不同臨床特征甲狀腺乳頭狀癌患者BRAFV 600E基因突變情況及其中央?yún)^(qū)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響因素

徐 坤 黨 靜 張曉敏

蘭州大學第二醫(yī)院老年病科，甘肅蘭州 730030

甲狀腺癌是屬內(nèi)分泌惡性腫瘤的一種，近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢。甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺癌常見類型，發(fā)病率可占所有病理類型的80%～90%。雖大部分PTC 惡性程度較低、預(yù)后良好，但仍存在約10%的患者存在轉(zhuǎn)移及復發(fā)，且伴有較高的侵襲性。相關(guān)研究顯示，PTC 中BRAFV600E 基因突變是其常見類型，并認為BRAFV600E 基因突變與腫瘤的發(fā)生、 發(fā)展及預(yù)后中存在較高的相關(guān)性，是引發(fā)PTC 的重要遺傳學改變。鑒于此，本研究選擇蘭州大學第二醫(yī)院老年病科收治的PTC 患者80 例，分析PTCBRAFV600E 基因突變與中央?yún)^(qū)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，以為手術(shù)方案制定等提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年6月至2021年12月蘭州大學第二醫(yī)院老年病科收治的PTC 患者80 例為研究對象，其中男13 例，女67 例；年齡22～73 歲，平均（47.58±3.61）歲；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期62 例，Ⅲ～Ⅳ期18 例。本研獲醫(yī)院倫理委員會批準（批號：2019-A11）。納入標準：均經(jīng)病理學檢查明確診斷；可耐受手術(shù)治療；于手術(shù)治療的同時給予預(yù)防性中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃；病歷資料齊全；患者及家屬均對本次研究知情同意。排除標準：合并其他頭頸部惡性腫瘤；術(shù)前行放、化療治療；術(shù)前頸部淋巴結(jié)檢查見腫大淋巴結(jié)，或發(fā)生腫大的淋巴結(jié)外形規(guī)則，出現(xiàn)沙粒體樣細小鈣化、周邊強化等征象；伴有其他器官遠端轉(zhuǎn)移；凝血及造血功能異常；精神疾病，無法配合完成本次研究者。

1.2 方法

①DNA 提?。喝TC 石蠟存檔的包埋組織，若為合并多發(fā)癌灶患者，則選擇最大腫瘤組織，將其制備成5 張8 m 厚度的連續(xù)切片，分別于第一張及最后一張進行HE 染色，并由病理科醫(yī)師再次明確第一張和最后一張，觀察兩張玻片中是否存在PTC 相關(guān)組織，對照HE 染色切片，刮取中間三張連續(xù)切片相應(yīng)的癌組織區(qū)域，確保每張切片中腫瘤細胞含量超過50%。②DNA 突變基因檢測：應(yīng)用FFPE 樣品DNA 分離試劑盒，提取病變組織的DNA，按照試劑盒說明書相關(guān)要求，在分光光度計下測定DNA 濃度及純度，并將DNA 濃度調(diào)整至100 ng/L。對提取好的DNA 行PCR。PCR 反應(yīng)條件如下：于95℃環(huán)境下預(yù)變性5 min，95℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，共35 個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。BRAF 突變主要表現(xiàn)為V600E 突變，且突變位點單一，應(yīng)用real-time PCR 法進行檢測，觀察BRAF 是否發(fā)生基因突變，該檢測結(jié)果由系統(tǒng)直接呈現(xiàn)，無需檢測人員進行分析。

1.3 觀察指標及評價標準

①分析不同臨床病理特征PTC 患者的BRAFV600E基因突變情況；②分析PTC 中央?yún)^(qū)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的單因素；③分析中央?yún)^(qū)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的多因素。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 不同PTC 臨床病理特征的BRAFV600E 基因突變情況

