不同翅型棉蚜體內(nèi)細(xì)菌群落組成和多樣性分析

史慶雨，李東陽，王麗，高雪珂，張開心，朱香鎮(zhèn)，姬繼超，雒珺瑜

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/ 棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南安陽 455000）

棉蚜（Aphis gossypii）屬半翅目蚜科，是世界性分布害蟲，可危害多種寄主植物，也是危害棉花作物的重要害蟲之一[1]。 它通過刺吸式口器取食植物汁液從而影響植物生長發(fā)育，且可在不同寄主間轉(zhuǎn)移導(dǎo)致植物病毒的傳播，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害[2]。

翅多型是相同基因型個(gè)體產(chǎn)生有（長）翅型和無（短）翅型不同形態(tài)的現(xiàn)象，是昆蟲在繁殖與飛行擴(kuò)散間權(quán)衡的一種策略[3]。 翅多型現(xiàn)象使得昆蟲能更好地適應(yīng)多變的生存環(huán)境，對(duì)種群環(huán)境適應(yīng)性進(jìn)化有著重要意義[4-5]。 如：沙蟋（Gryllus firmus）長翅型成蟲主要進(jìn)行遠(yuǎn)距離遷徙，而短翅型成蟲主要進(jìn)行快速繁殖[6]；不同環(huán)境下褐飛虱（Nilaparvata lugens）可分化為長翅型和短翅型，長翅型具有季節(jié)性遠(yuǎn)距離遷飛習(xí)性，而短翅型具有產(chǎn)卵前期短、壽命長等特點(diǎn)[7]；飛蝗（Locusta migratoria）在高密度下會(huì)出現(xiàn)群居型，低密度下則會(huì)出現(xiàn)散居型，群居型翅長，散居型翅短[8]；蚜蟲因種群密度和營養(yǎng)條件可分化為有翅型和無翅型2 種形態(tài)， 有翅型有強(qiáng)壯的飛行肌和翅，而無翅型具有快速繁殖的能力。 食物不充足或者棉蚜種群密度過大等因素均會(huì)誘導(dǎo)大量有翅蚜產(chǎn)生，以遷徙尋找更好的生存環(huán)境。 綜上所述，種群密度和植物營養(yǎng)是影響翅多型的主要因素[9-10]。翅多型調(diào)控機(jī)理更是研究熱點(diǎn)之一，例如：褐飛虱中胰島素和c-Jun 氨基端激酶 （c-Jun N-terminal kinase,JNK） 信號(hào)通路介導(dǎo)褐飛虱翅型多樣性；在豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）中蛻皮激素信號(hào)通路影響翅型分化[11-13]。

共生菌分為初生共生菌和次生共生菌，初生共生菌一般是宿主生長發(fā)育所必需的，次生共生菌一般與宿主的適應(yīng)性有關(guān)[14]。 共生菌可以給宿主提供營養(yǎng)、促進(jìn)新陳代謝、影響生長發(fā)育、影響昆蟲的行為[15]。沃爾巴克氏體（Wolbachia）是一種立克氏體，1936 年才被命名， 對(duì)宿主生殖活動(dòng)起重要調(diào)控作用， 主要包括誘導(dǎo)宿主的胞質(zhì)不親和、孤雌生殖、雌性化、雄性致死等[16]。 研究表明，共生菌參與調(diào)控昆蟲翅型分化[17]。 對(duì)長翅型以及短翅型埃及扁胸切葉蟻（Vollenhovia emeryi）進(jìn)行微生物多樣性分析發(fā)現(xiàn)，所有長翅型均攜帶沃爾巴克氏體，而所有短翅型均不攜帶沃爾巴克氏體，推測(cè)沃爾巴克氏體可能參與翅型分化的調(diào)控[18]。 然而，微生物參與蚜蟲翅型分化作用機(jī)理的研究并不深入。 Reyes 等[19]在對(duì)比3 種次生共生 菌Serratia symbiotica、Hamiltonella defensa和Regiella insecticola對(duì)豌豆蚜后代有翅蚜產(chǎn)生的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)R.insecticola對(duì)有翅后代的影響最大；Shang 等[20]對(duì)褐色橘蚜（Aphis citricidus）有翅和無翅成蟲體內(nèi)細(xì)菌進(jìn)行16S 核糖體RNA（ribosome RNA,rRNA)測(cè)序，發(fā)現(xiàn)無翅成蟲具有較高的細(xì)菌多樣性。

分子生物學(xué)和高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為細(xì)菌群落特征鑒定提供了新方法[21]。 對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）擴(kuò)增的細(xì)菌16S rRNA 片段進(jìn)行測(cè)序， 可以檢測(cè)到樣本中存在的大多數(shù)細(xì)菌群落，是研究蚜蟲微生物群落的一種高效方法[22-24]。 利用高通量測(cè)序技術(shù)能夠研究不同生物體的整個(gè)微生物群落，Zepeda-Paulo等[25]通過16S rRNA 擴(kuò)增子測(cè)序檢測(cè)了麥長管蚜（Sitobion avenae） 和禾谷縊管蚜（Rhopalosiphum padi）的細(xì)菌群落多樣性，并發(fā)現(xiàn)蚜蟲具有作為植物致病菌載體或替代宿主的潛在作用。

