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      基于超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱質譜的結直腸癌患者血清脂質組學研究

      2022-07-22 08:10:56陳鴻煒農艷瑛朱一帆梁運嘯周海琳張嘉豪張淇淞
      分析測試學報 2022年7期
      關鍵詞:磷脂組學脂質

      陳鴻煒,農艷瑛,朱一帆,梁運嘯,周海琳,張嘉豪,張淇淞*

      (1.廣西大學 醫(yī)學院,廣西 南寧 530004;2.廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院 消化內科,廣西 南寧 530011;3.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院 消化內科,廣西 南寧 530021)

      結直腸癌(Colorectal cancer,CRC)又稱大腸癌,是消化系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤。癌癥是世界各國的主要死亡原因,而CRC 在世界癌癥的致死率為9.4%,是癌癥死亡的主要原因[1]。CRC 的早期發(fā)現對于患者的治療和愈后有著很大影響,CRC早期患者5年以上生存率達98%,而終末期患者5年以上的生存率則不足10%[2],且早期患者的預后良好。因此,CRC 的早期診斷和發(fā)現可有效降低死亡率和提高生存率。然而,由于CRC 早期缺乏典型臨床表征且診斷困難,大多數患者發(fā)現時已為癌癥中晚期。目前,CRC 的常規(guī)診斷方法分為侵入性和非侵入性兩種。前者包括柔性乙狀結腸鏡和結腸鏡檢查,后者包括糞便、血液檢查以及放射學檢查[3]?,F有的非侵入性檢查診斷雖較為簡便,且患者依從性好,但敏感性和特異性較低;侵入性的腸鏡檢查為結直腸癌診斷的金標準,準確度高,但患者耐受性差,并發(fā)穿孔和出血等風險,且檢查費用和技術要求高,大規(guī)模應用難以實現[4]。因此,急需尋找一種診斷性能高、微創(chuàng)且便捷的標志物用于CRC診斷。

      脂質是一類分布廣泛的內源性代謝物,具有許多重要的生理功能。脂質代謝途徑的改變在許多常見疾病的預測、預后和診斷中發(fā)揮關鍵作用,其在疾病發(fā)病機制中的潛在作用在許多人類疾病中得到廣泛研究[5]。脂類物質也被證實參與多種癌癥的發(fā)生與惡化[6-7]。近年來,研究證實CRC與脂質代謝異常存在密切關系[8-9]。脂質組學是研究生物體內脂質代謝的一種有效技術,同時在腫瘤標志物的探索中表現出巨大潛力,近期已成為研究熱點[10]。通過CRC 組織脂質組學研究發(fā)現,溶血肝磷脂酰膽堿(LPCs)和磷脂酰膽堿(PCs)是與CRC 產生和惡化最密切相關的生物標志物[11-12]。然而,目前尚無采用血清脂質組學探索CRC生物標志物的研究報道。

      超高效液相色譜串聯高分辨質譜(UHPLC-HRMS)以其高通量、高選擇性和高靈敏度的優(yōu)點成為脂質組學中最常用的分析技術。本文利用高靈敏度和高分辨率的超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱質譜(UHPLC-Q Exactive-Orbitrap MS)進行CRC患者的血清非靶向脂質組學研究,通過對比發(fā)現健康人和CRC 患者的脂質代謝輪廓差異,結合多元統(tǒng)計分析對其進行篩選和評價,進而獲得具有良好診斷效能的腫瘤標志物,為CRC的臨床診斷提供參考。

      1 實驗部分

      1.1 儀器與試劑

      UltiMate 3000超高效液相色譜儀-四極桿-靜電場軌道阱質譜(美國賽默飛世爾科技公司);高速冷凍離心機(德國艾本德公司);密理博超純水系統(tǒng)(美國密理博公司);渦旋器(上海精科儀器有限公司);超聲儀(上海生析超聲儀器有限公司);制冰機(意大利Scotsman公司)。

      棕櫚酰乙醇胺、棕櫚酸、鞘氨醇標準品購于美國Sigma-Aldrich 公司。甲醇、二氯甲烷、異丙醇、乙腈、甲酸銨、甲酸(色譜純,美國默克公司);超純水(美國密理博公司)。

