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      基于PET效應(yīng)檢測(cè)8-氧鳥嘌呤DNA糖基化酶的熒光傳感器

      2022-07-22 08:11:10李哲建喬成芳
      分析測(cè)試學(xué)報(bào) 2022年7期
      關(guān)鍵詞:堿基熒光強(qiáng)度

      劉 萍,金 東,李哲建,喬成芳

      (1.商洛學(xué)院 化學(xué)工程與現(xiàn)代材料學(xué)院,陜西 商洛 726000;2.陜西省尾礦資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西商洛 726000;3.南京郵電大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 南京 043000)

      生物體的生命活動(dòng)經(jīng)常會(huì)受到內(nèi)、外致突變因素的影響,引起DNA 堿基損傷。8-氧鳥嘌呤(8-oxoG)是DNA氧化損傷的重要標(biāo)志[1]。8-氧鳥嘌呤DNA糖基化酶(OGG1)是一類存在于生物體內(nèi)能夠參與DNA 損傷修復(fù)過程的蛋白酶,可與DNA 雙鏈進(jìn)行非特異性結(jié)合,選擇性識(shí)別并切除DNA 雙鏈中的8-oxoG,形成脫嘌呤(AP)位點(diǎn),并在一系列修復(fù)酶協(xié)助下完成DNA 分子的修復(fù)[2]。人體中8-氧鳥嘌呤DNA 糖基化酶(OGG1)稱為hOGG1。研究表明:OGG1的異常與多種疾病以及癌癥密切相關(guān)[3],其已成為多種疾病發(fā)展?fàn)顟B(tài)的重要標(biāo)志物和癌癥的潛在治療靶點(diǎn),因此實(shí)現(xiàn)對(duì)OGG1 活性的快速、靈敏檢測(cè)對(duì)于基礎(chǔ)生化研究和臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展具有十分重要的意義。

      檢測(cè)OGG1 的傳統(tǒng)方法有凝膠電泳法[4]、放射性檢測(cè)法[5]、高效液相色譜法(HPLC)[6]、比色法[7]、電化學(xué)法[8]和熒光分析法[9-10]等,如蔣健暉課題組[7]基于探針末端保護(hù)原理,利用表面修飾寡核苷酸的AuNP作為識(shí)別探針,發(fā)展一種檢測(cè)hOGG1活性的比色分析法。Liu等[8]基于hOGG1對(duì)8-oxoG 的識(shí)別特性,設(shè)計(jì)了包含8-oxoG及亞甲基藍(lán)分子(MB)的DNA探針,利用方波伏安法(SWV)表征hOGG1的活性,將酶活性成功轉(zhuǎn)化成物理信號(hào)輸出,建立了目標(biāo)蛋白與電化學(xué)信號(hào)之間的量化關(guān)系,構(gòu)建了靈敏的hOGG1 電化學(xué)傳感器。劉斌等[9]利用標(biāo)記熒光的發(fā)夾結(jié)構(gòu)分子信標(biāo),設(shè)計(jì)含有8-oxoG 且有標(biāo)記的雙鏈DNA,利用hOGG1的特異性功能解鏈,再用適體與解旋鏈形成復(fù)合物,通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)8-oxoG 切割過程建立了一種hOGGl 活性分析的新方法。李峰課題組[10]發(fā)展一種核酸外切酶ExoⅢ輔助的等溫循環(huán)信號(hào)放大策略,實(shí)現(xiàn)了對(duì)hOGG1活性的熒光檢測(cè)。但多數(shù)方法存在靈敏度差、操作復(fù)雜、分析耗時(shí)、儀器昂貴、污染環(huán)境等不足,極大地限制了方法的推廣應(yīng)用。

      本文基于G堿基與羧基熒光素(FAM)產(chǎn)生光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)效應(yīng)[11-12],利用OGG1酶能特異識(shí)別含有8-oxoG 的雙鏈DNA 的特點(diǎn),建立了一種檢測(cè)OGG1 酶活性的熒光新方法。該方法具有操作簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

      1 實(shí)驗(yàn)部分

      1.1 儀器與試劑

      F-4600 型日立熒光分光光度計(jì)(日本日立公司),便攜式pH 計(jì)、XS105DU 型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司),TGL-18C離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠),移液槍(北京大龍公司),恒溫水浴鍋(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)。

      三(羥甲基)氨基甲烷(Tris,上海青析化工科技有限公司),NaCl、EDTA、無水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),MgCl2、Cd(NO3)2·4H2O(上海麥克林生化科技有限公司),均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水(18.2 MΩ·cm)。

