加,導(dǎo)致自由基過量累積,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5-6]。

    Apelin最初是從牛胃組織中分離出來的。Apelin-13、apelin-17和apelin-36是apelin前體肽經(jīng)水解生成的生物活性形式。越來越多的證據(jù)表明,apelin可能在PD模型中具有神經(jīng)保護(hù)作用[7-8]。

    本實驗用魚藤酮刺激SH-SY5Y細(xì)胞,制作PD體外模型,然后用apelin-36干預(yù),研究apelin-36的神經(jīng)保護(hù)作用及對線粒體功能的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1試劑 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(SH-SY5Y細(xì)胞)購自美國菌種保藏中心(ATCC);DMEM培養(yǎng)液(美國Hyclone公司);魚藤酮(美國Sigma公司);Apelin-36(美國Phoenix Pharmaceuticals公司);CCK-8(日本Dojindo公司);Hoechst 33342檢測試劑盒(日本Dojindo公司);線粒體復(fù)合物 I(complex I)ELISA 試劑盒(酶免),ADP/ATP比率檢測試劑盒(日本Dojindo公司);RIPA裂解液(碧云天公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(天根生物公司);超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(萬類生物公司);α-synuclein抗體、bcl-2抗體、Bax抗體(美國Cell Signaling Technology公司);β-actin抗體(北京中杉金橋有限公司)。

    1.1.2儀器 微量移液器(德國 Eppendorf公司);CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);臺式低溫高速離心機(jī)(美國Beckman公司);超聲波細(xì)胞粉碎儀(江蘇波場智能科技股份有限公司);普通光學(xué)顯微鏡、倒置生物顯微鏡(日本Olympus公司);酶標(biāo)儀、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司);激光共聚焦掃描顯微鏡(SP8)(德國 Leica公司)。

    1.2 方法

    1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中,內(nèi)含10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 U/ml)。將SH-SY5Y細(xì)胞接種于96、12或6孔板在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞生長至約90%后,后續(xù)根據(jù)需要加入魚藤酮和apelin-36。

    1.2.2藥物處理及分組 取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞,以5×104/孔的密度接種于96、12或6孔板中,隨機(jī)分成4組:對照組、apelin-36組、魚藤酮組、apelin-36+魚藤酮組,置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞長至約90%,apelin-36組、apelin-36+魚藤酮組先給予apelin-36(10-6M)預(yù)處理,其他兩組加入相同劑量的PBS,魚藤酮組、apelin-36+魚藤酮組2h后給予魚藤酮(500 μM)處理,其他兩組加入相同劑量PBS,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h,然后進(jìn)行后續(xù)實驗。

    1.2.3細(xì)胞活力測定 用CCK-8法測定細(xì)胞活力。首先將SH-SY5Y細(xì)胞以5×104/孔的密度接種在96孔培養(yǎng)板中,細(xì)胞長至約90%,按上述方法進(jìn)行藥物處理。繼續(xù)培養(yǎng)約22h后,加入CCK-8溶液(10μl/孔),避光繼續(xù)孵育2h。最后在酶標(biāo)儀450nm處測量吸光度值。每組設(shè)6個復(fù)孔,實驗平行重復(fù)3次。

    1.2.4細(xì)胞凋亡檢測 將SH-SY5Y細(xì)胞以5×104/孔的密度接種于12孔板的蓋玻片上,細(xì)胞長至約90%,后按上述方法藥物處理。繼續(xù)培養(yǎng)約22h后,用PBS沖洗細(xì)胞,用4%多聚甲醛固定20min,然后用PBS清洗3次。隨后,加入5mg/ml的Hoechst 33342,避光在室溫下放置15min,再用PBS沖洗兩次。染色細(xì)胞在倒置熒光顯微鏡下成像。每組選擇3張照片,計數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)。

    1.2.5線粒體復(fù)合物-I(complex I)檢測 SH-SY5Y細(xì)胞以5×104/孔的密度接種在6孔培養(yǎng)板中。細(xì)胞長至約90%,然后按上述方法進(jìn)行藥物處理。繼續(xù)培養(yǎng)約22h后,去除上清液,按照人Complex I ELISA試劑盒的說明進(jìn)行操作。

    1.2.6ADP/ATP比率檢測 SH-SY5Y細(xì)胞以5×104/孔的密度接種在白色96孔培養(yǎng)板中。細(xì)胞長至約90%,后按上述方法藥物處理。繼續(xù)培養(yǎng)約22h后,按照ADP/ATP比率檢測試劑盒說明操作。

    1.2.7相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 Western blotting用于檢測Bax、bcl-2、α-synuclein的表達(dá),β-actin作為對照。方法如下:按上述方法處理細(xì)胞,然后將SH-SY5Y細(xì)胞中提取的等量蛋白質(zhì)(30μg)加載到10% SDS-PAGE上,隨后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下,用含5%無脂奶粉的TBST(含1%吐溫20的TBS緩沖液)封閉膜1h,然后在4℃與一抗孵育過夜。然后用TBST清膜3次,在室溫下與二抗(1:5000)孵育1h。最后加入ECL溶液,暗室內(nèi)曝光顯影。實驗平行重復(fù)3次,用ImageJ軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 Apelin-36對魚藤酮處理的SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

    魚藤酮(500μM)降低了SH-SY5Y細(xì)胞存活率,而apelin-36(10-6M)預(yù)處理減輕了魚藤酮的神經(jīng)毒性并提高細(xì)胞活力。表明apelin-36對魚藤酮誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞存在一定的保護(hù)作用。見圖1。