      1.2 樣本來源及處理

      CRC患者和健康人(NR)血清樣品均采集于廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院,且研究方案經廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會批準(倫理號:KY-DZX-202008),所有受試者均簽署知情同意書。根據以下標準納入CRC 患者(n=50):(1)病理診斷為結直腸癌;(2)術前未接受手術、化療、放療;(3)無嚴重代謝性、血液病或惡性腫瘤。健康受試者(n=50)為經結腸鏡檢查證實無任何腸道腫瘤且無嚴重代謝性、血液病或惡性腫瘤的健康人群。術前受試者禁食8 h后,通過促凝采血管采集全血樣本,在室溫下靜置1 h后,以5 000 r/min在4 ℃下離心10 min,分離上層血清轉移至新的EP管中,80 ℃下冷凍儲存?zhèn)溆谩?/p>

      血清樣品制備:將超低溫儲存的血清置于冰上解凍,吸取50μL血清,加入500μL預冷卻的二氯甲烷-甲醇溶液(3∶1,體積比),渦旋5 min 后置于冰浴下10 min,以13 000 r/min 在4 ℃下離心10 min,離心管中的溶液分成3 層。取中層的二氯甲烷溶液300μL,在真空下干燥。干燥樣品用600μL 乙腈-異丙醇溶液(1∶1,體積比)復溶,渦旋2 min 后,于冰浴條件下超聲5 min。渦旋1 min 后將混合物在4 ℃下以13 000 r/min離心15 min,取上清液用于血清脂質分析。在正式進樣前,精密吸取已制備的各待測血清樣品5μL混合,作為質量控制樣品(QC),用于評價分析系統(tǒng)和方法的穩(wěn)定性及重現性。

      1.3 色譜與質譜條件

      色譜條件:Waters Acquity UPLC HSS T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm);流速為0.3 mL/min;流動相:A 為體積比60∶40 的乙腈-水溶液(含0.1%甲酸和10 mmol/L 甲酸銨),B 相為體積比90∶10的異丙醇-乙腈溶液(含0.1%甲酸和10 mmol/L 甲酸銨)。梯度洗脫程序為:0.0~4.0 min,70%~40%A;4.0~9.0 min,40%~0%A;9.0~15 min,0%A;15~18 min,0%~70%A;柱溫為40 ℃;進樣量為5μL。

      質譜條件:電噴霧離子源(ESI 源),輔助氣流速為13 arb,鞘氣流速為40μL/min,毛細管溫度為320 ℃,霧化氣溫度為420 ℃,噴霧電壓為3.50 kV(正離子)或2.80 kV(負離子);數據采集模式為Full Scan+ddMS2;階梯式碰撞能量(10、20、40 eV);一級掃描范圍為m/z100~1 200,一級和二級質譜的分辨率分別為70 000和17 500。

      1.4 質譜數據處理及分析

      (1)將2 組樣品的原始數據文件導入代謝組數據處理軟件Compound Discovery 3.1(Thermo Scientific,Fremont,CA,USA)中,提取脂質組學數據(包括離子特征、保留時間、質荷比和峰強度),并應用QC數據進行峰對齊和歸一化處理。(2)根據數據的正態(tài)分布情況,采用Mann-WhitneyU檢驗或Student’t檢驗進行脂質特征的組間差異分析,P<0.05則認為該特征組間差異具有統(tǒng)計學意義。(3)將已提取數據文件導入Simca-P 14.0 軟件中進行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA),并通過200 次置換檢驗進一步考察OPLS-DA 模型的可靠性和適用性,避免數據分析的過度擬合。結合倍數變化小于0.67或大于1.5且P<0.05為標準篩選差異脂質特征。(4)根據精確分子量和保留時間誤差(10 ppm 和0.2 min),以及自帶數據庫mzCloud 和LipidBlast 鑒定脂質標志物。(5)采用MetaboAnalyst 5.0軟件對組間差異脂質進行受試者工作特征曲線(ROC)分析,以探索CRC的診斷脂質標志物。

