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      基于實(shí)時(shí)無標(biāo)記技術(shù)研究流式分選后細(xì)胞活性的檢測方法

      2022-07-22 08:11:12李艷偉王佳佳邢月婷黃瑩瑩宋興輝
      分析測試學(xué)報(bào) 2022年7期
      關(guān)鍵詞:流式活性細(xì)胞

      李艷偉,王佳佳,邢月婷,郭 春,黃瑩瑩,宋興輝,黃 瓊

      (浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)平臺,浙江 杭州 310058)

      近年來,利用流式分選技術(shù)精準(zhǔn)分離、純化的活細(xì)胞被廣泛用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)、新藥篩選、生物材料、疾病機(jī)理等領(lǐng)域的研究[1-6]。由于分選后的細(xì)胞大多數(shù)為群體中的低表達(dá)細(xì)胞,因此用于活性檢測的細(xì)胞用量以及檢測后的細(xì)胞能否重新利用顯得尤為重要,也對分選后細(xì)胞活性的檢測指標(biāo)和檢測方法提出了更高的要求。

      細(xì)胞活性是判斷細(xì)胞在某些條件下是否能正常生長的重要指標(biāo),細(xì)胞活性的檢測相當(dāng)于細(xì)胞增殖能力或凋亡能力的測定,其檢測指標(biāo)通常包括細(xì)胞膜對核酸染料的通透性、代謝活性、細(xì)胞分裂增殖等。目前,細(xì)胞活性常規(guī)檢測方法有四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT 法)、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒法(CCK-8)、流式細(xì)胞法等[7],這些方法大都需要對細(xì)胞在特定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行消化、重懸、染色標(biāo)記等處理,步驟多、檢測點(diǎn)有限,往往會遺漏細(xì)胞變化的時(shí)間點(diǎn),增加檢測的盲區(qū)。

      流式細(xì)胞分選技術(shù)是目前純化活細(xì)胞最常見的技術(shù)[8],分選后的細(xì)胞大多數(shù)需繼續(xù)培養(yǎng)后再深入研究其功能,即使是分選后的細(xì)胞直接用于進(jìn)一步功能研究,也需要保持在一定活性狀態(tài)下,因此分選后細(xì)胞的活性不僅可以說明流式分選的水平也為細(xì)胞后續(xù)功能研究提供了保障。檢測細(xì)胞活性的方法很多[9-11],但很少有研究對分選后的細(xì)胞活性進(jìn)行檢測。

      實(shí)時(shí)細(xì)胞功能分析(Real time cellular analysis,RTCA)是一種無需標(biāo)記,可實(shí)時(shí)動態(tài)監(jiān)測細(xì)胞活性的分析技術(shù),該技術(shù)的核心是將微電子細(xì)胞傳感器芯片整合到表面適于細(xì)胞貼附與生長的細(xì)胞檢測板底部的微孔膜上。微電子芯片測定的電阻抗轉(zhuǎn)化為細(xì)胞指數(shù)(Cell index,CI值)即可反映細(xì)胞生長、伸展、形態(tài)變化、死亡和貼壁程度等一系列生理狀態(tài)[9,12]。雖然RTCA 法的應(yīng)用日趨廣泛,但鮮有報(bào)道將其用于分選后細(xì)胞活性的檢測尤其是長效動態(tài)活性的實(shí)時(shí)檢測。本研究以分選前后的人腎上皮細(xì)胞系HEK293T(簡稱293T)細(xì)胞為例,以CCK-8 法、流式細(xì)胞法作為參照,探討了RTCA 法對分選前后細(xì)胞增殖活性的檢測情況,從而建立了簡便、實(shí)時(shí)動態(tài)長效檢測分選后細(xì)胞活性的方法,以期為分選后活細(xì)胞的功能研究提供保障和檢測手段。

      1 實(shí)驗(yàn)部分

      1.1 材料與試劑

      293T細(xì)胞(浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院);流式分選專用質(zhì)控微球(美國Beckman Coulter 公司);流式分析專用質(zhì)控微球(美國BD 公司);凋亡試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司);增殖CCK-8 試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);DMEM 培養(yǎng)基、血清、胰酶、雙抗(美國Gibco 公司);96 孔板、離心管、無菌流式管、40μm 細(xì)胞篩(上海普飛生物技術(shù)有限公司);磷酸緩沖鹽溶液(上海博升生物科技有限公司)。

      1.2 儀器與設(shè)備

      MoFlo AstriosEQ超高速流式細(xì)胞分選儀(美國Beckman Coulter 公司);LSRFortessa 流式細(xì)胞分析儀(美國BD 公司);RTCA-SP高通量實(shí)時(shí)細(xì)胞功能分析儀(德國Roche公司);SynergyMx M5多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)。

