胃癌患者癌組織中PRKDC、FOXK1和RORα表達(dá)水平與TNM分期及微衛(wèi)星不穩(wěn)定的關(guān)系

徐繪婷，陳冰燕，於瀟瀟，劉紅利

江蘇省南通市腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南通 226000

胃癌屬于消化系統(tǒng)惡性腫瘤，生存率低，是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。截至目前，胃癌的病理機(jī)制尚未完全闡明。因此，探討關(guān)于胃癌發(fā)生發(fā)展調(diào)控的關(guān)鍵分子，有助于早期胃癌的診斷和晚期胃癌的靶向治療。DNA依賴性蛋白激酶基因(PRKDC)是DNA修復(fù)機(jī)制的重要組成部分。PRKDC在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，在多種癌前細(xì)胞中也有異常表達(dá)，提示PRKDC在腫瘤發(fā)生中可能起重要作用[2]。叉頭框K1(FOXK1)是FOX轉(zhuǎn)錄因子的家族成員。其表達(dá)水平升高可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、周期轉(zhuǎn)換等；研究發(fā)現(xiàn)FOXK1在多種實(shí)體瘤中高度表達(dá)，包括胃癌等，參與這些腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[3]。有研究表明FOXK1的表達(dá)水平升高與胃腸道腫瘤的生長和侵襲存在緊密的關(guān)系，可作為此類腫瘤的治療靶點(diǎn)[4]。視黃酸相關(guān)孤兒受體(RORα)在人體脂肪、骨骼肌和腦組織中含量較高[5]，研究發(fā)現(xiàn)，RORα可調(diào)節(jié)糖代謝、炎癥反應(yīng)、癌癥等[6]。微衛(wèi)星狀態(tài)是人類基因組中低于10個核苷酸的短重復(fù)序列，約占總基因的10%。微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)首先在遺傳性非息肉病性直腸癌中發(fā)現(xiàn)，后來在乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌中發(fā)現(xiàn)[7]。目前，MSI在胃癌中被發(fā)現(xiàn)的研究甚少，本研究擬通過探討胃癌患者癌組織中PRKDC、FOXK1和RORα水平與TNM分期及MSI的關(guān)系，旨在為臨床胃癌的診治提供新的方向。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年3月至2021年2月在本院胃腸外科行手術(shù)治療的102例患者，術(shù)后病理檢查結(jié)果均確診為胃腺癌，且無腫瘤家族遺傳史，術(shù)前均未進(jìn)行放化療。其中男64例，女38例；年齡44～76歲，平均(59.17±5.12)歲。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)于2010年制定的胃癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)將所有患者分為Ⅰ期11例、Ⅱ期35例、Ⅲ期56例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)通過病理檢查確診為胃腺癌，符合美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)與國際抗癌聯(lián)盟(UICC)聯(lián)合制定的第7版惡性腫瘤TNM分期、日本第14版《胃癌處理規(guī)約》及我國原衛(wèi)生部2011年版《胃癌診療規(guī)范》的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)術(shù)前未進(jìn)行放化療等相關(guān)治療；(3)臨床資料完整；(4)術(shù)前均進(jìn)行胃鏡檢查；(5)無精神和認(rèn)知障礙。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他腫瘤；(2)手術(shù)切除不完整；(3)患有心、肝、腎等重要臟器功能障礙；(4)不配合研究；(5)中途退出研究。所有患者均簽署知情同意書。本研究符合《赫爾辛基宣言》,經(jīng)本院倫理委員會審批通過。

1.2方法

1.2.1MSI檢測 采用飽和氯化鈉法提取組織DNA。反應(yīng)體積為20 μL，含引物0.4 μmol/L，10×變性裂解緩沖液2 μL，脫氧核糖核苷三磷酸200 mmol/L，TaqDNA聚合酶1單位，基因組DNA 200 ng。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，共35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物按1∶5的比例與變性裂解緩沖液混合。97 ℃變性10 min，立即將放入冰水中。160 g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳4 h，電泳后銀染。如果與正常組織相比，胃癌和癌前病變組織中有額外的DNA等位片段或等位片段游動，則可判斷為MSI。如果沒有，則是微衛(wèi)星穩(wěn)定(MSS)。

1.2.2PRKDC、FOXK1、RORα表達(dá)水平檢測 將固定在10%中性甲醛溶液中并包埋在石蠟中的樣品切成4 μm厚的薄片，用二甲苯脫蠟并逐漸用乙醇水合。切片在檸檬酸鈉緩沖液中煮沸15 min以進(jìn)行抗原修復(fù)。在3%雙氧水中浸泡10 min，去除內(nèi)源性酶。每片組織加50 μL山羊血清，封閉半小時。棄山羊血清，分別加入50 μL兔抗人PRKDC單克隆抗體、鼠抗人FOXK1單克隆抗體、RORα一抗孵育，4 ℃過夜。第2天，棄一抗后，加入二抗，孵育半小時，滴下DAB顯色劑，顯微鏡下觀察組織顏色。后蘇木精復(fù)染。依次經(jīng)70%、80%、90%、95%無水乙醇各5 min，二甲苯20 min后，用中性樹脂封膜。在顯微鏡下觀察PRKDC、FOXK1和RORα蛋白表達(dá)水平。