      8-氧鳥嘌呤糖基化酶(OGG1)、10×NEB緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L MgCl2、10 mmol/L 1,4-二硫蘇糖醇(DTT),pH 7.0)、100 × 牛血清白蛋白(10 mg/mL BSA)購(gòu)于NEB 公司(New England Bioblabs 公司),尿嘧啶DNA 糖基化酶(UDG)、10 × 反應(yīng)緩沖液(200 mol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl,pH 8.2)核糖核酸酶(RNase A)、實(shí)驗(yàn)所用DNA序列(表1)均購(gòu)于上海生物工程股份有限公司。DNA 使用前在10 000 r/min 下離心5 min,然后用10 mmol/L Tris-HCl 緩沖液(含1 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA,pH 8.0)配制成100μmol/L DNA儲(chǔ)備液,于-18 ℃冷凍保存。

      表1 實(shí)驗(yàn)所用的DNA序列(5'-3')Table 1 DNA sequences used in the experiment(5'-3')

      1.2 實(shí)驗(yàn)方法

      1.2.1 DNA 雜交 取5μL 100μmol/L FAM-DNA1 溶液于離心管中,加入5μL 100μmol/L 含G 堿基且與FAM-DNA1 互補(bǔ)的DNA(c-DNA)溶液,用10 mmol/L Tris-HCl 緩沖液(含50 mmol/L NaCl、10 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EDTA,pH 8.0)定容至100 μL,充分混合。然后置于水浴中緩慢升溫至95 ℃,保持10 min 后自然降至室溫并孵育30 min,室溫下避光培育過夜,使DNA 充分雜交。2 條單鏈DNA 序列互補(bǔ),形成穩(wěn)定的DNA 雙鏈結(jié)構(gòu),將得到的FAM/dsDNA1 溶液儲(chǔ)存于4 ℃的冰箱中備用。采用同法得到FAM/dsDNA2。

      1.2.2 OGG1 的測(cè)定 取100μL FAM/dsDNA1 溶液于比色皿中,測(cè)定其熒光強(qiáng)度(F0),然后加入不同濃度的OGG1,反應(yīng)溶液為1×NEB,300 g/mL BSA 的緩沖液,混勻后在40 ℃恒溫水浴中反應(yīng)2.5 h。待溶液冷卻至室溫后,設(shè)置熒光儀的激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm,狹縫寬度為5 nm,激發(fā)和發(fā)射光倍增管電壓為700 V,在500 ~650 nm 范圍內(nèi)測(cè)定熒光發(fā)射光譜強(qiáng)度(F)。根據(jù)加入OGG1 前、后體系熒光強(qiáng)度的差值ΔF(ΔF=F-F0)測(cè)定OGG1的濃度。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 實(shí)驗(yàn)原理

      基于G堿基對(duì)熒光染料的猝滅效應(yīng)以及OOG1對(duì)8-oxoG的識(shí)別和切除作用,以1條5'末端標(biāo)記羧基熒光素且含有8-oxoG 的DNA 鏈為信號(hào)探針,1 條3'末端含多個(gè)G堿基的互補(bǔ)序列作為猝滅基團(tuán),當(dāng)2 個(gè)鏈雜交后G 堿基末端會(huì)接近FAM,從而引發(fā)有效的光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致熒光猝滅。當(dāng)體系中加入OGG1,其將受損G堿基剪切后DNA 序列產(chǎn)生缺口,較短的帶有FAM 信號(hào)的DNA 片段由于熔化溫度降低從互補(bǔ)鏈上解旋下來,釋放出FAM 的熒光信號(hào),導(dǎo)致體系熒光增強(qiáng)。根據(jù)加入OGG1 前、后體系的熒光強(qiáng)度變化可實(shí)現(xiàn)對(duì)OGG1的活性檢測(cè)。檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示。

      圖1 實(shí)驗(yàn)原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of the experimental principles

      2.2 傳感器的可行性

      為驗(yàn)證方法的可行性,實(shí)驗(yàn)考察了加入OGG1 前、后反應(yīng)體系的熒光光譜(如圖2)。結(jié)果顯示,F(xiàn)AM-DNA1具有很強(qiáng)的熒光信號(hào),與c-DNA雜交后體系的熒光強(qiáng)度明顯降低,說明形成雙鏈DNA 后G 堿基和FAM之間產(chǎn)生PET效應(yīng),猝滅了FAM的熒光;當(dāng)向底物中加入OGG1 后,熒光強(qiáng)度增強(qiáng),且加入的OGG1 濃度越大,熒光信號(hào)增強(qiáng)越大。說明向猝滅體系中加入OGG1 后,由于酶對(duì)oxoG 堿基的識(shí)別切除作用,使得雙鏈結(jié)構(gòu)被破壞,熔化溫度降低,釋放出帶FAM 的DNA片段,阻止了PET 過程,體系的熒光強(qiáng)度得到恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象與設(shè)計(jì)的原理相一致。

