UPLC-ESI-Q-TOF MS結(jié)合裂解規(guī)律分析姜科植物中二苯基庚烷類成分

胡雪雨，王彥志，2*，宋志敏，劉煜飛，劉雙晶，馮衛(wèi)生*

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046）

二苯基庚烷是一類具有1，7-二取代苯基并以庚烷骨架為母體結(jié)構(gòu)的化合物，可分為線性二苯基庚烷類和環(huán)狀二苯基庚烷類化合物［1］。其主要藥理活性有抗氧化、抗炎、抗病毒、細(xì)胞毒性、抗菌等［2-8］，主要存在于姜科植物（如生姜、高良姜、草豆蔻、草果、益智仁）中，是大多數(shù)姜科植物的主要活性成分［9-11］。姜皮，別名生姜衣，為姜科植物姜（Zingiber officinaleRosc.）的干燥根莖外皮［12］，在秋季挖取姜的根莖后洗凈并刮取外皮曬干即得，現(xiàn)行中國(guó)藥典尚未收載，但部分地方中藥飲片有收載［13］。姜皮味辛性涼，歸于脾、肺經(jīng)，可起到發(fā)汗解表和行水消腫等作用［1］。草果，味辛性溫、無(wú)毒，為姜科豆蔻屬植物草果（Amomum tsao-ko）的干燥成熟果實(shí)［14］，具有燥濕健脾、祛痰截瘧之功效，主治痰飲胸滿、心腹疼痛、脾虛泄瀉、瘧疾等證［15］。益智仁是姜科山姜屬植物益智（Alpinia oxyphyllaMiq.）的干燥成熟果實(shí)［16］，是“四大南藥”之一［17］，性溫，歸脾、腎經(jīng)，可暖腎固精縮尿、溫脾止瀉攝唾［18］。目前，關(guān)于二苯基庚烷類化合物的研究多集中于姜和高良姜［19-20］，由于缺少標(biāo)準(zhǔn)品，只能依據(jù)質(zhì)譜推測(cè)的化合物結(jié)構(gòu)，推斷此類成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律，故缺乏足夠的準(zhǔn)確性。

本研究采用具有高分辨率和高準(zhǔn)確性的電噴霧-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（ESI-Q-TOF MS），對(duì)11 個(gè)不同類型二苯基庚烷類化合物標(biāo)準(zhǔn)品的電噴霧質(zhì)譜碎片離子進(jìn)行全面解析，推測(cè)可能的裂解途徑，總結(jié)二苯基庚烷類化合物的裂解規(guī)律，完善了此類化合物的質(zhì)譜鑒定方法。并根據(jù)裂解途徑，采用超高效液相色譜-電噴霧-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-ESI-Q-TOF MS）對(duì)姜科植物來(lái)源中藥姜皮、草果、益智仁中的二苯基庚烷類成分進(jìn)行鑒定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器

UPLC-Triple TOF 6600 型超高效液相色譜-電噴霧-飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX 公司）；BSA224S 型電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；5424R 型低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.2 材料與試劑

（3R，5S）3，5-二羥基-1-（4-羥基-3-甲氧基苯基）-7-（3，4-二羥基苯基）庚烷（標(biāo)準(zhǔn)品1）、（3R，5R）3-乙酰氧基-5-羥基-1-（4-羥基-3-甲氧基苯基）-7-（3，4-二羥基苯基）庚烷（標(biāo)準(zhǔn)品2）、（3R，5S）3，5-二羥基-1-（4-羥基-3-甲氧基苯基）-7-（4-羥基-3-甲氧基苯基）庚烷（標(biāo)準(zhǔn)品3）、（3R，5R）3-乙酰氧基-5-羥基-1-（4-羥基-3，5-二甲氧基苯基）-7-（4-羥基-3-甲氧基苯基）庚烷（標(biāo)準(zhǔn)品4）、3，5-二乙酰氧基-1，7-雙（3，4-二羥基苯基）庚烷（標(biāo)準(zhǔn)品5）、3，5-二羥基-1，7-雙（4-羥基-3，5-二甲氧基苯基）庚烷（標(biāo)準(zhǔn)品6）、（3R）3-羥基-1，7-雙（3，4-二羥基苯基）庚烷（標(biāo)準(zhǔn)品7）、1，7-雙（4-羥基-3-甲氧基苯基）-5-甲氧基-3-庚酮（標(biāo)準(zhǔn)品8）、（1S，5S，3R）1，5-環(huán)氧-3-羥基-1-（4，5-二羥基-3-甲氧基苯基）-7-（4-羥基-3-甲氧基苯基）庚烷（標(biāo)準(zhǔn)品9）、（1S，5S，3S）1，5-環(huán)氧-3-羥基-1-（4，5-二羥基-3-甲氧基苯基）-7-（4，3-二羥基苯基）庚烷（標(biāo)準(zhǔn)品10）、（1S，5S，3R）1，5-環(huán)氧-3-羥基-1-（4-羥基-3，5-二甲氧基苯基）-7-（4-羥基-3-甲氧基苯基）庚烷（標(biāo)準(zhǔn)品11）（純度＞95%）。11 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的4 種二苯基庚烷結(jié)構(gòu)類型示于圖1，各化合物的結(jié)構(gòu)信息示于表1。甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher Scientific公司）。實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水（中國(guó)屈臣氏公司）。