      1.3 實(shí)驗(yàn)方法

      1.3.1 分選前樣本制備 復(fù)蘇293T 細(xì)胞并接種于含10%磷酸緩沖鹽溶液及1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)液中,置于37 ℃、5%CO2的孵箱內(nèi)孵育并傳代3次后,待細(xì)胞長至對數(shù)生長期時(shí)(密度為70%~80%),棄上清,加入0.25%胰酶消化,300 g 離心5 min,棄上清,用無菌磷酸緩沖鹽溶液制備成濃度為1 ×107個(gè)/mL 的單細(xì)胞懸液作為分選前樣本,置冰浴中備用,待上機(jī)分選前使用40μm 的細(xì)胞篩網(wǎng)過濾。整個(gè)操作過程需在無菌環(huán)境下完成。

      1.3.2 流式分選參數(shù)調(diào)試 所用的Beckman MoFlo AstriosEQ分選系統(tǒng)具有超高速分選性能[13],使用100 μm 噴嘴分選細(xì)胞,設(shè)定鞘液壓力為0.2 MPa,樣本與鞘液的壓力差為0.002 MPa,分選模式為Purty 模式。調(diào)節(jié)液流與激光垂直正交并校準(zhǔn)激光光斑圖像。準(zhǔn)備分選質(zhì)控微球原液1 滴加入800 μL ddH2O 中混勻并校準(zhǔn)激光延遲,完成儀器質(zhì)控檢測CV、電壓、median 等信號。計(jì)算液滴延遲,校準(zhǔn)液流偏轉(zhuǎn)角度。打開分選監(jiān)測軟件(Summit 6.2),建立實(shí)驗(yàn)方案,分別激活前向散射光信號(FSC)、側(cè)向散射光信號(SSC)、目標(biāo)熒光通道,建立FSC(A)/SSC(A)散點(diǎn)圖并圈定目標(biāo)細(xì)胞群,建立FSC(A)/FSC(H)散點(diǎn)圖并圈定單細(xì)胞群,排除黏連細(xì)胞、死細(xì)胞、細(xì)胞碎片等。

      1.3.3 流式細(xì)胞分選 將預(yù)先制備好的1 mL 細(xì)胞收集液加入到15 mL 離心管中并置于收集架內(nèi),用40μm細(xì)胞篩過濾細(xì)胞懸液作為分選前樣本,調(diào)整上樣細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL,設(shè)置收集管內(nèi)分選細(xì)胞數(shù)為5×106個(gè)/mL。分選前后細(xì)胞均置于冰浴中用于后續(xù)活性檢測。

      1.3.4 流式細(xì)胞分析參數(shù)質(zhì)控調(diào)試 BD LSRFortessa 流式細(xì)胞分析儀具有檢測速度快、靈敏度高的特點(diǎn),采用儀器參數(shù)設(shè)置及追蹤(CST)自動校正程序:取渦旋后的CST微球原液1滴加入500μL ddH2O中混懸,上樣采集進(jìn)行儀器CV、PMTV、mean、median等參數(shù)校正。

      1.3.5 分選前后細(xì)胞的流式凋亡檢測 選取分選前、后的293T 細(xì)胞懸液,于4 ℃、300 g 離心5 min,棄去上清液,按照凋亡試劑盒稀釋5×結(jié)合緩沖液為1×結(jié)合緩沖液,取500μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,調(diào)整重懸后細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL,設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。每管加入Annexin V-FITC 染色液5μL 和碘化丙啶(PI)染色液10μL,于冰浴中避光孵育5 min,進(jìn)行流式細(xì)胞凋亡檢測。按常規(guī)兩色標(biāo)記,首先以未染色管樣本調(diào)節(jié)電壓,單標(biāo)管調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償,以Annexin V-FITC 為橫坐標(biāo)、PI 為縱坐標(biāo)作流式圖。分析時(shí)以Annexin V-FITC 單陽細(xì)胞比例確定細(xì)胞早期凋亡情況,以Annexin V-FITC/PI 雙陽細(xì)胞比例確定細(xì)胞晚期凋亡情況,以Annexin V-FITC/PI雙陰細(xì)胞比例確定細(xì)胞活性情況。