依據(jù)是否發(fā)生BRAFV600E 基因突變將患者分為陽性組（n=38）和陰性組（n=42）。陽性組腫瘤大小大于陰性組，多灶性腫瘤、包膜外侵、中央?yún)^(qū)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、單側(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率均高于陰性組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 不同PTC 臨床病理特征的BRAFV600E 基因突變情況（例）

2.2 PTC 中央?yún)^(qū)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的單因素分析

依據(jù)中央?yún)^(qū)頸部淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移分為轉(zhuǎn)移組（n=20）及無轉(zhuǎn)移組（n=9）。轉(zhuǎn)移組腫瘤大小大于無轉(zhuǎn)移組，雙側(cè)腫瘤、多灶性腫瘤、包膜侵犯、BRAFV600E 基因突變率均高于無轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表2）。

表2 PTC 中央?yún)^(qū)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的單因素分析（例）

2.3 PTC 中央?yún)^(qū)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的多因素分析

多灶性腫瘤、包膜侵犯、BRAFV600E 基因突變是PTC 中央?yún)^(qū)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立危險因素（P＜0.05）（表3～4）。

表3 影響PTC 中央?yún)^(qū)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的因素賦值情況

表4 PTC 中央?yún)^(qū)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的多因素分析

3 討論

PTC 現(xiàn)已成為高發(fā)的惡性腫瘤，女性發(fā)病率高于男性。目前，對于甲狀腺癌的發(fā)病機制及病因等暫無明確定義，從腫瘤的發(fā)生及發(fā)展來看，其中經(jīng)歷多步驟、多階段、多因素、多基因變異等復雜的生物學演變過程。對病灶組織進行顯微鏡觀察可見其下存在纖維瘢痕組織，排列擁擠、形態(tài)欠規(guī)則、乳頭中心可見同心圓結(jié)構(gòu)的砂粒體等，部分患者病灶形態(tài)特征欠清晰，尤其是濾泡狀排列的病例，在臨床鑒別診斷中需與甲狀腺腫相鑒別。

BRAFV600E 為抑癌基因的一種，其作用原理在于通過p53 的作用達到促進細胞周期抑制因子p21 的進一步表達，并可通過其他途徑快速且準確定位并修復損傷的DNA，以達阻止損傷細胞進入循環(huán)系統(tǒng)。另BRAFV600E 的表達位置可隨細胞周期的變化而變化，并可減弱抑癌作用，進而誘發(fā)甲狀腺癌。相比于BRAFV600E 基因突變陰性患者而言，陽性的PTC 具有更強的侵襲性，發(fā)生中央?yún)^(qū)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移幾率更高。本研究結(jié)果顯示，陽性組腫瘤大小大于陰性組，多灶性腫瘤、包膜外侵、中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、單側(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)均高于陰性組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；轉(zhuǎn)移組腫瘤大小大于無轉(zhuǎn)移組，雙側(cè)腫瘤、多灶性腫瘤、包膜侵犯、BRAF 基因轉(zhuǎn)移發(fā)生率均高于無轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；腫瘤大小、多灶性腫瘤、包膜侵犯、BRAFV600E 基因突變是PTC中央?yún)^(qū)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立危險因素（P＜0.05），究其原因可知BRAFV600E 基因突變與PTC 的病理類型存在明顯相關(guān)性，且腫瘤大小、多灶性腫瘤、包膜侵犯、BRAFV600E 基因突變均可作為預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要因素，在手術(shù)方案制定時需準確評估患者病情，在保護好甲狀旁腺及喉返神經(jīng)的情況下，需做好預(yù)防性頸部淋巴結(jié)清掃，以改善患者預(yù)后。

綜上所述，PTC 腫瘤大小、多灶性腫瘤、包膜侵犯、BRAFV600E 基因突變均可有效預(yù)測中央?yún)^(qū)頸部淋巴結(jié)是否發(fā)生轉(zhuǎn)移，且PTC 患者伴有BRAFV600E 基因突變幾率較高，這與患者病理特征間存在相關(guān)，可將其用于手術(shù)方案的制定。