表1 11種二苯基庚烷的化學(xué)結(jié)構(gòu)Table 1 Chemical structures of diarylheptanoids

圖1 4種二苯基庚烷的結(jié)構(gòu)骨架類型Fig.1 Structural skeleton types of 4 diarylheptanoids skeleton R1-R8 were shown in Table 1

姜皮、草果購(gòu)于云南省曲靖市紅河縣，益智仁購(gòu)自海南省瓊中市，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)陳隨清教授鑒定分別為姜科植物姜Zingiber officinaleRosc. 的根莖外皮，以及姜科植物草果Amomum tsaokoCrevost et Lemarie 和益智Alpinia oxyphyllaMiq. 的干燥成熟果實(shí)。

1.3 色譜分析條件

色譜柱：Phenomenex C18（100 mm×2.1 mm，1.7μm），柱溫：40 ℃，流速：0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量：2 μL，流動(dòng)相：A 為0.1%甲酸水溶液，B 為乙腈。姜皮成分的洗脫梯度：0～2.0 min，5% B；2.0～4.0 min，5%～15%B；4.0～24 min，15%～70%B；24～25 min，70%～90%B；25～27 min，90%B；27～28.1 min，90%～5% B；28.1～30 min，5% B。草果和益智仁成分的洗脫梯度：0～2.0 min，5% B；2.0～4.0 min，5%～40% B；4.0～23 min，40%～90% B；23～27 min，90% B；27～28 min，90%～5%B；28～30 min，5%B。

1.4 質(zhì)譜分析條件

ESI 電離源，正離子掃描，噴霧氣：310 264 Pa（45 psi），輔助加熱氣：344 738 Pa（50 psi），氣簾氣：241 316 Pa（35 psi），去簇電壓：80 V，源溫度：550 ℃，一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍：m/z100～1 000，二級(jí)質(zhì)譜掃描范圍：m/z50～1 000，碰撞電壓：（40±20）V。

標(biāo)準(zhǔn)品采用針泵注射獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)，注射泵進(jìn)樣速度：10μL/min。

1.5 樣品處理

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)品制備 分別精密稱取各標(biāo)準(zhǔn)品1 mg于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，過(guò)0.22μm微孔濾膜，備用。

1.5.2 供試品制備 姜皮用10 倍量50%乙醇加熱回流提取2 次，每次2 h，濾除藥渣后將提取液濃縮干燥得浸膏。用適量50%甲醇溶解，過(guò)0.22μm 微孔濾膜，離心（12 000 r/min，15 min），取上清液備用。草果和益智仁分別用10倍量75%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h，濾除藥渣后將提取液濃縮，再用乙酸乙酯萃取，萃取液濃縮干燥得浸膏，用適量70%甲醇水溶液溶解，過(guò)0.22μm 微孔濾膜，離心（12 000 r/min，15 min），取上清液備用。

實(shí)驗(yàn)前，分別使用對(duì)應(yīng)的校正液對(duì)正離子模式進(jìn)行校正。使用進(jìn)樣針?lè)謩e吸取約200μL 標(biāo)準(zhǔn)溶液，在正離子模式下進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 正離子模式下二苯基庚烷類化合物的裂解規(guī)律

在正離子模式下，本實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虻玫礁骰衔锴逦亩?jí)質(zhì)譜圖，及其質(zhì)譜信息（表2）。各標(biāo)準(zhǔn)品的精確質(zhì)荷比與理論質(zhì)荷比相吻合，質(zhì)譜碎片信息全面、穩(wěn)定。

表2 11個(gè)二苯基庚烷的質(zhì)譜信息Table 2 Mass spectrometric informations of diarylheptanoids

2.1.1 Ⅰ類二苯基庚烷類化合物的裂解規(guī)律 根據(jù)Ⅰ類二苯基庚烷類化合物標(biāo)準(zhǔn)品的碎片特征綜合推斷，此類化合物主要有兩條裂解途徑。