      1.3.6 分選前后細(xì)胞的CCK-8 增殖檢測 選取分選前、后的293T 細(xì)胞懸液,于4 ℃、300 g 離心5 min,棄上清液,加入10%血清的DMEM 培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞濃度為2 × 104個(gè)/mL,取100 μL 細(xì)胞液分別接種在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每個(gè)檢測時(shí)間點(diǎn)設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔,每孔分別加入10 μL 增強(qiáng)型CCK-8 試劑,于37 ℃、5% CO2孵箱中孵育。空白對照中未加入細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組分別于0、24、48、72 h 檢測450 nm 處的吸光度(D450)值,計(jì)算細(xì)胞的平均吸光度,分別繪制細(xì)胞增殖曲線,確定細(xì)胞增殖活性。

      1.3.7 分選前后細(xì)胞的RTCA 檢測 向96 孔增殖板中加50μL 的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液測定基線。選取分選前、后濃度為1×105個(gè)/mL的293T細(xì)胞懸液,于4 ℃、300 g離心5 min,去上清液,加入10%血清的DMEM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,濃度為5×104個(gè)/mL,取100μL 細(xì)胞液加入上述增殖板中,使每個(gè)孔包含5 000 個(gè)細(xì)胞,設(shè)置4 個(gè)復(fù)孔,超凈臺內(nèi)靜置30 min 后放入檢測儀,設(shè)定每15 min 進(jìn)行一次CI 值檢測,連續(xù)檢測72 h,以細(xì)胞CI值為Y軸,時(shí)間t為X軸繪制293T細(xì)胞增殖曲線[14-15]。

      1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

      實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為每次實(shí)驗(yàn)的至少3 個(gè)重復(fù),所用圖片與數(shù)據(jù)分別為具有代表性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用FlowJo_V10 軟件進(jìn)行處理分析,統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用GraphPad Prism 7 軟件進(jìn)行分析,采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)比較組間統(tǒng)計(jì)差異。其中,P<0.05 表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 流式細(xì)胞凋亡檢測

      細(xì)胞凋亡作為細(xì)胞活性檢測的指標(biāo)之一,是一種程序性死亡過程,早期凋亡細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸(PS)外翻與Annexin V 結(jié)合,晚期凋亡時(shí)細(xì)胞膜具有通透性且仍保留PS 外翻特性,PI 染料可進(jìn)入核內(nèi)與DNA 結(jié)合,壞死的細(xì)胞為裸核,只有PI 與DNA 結(jié)合[16-17]。因此利用流式凋亡圖可以區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞,細(xì)胞凋亡率等于3 個(gè)復(fù)孔細(xì)胞凋亡率的平均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)方差。根據(jù)細(xì)胞凋亡率可以判斷分選前后細(xì)胞的凋亡情況,統(tǒng)計(jì)分析流式凋亡圖中的活細(xì)胞比例則可以判斷分選前后細(xì)胞活性情況。本實(shí)驗(yàn)中,細(xì)胞分選后需在4 ℃條件下離心、重懸、染色孵育、上機(jī)檢測,其中離心、重懸吹吸操作等會增加細(xì)胞凋亡的比例,因此需要記錄大量細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)選取有代表性的流式細(xì)胞凋亡圖(圖1A)進(jìn)行展示。計(jì)算得到分選后細(xì)胞凋亡率為(3.85 ± 0.008)%,分選前細(xì)胞凋亡率為(14.09 ± 0.021)%,進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析分選前后的細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn),分選后細(xì)胞凋亡率較分選前下降明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖1B);統(tǒng)計(jì)分選前后的活細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn),流式分選后細(xì)胞活性高于分選前,具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)(圖1C)。

      圖1 流式細(xì)胞法檢測分選前、后293T細(xì)胞的凋亡結(jié)果Fig.1 Apoptosis results of 293T cells before and after sorting by flow cytometry A. apoptosis results;B. apoptosis statistics chart of 293T cell,*P <0.05;C. activity statistics chart of 293T cell,***P <0.001

      2.2 CCK-8增殖檢測

      細(xì)胞增殖是活細(xì)胞的重要生理功能之一,而細(xì)胞代謝活性檢測基于被細(xì)胞線粒體脫氫酶還原為黃色的水溶性甲臜產(chǎn)物,該黃色甲臜物的吸光度與活細(xì)胞數(shù)量成正比,可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量[18-19]。實(shí)驗(yàn)中,需將淡紅色的CCK-8試劑直接加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中混勻(試劑顏色與酚紅顏色接近,需避免漏加或多加[20])。連續(xù)孵育0、24、48、72 h,分別進(jìn)行吸光度的檢測。結(jié)果顯示,293T 細(xì)胞的吸光度(D450)隨著細(xì)胞孵育時(shí)間的增加而增加,隨后增殖曲線進(jìn)入平臺期,細(xì)胞吸光度(D450)增幅越來越小(圖2A)。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),分選后293T 細(xì)胞的吸光度在孵育24 h 后高于分選前,具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)(圖2B)。