1.2.3結(jié)果判定 由3位醫(yī)生分別進(jìn)行閱片，并對不同意見的病例進(jìn)行了觀察和討論，以達(dá)成一致意見。根據(jù)染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞百分率進(jìn)行表達(dá)水平評估。隨機(jī)選取3個10×物鏡大小的視野進(jìn)行腫瘤細(xì)胞免疫染色半定量評估：0分為陰性，1分為弱陽性，2分為中等陽性，3分為強(qiáng)陽性；染色范圍等級得分：0～1%為0分；>1%～25%為1分；>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%～100%為4分；根據(jù)上述兩項得分的總和，將其分為3組：0～1分為陰性表達(dá)，>1～4分為弱陽性表達(dá)，>4～7分為強(qiáng)陽性表達(dá)。陽性表達(dá)包括弱陽性表達(dá)和強(qiáng)陽性表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1各期胃癌患者癌組織中PRKDC、FOXK1和RORα表達(dá)情況比較 Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期胃癌患者癌組織PRKDC、FOXK1、RORα表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，胃癌患者癌組織的PRKDC、FOXK1表達(dá)水平：Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期，胃癌患者癌組織的RORα表達(dá)水平：Ⅰ期>Ⅱ期>Ⅲ期，見表1。

表1 各期胃癌患者癌組織中PRKDC、FOXK1和RORα表達(dá)水平比較分)

2.2胃癌患者癌組織中PRKDC、FOXK1和RORα表達(dá)水平與TNM分期的關(guān)系 以胃癌患者TNM分期(定義“Ⅰ期”=1，“Ⅱ期”=2，“Ⅲ期”=3)作為因變量，將各期患者的癌組織中PRKDC、FOXK1和RORα表達(dá)水平作為自變量，納入多元線性回歸模型，結(jié)果顯示，胃癌患者癌組織中PRKDC、RORα與TNM分期均存在相關(guān)性(P<0.05),見表2。

表2 胃癌患者癌組織中PRKDC、FOXK1和RORα水平與TNM分期的關(guān)系

2.3MSS組和MSI組胃癌患者癌組織中PRKDC、FOXK1和RORα表達(dá)情況比較 根據(jù)MSI檢測結(jié)果為2個組：MSS組52例，MSI組50例。MSS組胃癌患者癌組織中PRKDC、FOXK1表達(dá)水平均低于MSI組(P<0.05)，RORα表達(dá)水平高于MSI組(P<0.05)，見表3。

表3 MSS組和MSI組癌組織中PRKDC、FOXK1和RORα表達(dá)水平比較分)

2.4MSS組和MSI組胃癌患者癌組織中PRKDC、FOXK1和RORα免疫組化染色情況 PRKDC的陽性表達(dá)主要表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)不同程度著色，高表達(dá)時亦會出現(xiàn)細(xì)胞核染色；MSS組PRKDC陽性表達(dá)率為26.92%(14/52)，MSI組PRKDC陽性表達(dá)率為78.00%(39/50)；MSI組PRKDC的陽性表達(dá)率高于MSS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。FOXK1的陽性表達(dá)主要表現(xiàn)為細(xì)胞核著色；MSI組FOXK1陽性表達(dá)率為72.00%(36/50)；MSS組FOXK1陽性表達(dá)率為5.77%(3/52)；MSI組FOXK1陽性表達(dá)率高于MSS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MSS組中RORα的染色強(qiáng)度高于MSI組。見圖1。

注：A為MSS組PRKDC染色情況；B為MSI組PRKDC染色情況；C為MSS組FOXK1染色情況；D為MSI組FOXK1染色情況;E為MSS組RORα染色情況；F為MSI組RORα染色情況。

2.5胃癌患者癌組織中PRKDC、FOXK1和RORα水平與MSI的關(guān)系 以MSI情況(定義“MSS組”=1，“MSI組”=2)作為因變量，將兩組患者的癌組織中PRKDC、FOXK1和RORα表達(dá)水平作為自變量，納入多元線性回歸模型，結(jié)果顯示，胃癌患者癌組織中PRKDC、FOXK1表達(dá)水平與MSI均存在相關(guān)性(P<0.05),見表4。

表4 胃癌患者癌組織中PRKDC、FOXK1和RORα水平與MSI的關(guān)系

3 討 論

胃癌高病死率的原因之一是大部分患者被診斷時已為晚期，錯過了最佳治療時機(jī)[8]。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌的標(biāo)志之一是基因組的不穩(wěn)定性，這與DNA損傷存在緊密的關(guān)系[9]。在DNA損傷的情況下，細(xì)胞周期可能受信號通路影響，使得細(xì)胞增殖減少。而在腫瘤細(xì)胞中，DNA損傷修復(fù)途徑一般被破壞，導(dǎo)致腫瘤[10]。胃癌是一種病理機(jī)制復(fù)雜的惡性腫瘤。侵襲和轉(zhuǎn)移是胃癌患者死亡和復(fù)發(fā)的主因。胃癌轉(zhuǎn)移的途徑有包括直接擴(kuò)散、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移等。以上各途徑都與很多促進(jìn)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的基因有關(guān)，這些基因參與細(xì)胞遷移、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞外基質(zhì)降解等過程[11]。因此，探索預(yù)測胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的基因?qū)ξ赴┣忠u轉(zhuǎn)移的早期診斷和預(yù)后判斷具有重要的臨床意義。