    注:***P<0.001 vs.對照組;###P<0.001 vs.魚藤酮組

    2.2 Apelin-36對魚藤酮處理的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

    Hoechst 33342染色結(jié)果(圖2A)顯示,與魚藤酮組相比,apelin-36減輕了魚藤酮引起的細(xì)胞凋亡,并顯著降低了細(xì)胞凋亡率(圖2B)。

    注:***P<0.001 vs.對照組;###P<0.001 vs.魚藤酮組。

    2.3 Apelin-36對魚藤酮誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞中bcl-2、Bax和α-synuclein表達(dá)的影響

    與對照組相比較,魚藤酮組bcl-2的表達(dá)顯著降低,Bax的表達(dá)顯著增加;而apelin-36+魚藤酮組與魚藤酮組相比,apelin-36則明顯上調(diào)了bcl-2的表達(dá),減少了Bax的表達(dá)(圖3A)。魚藤酮組bcl-2/Bax的比值與對照組相比明顯降低,而apelin-36+魚藤酮組與魚藤酮組相比,bcl-2/Bax的比值明顯升高,說明apelin-36減輕了魚藤酮造成的細(xì)胞凋亡(圖3B)。與對照組相比,魚藤酮組α-synuclein的表達(dá)顯著增加,而apelin-36+魚藤酮組與魚藤酮組相比,apelin-36明顯減少了α-synuclein的表達(dá)(圖3C、3D)。

    注:**P<0.01 vs.對照組;#P<0.05 vs.魚藤酮組;##P<0.01 vs.魚藤酮組

    2.4 Apelin-36對魚藤酮誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞中complex I和ADP/ATP的影響

    與對照組相比,魚藤酮組complex I的表達(dá)下調(diào),ADP/ATP比率顯著上調(diào);而與魚藤酮組相比,apelin-36和魚藤酮共處理組逆轉(zhuǎn)了這種現(xiàn)象。見圖4。

    注:***P<0.001 vs對照組;###P<0.001 vs魚藤酮組;##P<0.01 vs 魚藤酮組

    3 討論

    線粒體是有氧呼吸發(fā)生的主要場所,除了為細(xì)胞提供能量外,線粒體還參與了細(xì)胞信息傳遞、細(xì)胞分化、和細(xì)胞凋亡等過程,而且擁有調(diào)控細(xì)胞生長和細(xì)胞周期的能力[9]。研究顯示錯誤折疊的α-synulein的過度累積導(dǎo)致了神經(jīng)退行性變,而線粒體功能障礙參與了錯誤折疊的α-synulein累積這一過程[10-11]。

    魚藤酮是一種可直接透過細(xì)胞膜和血腦屏障的細(xì)胞毒性物質(zhì)。線粒體complex I可被魚藤酮選擇性地阻斷,從而使NADH的氧化過程受阻,ATP生成減少,細(xì)胞中活性氧族增加,進(jìn)而自由基增加,進(jìn)一步導(dǎo)致氧化應(yīng)激[12],最終引起細(xì)胞凋亡。因此魚藤酮可導(dǎo)致細(xì)胞線粒體功能障礙,引起細(xì)胞凋亡。在本實驗中,與對照組相比,魚藤酮組α-synulein表達(dá)明顯升高,bcl-2/Bax比值明顯降低,細(xì)胞活力明顯降低,細(xì)胞凋亡顯著增多。Bcl-2家族蛋白是典型的凋亡相關(guān)蛋白,可操控線粒體的外膜通透性。促凋亡蛋白Bax 可與抗凋亡蛋白bcl-2結(jié)合形成調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的異二聚體,當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時,bcl-2/Bax比率降低[13]。與魚藤酮組相比,apelin-36和魚藤酮共處理組中α-synulein的表達(dá)明顯降低,說明apelin-36預(yù)處理可減少錯誤折疊的α-synulein累積;同時,apelin-36和魚藤酮共處理組中bcl-2/Bax比率明顯升高,細(xì)胞活力顯著升高,細(xì)胞凋亡則明顯減少,說明apelin-36預(yù)處理可減少細(xì)胞凋亡,因此apelin-36可減輕魚藤酮對SH-SY5Y細(xì)胞的神經(jīng)毒性作用,對神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用。

    魚藤酮通過阻斷complex I造成了ATP生成減少,而ATP的生成減少降低了線粒體膜電位(ΔΨm),導(dǎo)致線粒體膜的通透性改變,引起了線粒體功能紊亂[14-15]。本研究首次在魚藤酮PD體外模型中通過檢測線粒體complex I的表達(dá)和ADP/ATP的比率,來討論apelin-36是否可以減輕魚藤酮造成的線粒體功能紊亂。與對照組相比,魚藤酮組complex I的表達(dá)明顯降低,而ADP/ATP的比率顯著升高,這說明魚藤酮造成了線粒體功能紊亂。與魚藤酮組相比,apelin-36和魚藤酮共處理組complex I的表達(dá)明顯升高,而ADP/ATP的比率顯著降低,說明apelin-36可以減輕魚藤酮造成的線粒體功能紊亂。

    綜上所述,apelin-36可以減輕魚藤酮造成的線粒體功能紊亂,減少錯誤折疊的α-synulein累積,提高細(xì)胞活力,減少細(xì)胞凋亡,起到神經(jīng)保護(hù)作用。而apelin-36通過何種信號傳導(dǎo)途徑減輕魚藤酮造成的線粒體功能紊亂還不清楚,值得進(jìn)一步研究,為apelin成為治療PD的潛在臨床藥物提供新的證據(jù)。

    利益沖突:所有作者均申明不存在利益沖突。

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