      1.5 研究對象的基線特征

      本研究的受試者共有100名,NR和CRC臨床血清樣本各50例?;镜呐R床信息如表1所示,兩組間的性別和年齡構成無統(tǒng)計學差異。CRC 患者病變部位以結腸和直腸進行分類,其分化程度和腫瘤分期用于評估CRC的嚴重程度。

      表1 受試者的基本臨床信息Table 1 Basic clinical informations of subjects

      2 結果與討論

      2.1 主成分分析

      通過建立PCA 模型進行分析,考察儀器系統(tǒng)和檢測方法的穩(wěn)定性及樣本的分布趨勢。由PCA 三維得分圖(圖1A、1B)可知,QC 樣本在2 種ESI模式下均緊密聚集,表明其脂質組學特征未發(fā)生漂移,說明分析系統(tǒng)在批量分析過程中具有良好的穩(wěn)定性和重現性,滿足脂質組學分析的要求。NR 組和CRC組分別位于得分圖兩側,組間區(qū)分較為明顯,說明兩組的血清脂質譜存在差異。同時,大多數樣本在95%的置信區(qū)間內,少數超出95%置信區(qū)間的樣本呈現較為離散趨勢,可能由于存在較大的個體差異。提取QC 組中各脂質特征的峰面積,發(fā)現大多數脂質特征峰面積的相對標準偏差(RSD)小于20%,表明整個測試過程中分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性良好。

      2.2 正交偏最小二乘判別分析

      為了更清楚地辨別出NR 與CRC 組間的血清脂質譜差異,在PCA 分析的基礎上基于所有檢測到的脂質特征構建OPLS-DA 模型進行分析,以篩選生物標志物。相對于PCA 分析,由OPLS-DA 分析的三維得分圖(圖1C、1D)可以看出NR 組和CRC 組的組間區(qū)分更明顯,表明兩者血清脂質譜差異顯著。正離子模式下OPLS-DA 模型的R2X、R2Y、Q2 值分別為0.488、0.980、0.947;負離子模式下分別為0.549、0.923、0.770,表明所建立的模型對數據描述和預測能力良好。采用200次置換檢驗進一步考察了OPLS-DA 模型的可靠性,正離子模式下置換檢驗主要參數R2、Q2、P值分別為0.784、-0.361 和0.000(圖1E),負離子模式下3 個參數值分別為0.685、-0.358 和0.000(圖1F),且直線初始點均高于樣品點,提示該分析模型不存在過擬合,應用合理。

      圖1 健康對照組(NR)和結直腸癌組(CRC)血清脂質組學的PCA三維得分圖(A、B)、OPLS-DA三維得分圖(C、D)以及OPLS-DA模型的置換檢驗圖(E、F)Fig.1 PCA 3D score plots(A,B),OPLS-DA 3D score plots(C,D)and permutations test for the OPLS-DA model(E,F)of serum lipids in normal control group(NR)and colorectal cancer group(CRC)A,C and E:in ESI+mode;B,D and F:in ESI- mode

      2.3 生物標志物的篩選與診斷效能評價

      根據兩組間的變化倍數和差異分析統(tǒng)計值,以倍數變化>1.5或<0.67,且P<0.05為標準篩選組間差異脂質,共發(fā)現155 種差異脂質(ESI+、ESI-模式下分別有18 種和137 種)。其中,DAG、TAG、PC、LPC、LPE、SM、PE、PI、Cer、FA 的數量構成比例分別為1.94%、27.10%、30.32%、9.03%、1.29%、9.68%、3.87%、2.58%、7.74%、6.45%(圖2)。PC 和TAG 的總構成比高達57.42%,表明PC 和TAG 的代謝紊亂可能與CRC 的癌變機制有關。另外,相對于NR組,大多數差異脂質在CRC組血清中表達均呈顯著下調,只有9個差異脂質在CRC組血清中表達呈顯著上調。