圖2A 為標(biāo)準(zhǔn)品4的二級(jí)質(zhì)譜圖，由圖推測(cè)，化合物首先丟失碳鏈上的取代基—OH、—OCOCH3產(chǎn)生碎片m/z371，一條裂解途徑是C7位上的苯環(huán)及其取代基丟失，產(chǎn)生碎片m/z247，然后從C7到C2依次丟失1 個(gè)C，產(chǎn)生碎片m/z233、m/z221、m/z207，以及主要特征碎片m/z193、m/z167。另一條裂解途徑是C1位上的苯環(huán)及其取代基丟失，產(chǎn)生碎片m/z217，然后丟失CH2，產(chǎn)生碎片m/z203，隨后分別丟失C2H4、CH2，依次產(chǎn)生碎片m/z175、m/z161；m/z203還可丟失C2H2產(chǎn)生碎片m/z177，碎片m/z177丟失1 個(gè)CH2或C3H4，分別產(chǎn)生碎片m/z163 和主要特征碎片m/z137，碎片m/z163 脫水，產(chǎn)生碎片m/z145，隨后丟失1 個(gè)CH2，產(chǎn)生碎片m/z131。標(biāo)準(zhǔn)品4 可能的裂解途徑見圖3。通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品1、2、3、5、6的二級(jí)碎片離子進(jìn)行全面解析，推測(cè)其裂解途徑與標(biāo)準(zhǔn)品4基本一致。

圖2 二苯基庚烷標(biāo)準(zhǔn)品（4、7、8、10）的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 ESI-MS/MS spectra of diarylheptanoid standards（4，7，8，10）A. standard 4；B. standard 7；C. standard 8；D. standard 10

2.1.2 Ⅱ類二苯基庚烷類化合物的裂解規(guī)律 Ⅱ類二苯基庚烷類化合物的裂解途徑與Ⅰ類相似，差別在于，碳鏈在裂解過(guò)程中只出現(xiàn)1 個(gè)雙鍵(2 個(gè)苯環(huán)都丟失的情況除外)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品7 的二級(jí)質(zhì)譜圖(圖2B)推測(cè)，在正離子模式下，化合物首先丟失碳鏈上的取代基—OH，產(chǎn)生碎片m/z315，然后丟失C6H6O2產(chǎn)生碎片m/z205，進(jìn)一步丟失C3H6產(chǎn)生碎片m/z163，進(jìn)而丟失CH2產(chǎn)生碎片m/z149，碎片m/z149 丟失C2H2形成主要特征碎片m/z123，或者脫水形成碎片m/z131，碎片m/z163還可脫水形成碎片m/z145，然后丟失CH2形成碎片m/z131。其可能的裂解途徑見圖4。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品7可能的裂解途徑Fig.4 Proposed fragmentation pathways of standard 7

2.1.3 Ⅲ類二苯基庚烷類化合物的裂解規(guī)律 通過(guò)對(duì)Ⅲ類標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，推測(cè)該類化合物主要有兩條裂解途徑。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品8的二級(jí)質(zhì)譜圖（圖2C）推測(cè)，一條裂解途徑是C3—C4鍵斷裂產(chǎn)生碎片m/z179，進(jìn)一步丟失O，產(chǎn)生碎片m/z163，隨后丟失C2H2，產(chǎn)生主要特征碎片m/z137。另一條途徑是C2—C3鍵斷裂，產(chǎn)生碎片m/z207，進(jìn)一步丟失CH2O產(chǎn)生碎片m/z177，然后丟失C3H4，產(chǎn)生主要特征碎片m/z137，碎片m/z177還可丟失CH4O產(chǎn)生碎片m/z145，進(jìn)一步丟失CH2產(chǎn)生碎片m/z131。其可能的裂解途徑見圖5。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)品8可能的裂解途徑Fig.5 Proposed fragmentation pathways of standard 8

2.1.4 Ⅳ類二苯基庚烷類化合物的裂解規(guī)律 不同于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類線性二苯基庚烷，Ⅳ類二苯基庚烷是環(huán)狀二苯基庚烷。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品10的二級(jí)質(zhì)譜圖（圖2D），推測(cè)該類化合物有兩條裂解途徑，一條途徑是C5—C6鍵斷裂，產(chǎn)生碎片m/z237，再丟失CH2產(chǎn)生碎片m/z223，進(jìn)一步丟失C2H4O產(chǎn)生主要特征碎片m/z179，碎片m/z179分別丟失C2H2、CH4O，產(chǎn)生主要特征碎片m/z153和m/z147，其中m/z147可丟失CO產(chǎn)生碎片m/z119。另一條途徑是含氧環(huán)斷裂產(chǎn)生碎片m/z165，然后丟失C2H2O產(chǎn)生主要特征碎片m/z123。通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品9、11的二級(jí)碎片離子進(jìn)行綜合分析，推測(cè)其裂解途徑與標(biāo)準(zhǔn)品10基本一致。標(biāo)準(zhǔn)品10可能的裂解途徑見圖6。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)品10可能的裂解途徑Fig.6 Proposed fragmentation pathways of standard 10