      圖2 不同條件下FAM-DNA1的熒光光譜Fig.2 Fluorescent spectra of FAM-DNA1 in different conditions a:5 mmol/L FAM-DNA1;b:a+5 mmol/L c-DNA;c:b+10 U/mL OGG1;d:b+60 U/mL OGG1

      為進(jìn)一步驗(yàn)證體系熒光信號(hào)的升高是OGG1 剪切釋放FAM-DNA 片段所致,以1 條相同序列的FAMDNA2 作為空白對(duì)照,在其它條件不變的情況下,考察其加入OGG1前、后體系的熒光信號(hào)變化(如圖3)。結(jié)果表明,F(xiàn)AM-DNA2與c-DNA雜交后熒光信號(hào)同樣被猝滅,當(dāng)加入OGG1 后熒光強(qiáng)度無明顯變化,說明雙鏈結(jié)構(gòu)未被破壞,不能產(chǎn)生熒光恢復(fù)。原因在于該體系中沒有供OGG1 特異識(shí)別切除的oxoG,當(dāng)加入OGG1 后,不會(huì)引起熒光信號(hào)的增強(qiáng),進(jìn)一步驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)原理是合理的。

      圖3 不同條件下FAM-DNA2的熒光光譜Fig.3 Fluorescent spectra of FAM-DNA2 in different conditions a:5 mmol/L FAM-DNA2;b:a+5 mmol/L c-DNA;c:b+60 U/mL OGG1

      2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

      2.3.1 培育溫度的優(yōu)化 由于酶的活性與溫度有密切關(guān)系,溫度太低會(huì)使酶不能發(fā)揮最佳性能,溫度過高會(huì)使酶失去活性。為得到最佳的培育溫度,考察了加入酶后反應(yīng)體系溫度對(duì)熒光信號(hào)的影響。圖4 為加入OGG1后不同溫度時(shí)體系熒光強(qiáng)度的變化圖。由圖4 可知,當(dāng)反應(yīng)溫度在30 ~35 ℃時(shí),體系的熒光強(qiáng)度變化不明顯,當(dāng)溫度達(dá)40 ℃時(shí),體系的熒光強(qiáng)度變化明顯增大,且繼續(xù)升溫時(shí)體系的熒光信號(hào)略有增加但變化不明顯??紤]到實(shí)驗(yàn)效率,選擇培育溫度為40 ℃。

      圖4 不同培育溫度對(duì)反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effects of different incubation temperature on fluorescence intensity of the reaction system FAM/dsDNA1:5μmol/L;OGG1:40 U/mL

      2.3.2 剪切時(shí)間的優(yōu)化 剪切時(shí)間是一個(gè)非常重要的因素,影響著方法的靈敏度??疾炝薋AM/dsDNA1 體系與OGG1充分作用所需的時(shí)間。圖5顯示了酶剪切時(shí)間對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果顯示,在30 ~180 min 范圍內(nèi),隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),熒光強(qiáng)度差值不斷增加,當(dāng)達(dá)到150 min 后,變化趨于平緩,ΔF達(dá)到一個(gè)平臺(tái)值,說明此時(shí)剪切反應(yīng)已趨于完全。因此,實(shí)驗(yàn)選擇最佳反應(yīng)時(shí)間為150 min。

      圖5 加入OGG1后剪切時(shí)間對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of shear time on fluorescence intensity of the reaction system after addition of OGG1 FAM/dsDNA1:5μmol/L;OGG1:40 U/mL

      2.4 線性范圍與檢出限

      在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,對(duì)方法靈敏度進(jìn)行了評(píng)估。如上所述,當(dāng)向FAM/dsDNA1 體系中加入OGG1 前后,體系的熒光強(qiáng)度發(fā)生改變,通過熒光強(qiáng)度的變化值實(shí)現(xiàn)對(duì)OGG1 的活性檢測(cè)。向FAM/dsDNA1 體系中加入不同濃度OGG1,對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行測(cè)定(如圖6)。圖6A 顯示,隨著OGG1 濃度從2 U/mL 增至1 000 U/mL,體系的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),表明OGG1 濃度越高,越多的FAM/dsDNA1 中的oxoG 受損堿基被切除,釋放越多帶FAM 信號(hào)的DNA片段,熒光增強(qiáng)變化越顯著,說明熒光信號(hào)的增強(qiáng)高度依賴OGG1 的濃度。由圖6B 可知,OGG1 的濃度(C,U/mL)在0 ~60 U/mL 范圍內(nèi)與體系熒光強(qiáng)度的變化值(ΔF)呈良好的線性關(guān)系,線性方程為:ΔF=21.672 5C+6.982 0,相關(guān)系數(shù)(r2)為0.993 2。根據(jù)3σ規(guī)則計(jì)算得到OGG1的檢出限為0.7 U/mL。