      圖2 不同類別差異脂質的構成分布Fig.2 Component distribution of differential lipids DAG:diacylglycerol(甘油二酯);TAG:triacylglycerol(甘油三酯);PC:phosphatidylcholine(磷脂酰膽堿);LPC:lysophosphatidylcholine(溶血磷脂酰膽堿);LPE:lysophosphatidylethanolamine(溶血磷脂酰乙醇胺);SM:sphingomyelin(鞘磷脂);PE:phosphatidylethanolamine(磷脂酰乙醇胺);PI:phosphatidylinositol(磷脂酰肌醇);Cer:ceramide(神經酰胺);FA:fatty acid(脂肪酸)

      基于以上篩選的差異脂質,采用受試者工作特征曲線(ROC)的曲線下面積(AUC)值評估其對CRC 的診斷能力,根據AUC >0.80 篩選CRC 潛在診斷脂質標志物。在ROC 分析中,發(fā)現9 個潛在脂質生物標志物具有良好的CRC 診斷能力(AUC >0.80),包括棕櫚酰乙醇胺、棕櫚酸、鞘氨醇、SM d40∶3、SM d36∶0、TAG 58∶1、PC 34∶2、PC 36∶6 和PC 38∶7,其AUC 值分別為1.00、0.86、0.81、0.85、0.81、0.89、0.81、0.87 和0.83。其中,棕櫚酰乙醇胺具有最高的AUC 值(為1.00),表明其對CRC的診斷效能突出,而SM d36∶0、PC34∶2和鞘氨醇的AUC 值則相對較低,均為0.81。mzCloud 和LipidBlast 脂質數據庫匹配的鑒定結果如圖3 所示,鑒定效果良好??傮w上,上述9 種差異脂質對CRC 均呈現良好的診斷效能,可作為CRC的候選診斷標志物。

      圖3 9種高診斷效能差異脂質的鑒定過程Fig.3 Identification of 9 differential lipids with high diagnostic ability

      為進一步對以上9種差異脂質進行確認,采用脂質標準品的母離子及其碎裂信息與數據庫一級和二級質譜圖信息進行匹配,同時比較其與實際樣品保留時間的誤差。由于目前缺乏SM d40∶3、SM d36∶0、TAG 58∶1、PC 34∶2、PC 36∶6、PC 38∶7商品化的脂質標準品,因此只對棕櫚酸乙醇胺、棕櫚酸、鞘氨醇3種脂質進行LC-MS/MS驗證。結果發(fā)現,脂質標準品與數據庫的一級和二級質譜圖匹配結果良好,同時其與樣品保留時間的誤差均小于0.1 min(圖3、4),因此,上述3 種差異脂質可作為CRC診斷的潛在血清脂質標志物。

      通過對以上9 種差異脂質的QC 歸一化峰強度進行比較,進一步明確其在組間的水平變化趨勢。結果表明,6 種差異脂質(包括棕櫚酸乙醇胺、棕櫚酸、SM d40∶3、PC 34∶2、SM d36∶0、鞘氨醇)在CRC 組中水平顯著上調,3種差異脂質(包括TAG 58∶1、PC 36∶6、PC 38∶7)在CRC 組中顯著下調,表明對CRC 呈現高診斷效能的潛在標志物主要是在CRC 血清中明顯上調的差異脂質,且主要屬于脂肪酸類、磷脂酰膽堿類和鞘磷脂類脂質成分(圖5)。

      圖4 3種高診斷效能差異脂質的LC-MS/MS驗證Fig.4 Identification of 3 differential lipids with high diagnostic ability by LC-MS/MS method

      圖5 9種高診斷效能差異脂質的組間變化趨勢Fig.5 Change trend of nine differential lipids with high diagnostic ability the relative concentration of differential lipids was presented as mean±SEM

      2.4 討 論

      本研究對NR 和CRC 患者的血清樣本進行脂質組學分析,共發(fā)現155種差異脂質,其中9種差異脂質對CRC 具有良好的診斷效能(AUC >0.80),可作為CRC 的潛在診斷標志物。此外,在差異脂質中,PC和TAG占比高達57.42%,提示這兩類脂質代謝紊亂可能與CRC的形成有關。