PRKDC是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是DNA損傷修復(fù)的關(guān)鍵酶。除修復(fù)雙鏈DNA斷裂外，其還參與調(diào)節(jié)DNA復(fù)制、T細(xì)胞表面抗原受體重組等[12]。作為一種轉(zhuǎn)錄因子，PRKDC調(diào)節(jié)某些基因表達(dá)，在細(xì)胞程序性死亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)PRKDC表達(dá)水平升高，與進(jìn)展期胃癌和不良預(yù)后有關(guān)[14]。FOXK1作為FOX家族的成員，其在癌癥中的作用有待解釋[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXK1具有癌基因功能，F(xiàn)OXK1的表達(dá)水平升高可能促進(jìn)胃癌的侵襲[16]。因此，F(xiàn)OXK1可作為一種生物標(biāo)志物來辨別具有更多侵襲性表型的胃癌。惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與癌基因的表達(dá)密切相關(guān)。體細(xì)胞的惡性增殖是惡性腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)，RORα可參與內(nèi)源性凋亡途徑，RORα通過調(diào)節(jié)芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)樣蛋白1基因、時鐘基因的表達(dá)，激活大量凋亡蛋白，導(dǎo)致相關(guān)凋亡因子的表達(dá)，使細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的進(jìn)展[17]。RORα參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡[18]。

本研究結(jié)果顯示，胃癌患者癌組織的PRKDC、FOXK1表達(dá)水平：Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期，胃癌患者癌組織的RORα表達(dá)水平：Ⅰ期>Ⅱ期>Ⅲ期，提示不同TNM分期的胃癌患者其癌組織的PRKDC、FOXK1、RORα表達(dá)水平存在差異，且PRKDC、FOXK1表達(dá)隨TNM分期的增加而不斷降低，RORα表達(dá)水平隨TNM分期的增加而不斷升高。進(jìn)一步分析顯示，胃癌患者癌組織中PRKDC、RORα與TNM分期均存在相關(guān)性(P<0.05),提示PRKDC、RORα可作為TNM分期的預(yù)測因子，隨著浸潤的加深，PRKDC的表達(dá)水平逐漸升高。腫瘤分化程度越低，PRKDC的表達(dá)水平越高，可能與絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸化激酶的活性有關(guān)。PRKDC可介導(dǎo)腫瘤侵襲相關(guān)的多條信號通路，促進(jìn)腫瘤侵襲[19]。有課題組應(yīng)用免疫組化染色等實(shí)驗(yàn)證實(shí)RORα在人體胃癌組織中表達(dá)水平顯著降低，并且其表達(dá)水平與人體胃癌組織的TNM分期顯著相關(guān)[20]，表明RORα的低表達(dá)可能參與胃癌的發(fā)生和發(fā)展，與本研究結(jié)果一致。胃癌的特征是宿主的遺傳不穩(wěn)定性，包括癌基因激活和MSI。由于MSI在直腸癌和遺傳性非息肉病中發(fā)現(xiàn)，在肺癌、食管癌和子宮癌中也有報道，提示MSI也可能參與胃癌的發(fā)生和發(fā)展。MSI是一種短重復(fù)DNA序列(微衛(wèi)星)，發(fā)生高頻缺失或插入，其是由基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄時錯配修復(fù)系統(tǒng)發(fā)生缺陷引起的，當(dāng)這些蛋白基因發(fā)生突變時，會沉默相關(guān)蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致MSI并誘發(fā)腫瘤[21]，本研究結(jié)果顯示，MSS組胃癌患者癌組織中PRKDC、FOXK1表達(dá)水平均低于MSI組(P<0.05)，RORα高于MSI組(P<0.05)，提示MSI的胃癌患者癌組織中PRKDC、FOXK1表達(dá)水平會升高，RORα表達(dá)水平會降低，進(jìn)一步相關(guān)性分析結(jié)果顯示，胃癌患者癌組織中PRKDC、FOXK1與MSI均存在相關(guān)性(P<0.05)，提示PRKDC、FOXK1可作為胃癌患者M(jìn)SI的預(yù)測因子。

綜上所述，不同TNM分期的胃癌患者其癌組織的PRKDC、FOXK1、RORα表達(dá)水平存在差異，胃癌患者癌組織中PRKDC、RORα與TNM分期均存在相關(guān)性。MSI的胃癌患者癌組織中PRKDC、FOXK1表達(dá)水平會升高，RORα表達(dá)水平會降低，胃癌患者癌組織中PRKDC、FOXK1表達(dá)水平與MSI均存在相關(guān)性。