2.2 3種姜科植物中二苯基庚烷類化合物的鑒定

利用UPLC-ESI-Q-TOF MS 獲得姜皮、草果、益智仁的質(zhì)譜信息，結(jié)合裂解規(guī)律，分別鑒定出14、11、10個(gè)二苯基庚烷類化合物（見表3），其詳細(xì)鑒定過(guò)程以化合物9、11為例進(jìn)行闡述。

表3 二苯基庚烷的鑒定結(jié)果Table 3 Identification results of diarylheptanoids

（續(xù)表3）

化合物9的［M+H］+為m/z405.191 1，元素組成分析顯示其分子式為C22H28O7。其二級(jí)質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品9相似，推測(cè)為Ⅳ類二苯基庚烷類化合物，特征碎片離子m/z193.086 0、m/z167.070 2與標(biāo)準(zhǔn)品9的m/z179.071 0、m/z153.054 9相比分別增加14.015 0、14.015 3，結(jié)合裂解規(guī)律以及文獻(xiàn)［21］推測(cè)化合物9為1，5-環(huán)氧-3-羥基-1-（4-羥基-3，5-二甲氧基苯基）-7-（4-羥基-3-甲氧基苯基）庚烷。

化合物11 的［M+H］+為m/z435.201 2，分子式為C23H30O8。其二級(jí)質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品4 相似，推測(cè)為Ⅰ類二苯基庚烷類化合物，特征碎片離子m/z179.069 8、m/z153.054 5 與標(biāo)準(zhǔn)品4 的m/z193.086 6、m/z167.071 0 相比分別減少14.016 8、14.016 5，結(jié)合裂解規(guī)律以及文獻(xiàn)［22］推測(cè)化合物11 為3-乙酰氧基-5-羥基-1-（3-甲氧基-5，4-二羥基苯基）-7-（3-甲氧基4-羥基苯基）庚烷。

在3 類藥材中，檢出最多的二苯基庚烷類型是Ⅰ類，其次是Ⅳ類。姜皮和草果中Ⅰ類的二苯基庚

烷較多，而益智仁中Ⅲ類的二苯基庚烷相對(duì)較多。由峰面積比（Area ratio=化合物峰面積/各自藥材中的1，5-環(huán)氧-3-羥基-1-（3，4-二羥基-5-甲氧基苯基）-7-（4-羥基苯基）庚烷的峰面積×100%）可看出，Ⅲ類二苯基庚烷的響應(yīng)值在3種藥材中普遍較高。

3 結(jié) 論

本文采用ESI-Q-TOF MS 對(duì)11 種二苯基庚烷類化合物標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)各類二苯基庚烷在正離子模式下主要有兩種裂解途徑，C1或C7與苯環(huán)及其取代基會(huì)形成主要特征碎片，根據(jù)質(zhì)譜圖的主要碎片峰推測(cè)苯環(huán)上的取代基，比如m/z107、m/z123、m/z137、m/z153、m/z167 分別提示苯環(huán)上的取代基為1 個(gè)羥基、2 個(gè)羥基、1 個(gè)羥基和1 個(gè)甲氧基、2 個(gè)羥基和1 個(gè)甲氧基、1 個(gè)羥基和2 個(gè)甲氧基。對(duì)于線性二苯基庚烷（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類），若碳鏈上無(wú)羰基，在正離子模式下首先丟失碳鏈上的取代基，隨后主要有兩條裂解途徑，一條是C7位上的苯環(huán)丟失，然后從C7到C2依次丟失；另一條是C1位上的苯環(huán)丟失，然后從C1到C6依次丟失，但當(dāng)苯環(huán)上有2 個(gè)及以上取代基時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)更多的裂解途徑。若碳鏈上有羰基，由于羰基的存在，這類二苯基庚烷多為羰基左右的碳鍵發(fā)生斷裂，由此產(chǎn)生2 條主要裂解途徑，首先丟失O，然后依次丟失其他基團(tuán)。對(duì)于環(huán)狀二苯基庚烷（Ⅳ類），含氧環(huán)附近發(fā)生碳鍵裂解，產(chǎn)生2 條主要裂解途徑，此外，該類二苯基庚烷除了C1或C7與苯環(huán)及其取代基會(huì)形成主要特征碎片外，還會(huì)出現(xiàn)C1～C3與苯環(huán)及其取代基所形成的主要特征碎片，如m/z179。依據(jù)本研究總結(jié)的二苯基庚烷類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，從姜皮、草果、益智仁中分別鑒定出14、11、10 個(gè)二苯基庚烷類成分，為姜科植物中該類化合物的快速定性分析提供了理論基礎(chǔ)。