      雖然部分研究已報道CRC 患者血漿和組織中潛在的脂質標志物和脂質代謝紊亂。然而,大部分脂質標志物均未被證實,且通過大樣本血清脂質組學探索CRC 診斷生物標志物的研究相對較少。磷脂是脂質的主要成分,參與細胞膜的生成、代謝和細胞信號傳導。磷脂的失調和腫瘤的發(fā)展密切相關[13-14],也是報道最多的針對CRC 診斷的潛在脂質標志物[15-17]。Shen等[11]通過分析25例CRC 患者和10例NR 對照者血漿中的脂質種類,共發(fā)現64種差異脂質,其中PG(34∶0)、SM(42∶2)、Cer(44∶5)、LPC(18∶3)、LPC(18∶2)、PE(O-36∶3)、PE(O-38∶3)和SM(38∶8)被認為是CRC 的潛在脂質標志物,其大部分為磷脂類脂質。同時,PC 已被證實在CRC 細胞系中顯著上調[13],然而,其降解產物LPC 卻在CRC 患者血漿中顯著下調,且與體重減少密切相關[18]。本研究中,磷脂也是主要的差異脂質,在所有差異脂質中,PC 占比最高為30.32%,且其占比為潛在生物標記物的5/9,對CRC 具有良好的診斷性能(AUC >0.80)。因此,磷脂可作為CRC 的潛在生物標志物。此外,磷脂還具有一定的抗腫瘤活性,但其在單一治療研究中的治療潛力較低,仍需要進一步研究證實磷脂在CRC化療中的作用與優(yōu)勢[19]。

      TAG 是細胞膜脂質合成所必需的,也是目前公認的許多癌癥的標志物,它不僅與癌細胞的病理生理特征有關,而且參與腫瘤的產生和惡化[20]。目前,有關血中TAG水平與CRC關系的研究結果仍存在爭議。據報道,血漿或血清的TAG 水平升高與結直腸腺瘤(CRC 重要的癌前病變)的發(fā)病風險密切相關[21-22],而部分研究證明血清或血漿的TAG水平與CRC發(fā)病風險并無明顯關聯[23-24]。另外,CRC組織中TAG 54∶0 的含量相對于良性腺瘤組織顯著下調,而相對于正常組織則顯著上調[25]。晚期結直腸癌患者血漿中的TAG 水平較早期結直腸癌患者升高[20]。本研究發(fā)現差異TAG 對CRC 和NR 組展現良好的區(qū)分性能,且其占所有鑒別差異脂質的27.10%,也是主要的紊亂脂質成分(圖2)。此外,脂肪酸和鞘脂也是CRC 常見的脂類標記物。蠟酸(26∶0)[26]和長鏈脂肪酸[27]只在CRC 血清中存在,其可區(qū)分早期和晚期癌癥[28],或作為CRC 生存的預測指標[29]。文獻顯示,一種質荷比為742.988 69的鞘磷脂可作為監(jiān)測晚期CRC 癌的血漿候選生物標志物[30],本研究也觀察到類似的結果,脂肪酸和鞘脂占所有差異脂質的23.87%,且3 種鞘脂和2 種脂肪酸類脂質對CRC 表現良好的診斷效能。說明TAG、FA 和SM 亦可作為CRC臨床診斷的潛在脂質標志物。

      3 結 論

      CRC 的診斷和治療是降低其死亡率的有效途徑,脂質組學技術在腫瘤診斷標志物和機制探索研究中表現出巨大潛力。本研究利用UHPLC-Q Exactive-Orbitrap MS 技術的高通量和高分辨率優(yōu)勢,結合單因素和多元統(tǒng)計分析揭示CRC 與NR 組的血清脂質譜差異,篩選獲得155 種組間差異脂質,且以PC 和TAG 為主,表明其代謝在CRC 中出現明顯紊亂,可能參與CRC 的形成。此外,ROC 分析發(fā)現共有9種差異脂質對CRC 具有良好的診斷效能,可以選擇其進行聯合使用作為CRC 的診斷標志物。本實驗為深入研究CRC的脂質特征提供了基礎數據,對于CRC的臨床篩查和診斷具有較高的參考價值。但由于臨床樣本數量和脂質標準品的限制,將本發(fā)現應用于臨床尚需進一步驗證。

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