      圖6 FAM/dsDNA1體系與不同濃度OGG1作用的熒光光譜(A),F(xiàn)AM/dsDNA1體系中加入不同濃度OGG1的線性曲線(B)Fig.6 Fluorescent spectra of FAM/dsDNA1 reaction system with different concentrations of OGG1(A),and linear curves of concentrations of OGG1 versus fluorescence intensity changes of FAM/dsDNA1 reaction systems(B)a:5μmol/L FAM-DNA1;b:a+5μmol/L c-DNA;OGG1(c-k):2,10,20,40,60,80,100,500,1 000 U/mL

      2.5 選擇性

      選擇性是衡量檢測(cè)方法優(yōu)劣的重要指標(biāo),實(shí)驗(yàn)考察了其他蛋白質(zhì)對(duì)FAM/dsDNA1 熒光信號(hào)的影響。以UDG酶和RNase A 作為干擾酶,將UDG酶、RNase A 和OGG1分別加入到FAM/dsDNA1 反應(yīng)體系中,在FAM/dsDNA1為5 μmol/L,RNase A 為100 μg/mL,UDG 為100 U/mL,OGG1為40 U/mL條件下,檢測(cè)相應(yīng)的熒光強(qiáng)度變化。

      結(jié)果顯示,RNase A 和UDG 體系的熒光信號(hào)變化(ΔF)很小,而在OGG1 存在情況下,熒光強(qiáng)度變化很大,說明本方法可以高特異性地區(qū)分OGG1 與其他干擾蛋白,對(duì)OGG1檢測(cè)有較好的選擇性,在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中具有很大的潛力。

      2.6 抑制劑分析

      Cd2+對(duì)許多酶存在抑制作用,常被選作酶抑制劑分析模型[13]。為研究OGG1抑制劑對(duì)OGG1酶活性的影響,選擇硝酸鎘Cd(NO3)2為抑制劑模型。OGG1的活性位點(diǎn)是通過Zn2+結(jié)合位點(diǎn)形成[14],而Cd2+能夠占據(jù)該活性位點(diǎn)使得OGG1 活性被抑制[15]。在FAM/dsDNA1 為5 μmol/L,OGG1 為60 U/mL 條件下,將5、10、20、30、50、80μmol/L的Cd2+與OGG1在40 ℃下培育20 min,然后加入到FAM/dsDNA1體系進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測(cè)。

      基于公式(1)確定OGG1 被抑制的相對(duì)活性(RA)。根據(jù)RA與Cd2+濃度擬合的曲線確定最大半抑制濃度(IC50)。

      RA=(Fi-F0)/(FCd-F0) (1)

      其中,F(xiàn)i為不存在Cd2+時(shí)的熒光強(qiáng)度;FCd為存在Cd2+時(shí)的熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明,當(dāng)Cd2+濃度從0 增至80μmol/L 時(shí),OGG1的相對(duì)活性逐漸降低。根據(jù)擬合曲線確定在60 U/mL OGG1體系中,Cd2+抑制作用的IC50為22.26μmol/L。說明本方法可用于對(duì)OGG1酶活性的抑制作用研究。

      2.7 血清樣品中OGG1活性分析

      采用本方法檢測(cè)了正常人血清中OGG1的濃度。將血液樣品在3 000 r/min下離心5 min,上層淡黃色液體即為待測(cè)的血清樣品,-4 ℃冷藏備用。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法,將不同濃度的OGG1加入正常人血清樣品中,測(cè)定OGG1 的回收率。結(jié)果如表2 所示,OGG1 的回收率為99.1%~105%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.0%~4.3%。表明本方法可用于實(shí)際樣品中OGG1的定量分析,在臨床診斷中具有很大的應(yīng)用潛力。

      表2 人血清樣品添加OGG1的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Recoveries and relative standard deviations of human serum samples added OGG1

      3 結(jié) 論

      本文基于脫氧鳥苷G 堿基的猝滅,設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)單、靈敏的熒光方法用于DNA 糖基化酶OGG1 的檢測(cè)。該方法具有明顯的優(yōu)勢(shì):探針設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單,避免探針的復(fù)雜合成;其識(shí)別響應(yīng)原理是高效的PET機(jī)制,且利用鳥嘌呤天然高效的熒光猝滅能力,無需使用有機(jī)染料分子標(biāo)記的DNA 或額外的納米材料作為猝滅劑,簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟,節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本。方法不僅能提高OGG1 活性的分析效率,而且可為DNA損傷相關(guān)修復(fù)酶的檢測(cè)提供簡(jiǎn)便、通用的傳感平臺(tái),有望實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞中OGG1活性的檢測(cè)。

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