      圖2 CCK-8檢測法檢測分選前、后293T細(xì)胞的增殖結(jié)果Fig.2 Proliferation results of 293T cells before and after sorting by CCK-8 detection method A. the absorbance value of 293T cells over time;B. proliferation activity statistics chart of 293T cells,***P <0.001

      2.3 RTCA實(shí)時(shí)增殖檢測

      RTCA 法操作簡單,具有實(shí)時(shí)、自動、無標(biāo)記、高通量的優(yōu)勢[21-22]。實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞接種于96 孔增殖板中,連續(xù)動態(tài)檢測72 h,觀察細(xì)胞實(shí)時(shí)動態(tài)增殖曲線。結(jié)果顯示,CI 值變化與細(xì)胞的活性成正比,細(xì)胞活性越好,貼壁生長的數(shù)量就越多,增殖板孔底微電子芯片的電阻抗增加越快,CI 值增加越快。當(dāng)增殖板孔中的細(xì)胞鋪滿孔底時(shí),孔底微電子芯片的電阻抗不再變化,CI值不再增加,曲線進(jìn)入平臺期。結(jié)果顯示,分選后細(xì)胞動態(tài)增殖曲線的CI 值高于分選前(圖3A)。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),分選后293T 細(xì)胞的增殖活性明顯高于分選前,具有極顯著性的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.000 1)(圖3B)。

      圖3 RTCA檢測法檢測分選前、后293T細(xì)胞的增殖結(jié)果Fig.3 Proliferation results of 293T cells before and after sorting by RTCA detection method A. cell proliferation index value of 293T cells over time;B. proliferation activity statistics chart of 293T cells,****P <0.000 1

      2.4 3種檢測方法的比較

      比較RTCA法、CCK-8法、流式細(xì)胞法對分選后細(xì)胞活性的檢測結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn),RTCA法檢測的細(xì)胞活性高于CCK-8法,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01);RTCA法檢測的細(xì)胞活性明顯高于流式細(xì)胞法,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01);CCK-8法檢測的細(xì)胞活性與流式細(xì)胞法檢測的細(xì)胞活性無明顯差異(P>0.05)。

      圖4 3種方法檢測分選前、后293T細(xì)胞活性的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.4 Statistical results of three detection methods to detect the activity of 293T cells before and after sorting**P <0.01,nsP >0.05

      綜合比較3種細(xì)胞活性檢測方法(表1)。RTCA 法操作最簡單,細(xì)胞用量少,全程無額外刺激干擾,結(jié)果最全面、客觀;CCK-8 法細(xì)胞用量小、成本也相對較低,缺點(diǎn)是需要耗費(fèi)較長時(shí)間來摸索最佳檢測條件[23]。這兩種方法檢測后的細(xì)胞可繼續(xù)用于細(xì)胞其他功能的測定。流式細(xì)胞法可以定量計(jì)算細(xì)胞的凋亡率及活性率,但細(xì)胞用量大,操作步驟多,實(shí)驗(yàn)成本較高,而且檢測后的細(xì)胞直接流入廢液,不可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。CCK-8 法和流式細(xì)胞法,檢測過程需要人工操作,自動化程度不高;而RTCA 法在細(xì)胞鋪板后,會實(shí)時(shí)自動監(jiān)測細(xì)胞增殖變化的整個(gè)過程,自動化程度高[24]。因此,RTCA 法具有操作流程極簡、無需標(biāo)記、檢測靈敏度高、可實(shí)時(shí)動態(tài)監(jiān)測細(xì)胞整個(gè)生長變化過程的優(yōu)勢,可作為實(shí)時(shí)便捷的分選后細(xì)胞活性檢測方法,檢測的細(xì)胞長效活性結(jié)果可為分選后細(xì)胞功能的深入研究提供保障,為基礎(chǔ)與臨床細(xì)胞活性研究提供檢測手段。

      表1 3種細(xì)胞活性檢測方法的比較Table 1 Comparison of three cell activity detection assays

      3 結(jié) 論

      本文通過比較RTCA法、CCK-8法、流式細(xì)胞法3種檢測方法,建立了流式分選后細(xì)胞活性的實(shí)時(shí)無標(biāo)記檢測方法,用于驗(yàn)證流式分選后細(xì)胞狀態(tài)的高穩(wěn)定性和高活性,為分選后細(xì)胞功能的深入研究提供了保障。

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