為明確有翅型與無翅型棉蚜成蟲體內(nèi)細(xì)菌群落的差異，本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)2 組樣品16S rRNA 擴(kuò)增子進(jìn)行檢測(cè)， 從而獲得棉蚜有翅、 無翅型體內(nèi)細(xì)菌的組成與結(jié)構(gòu)， 并比較2組棉蚜樣品體內(nèi)細(xì)菌群落間的差異，為后續(xù)探究體內(nèi)細(xì)菌在棉蚜翅型分化中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

供試棉蚜采集于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)試驗(yàn)棉田棉花上， 于中棉所49 的離體棉花子葉上單頭飼養(yǎng)建立單克隆種群。 飼養(yǎng)條件為：26 ℃±1℃，光周期為14 h（光照）/10 h（黑暗），相對(duì)濕度70%～80%。 所用的有翅型和無翅型棉蚜，均源于同一個(gè)單克隆。

1.2 樣品收集

通過高種群密度誘導(dǎo)棉蚜產(chǎn)生有翅蚜，通過低種群密度使棉蚜保持無翅狀態(tài)[26]。 在實(shí)驗(yàn)室中通過離體棉花子葉進(jìn)行棉蚜的飼養(yǎng)，收集無翅蚜?xí)r，每片離體棉花子葉上均放置20 頭1 齡若蚜；收集有翅蚜?xí)r， 每片離體棉花子葉上均放置100頭1 齡若蚜，分別收集2 日齡有翅棉蚜成蚜與無翅棉蚜成蚜， 然后依次用75%（體積分?jǐn)?shù)） 的乙醇、磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）和超純水清洗3 次（每次5 min）。 有翅蚜與無翅蚜各4 個(gè)生物重復(fù)，每個(gè)重復(fù)有30 頭成蚜。 將有翅型棉蚜4 個(gè)重復(fù)分別命名為AL_1、AL_2、AL_3、AL_4，無翅型棉蚜4 個(gè)重復(fù)命名為AP_1、AP_2、AP_3、AP_4。

1.3 DNA 提取和PCR 擴(kuò)增

使用天根血液試劑盒（DP304）分別提取無翅蚜和有翅蚜蟲體總DNA。 采用1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA 質(zhì)量， 用NanoDrop 2000 微量紫外分光光度計(jì)（Thermo，美國）測(cè)定DNA 的最終質(zhì)量濃度。 使用通用引物（338F:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'，806R:5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'） 擴(kuò)增樣本中16S rRNA 基因V3～V4 可變區(qū)序列[27]。所用儀器為GeneAmp 9700 熱循環(huán)PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems 公司，美國)。 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)35 次；72 ℃延伸10 min。 擴(kuò)增體系為20 μL，其中模板DNA 10 ng，每種引物0.8 μL（5 μmol·L－1），2.5 mmol·L－1的4 種脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate,dNTP）各0.5 μL，4 μL 5×FastPfu 緩 沖 液，0.4 μL FastPfu 聚合酶，最后添加無菌水至20 μL。

1.4 Illumina 測(cè)序和數(shù)據(jù)處理

測(cè)序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成，所用平臺(tái)為Illumina MiSeq，測(cè)序平均長度為429 bp。 采用Fastp 對(duì)原始序列進(jìn)行質(zhì)控：1）過濾讀長（reads）尾部質(zhì)量值20 以下的堿基，設(shè)置50 bp 的窗口， 如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質(zhì)控后50 bp以下的讀長，去除含N 堿基的讀長；2）根據(jù)雙端（paired-end,PE ）測(cè)序讀長之間的重疊（Overlap）關(guān)系，將成對(duì)讀長拼接成1 條序列，最小重疊長度為10 bp；3） 拼接序列時(shí)允許重疊區(qū)最大錯(cuò)配率為0.2，篩除無法拼接的序列；4）根據(jù)序列首尾兩端的識(shí)別碼（Barcode）和引物區(qū)分樣品，并調(diào)整序列方向，允許的barcode 錯(cuò)配數(shù)為0，引物錯(cuò)配數(shù)為2。 使用UPARSE（v7.1，http://drive5.com/uparse/）在97%的相似性水平下對(duì)所有序列進(jìn)行運(yùn)算分類單元（operational taxonomic unit,OTU）生物信息統(tǒng)計(jì)分析[28]。 利用UCHIME（http://drive5.com/uchime/）鑒定并移除嵌合序列[29]。 通過威爾科克森秩和檢驗(yàn)（Wilcoxon's rank-sum test）進(jìn)行差異顯著性分析， 并用偽發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）對(duì)概率（P）進(jìn)行檢驗(yàn)校正[30]。利用閾值FDR＜0.01 和P＜0.05，在OTU 水平上鑒定有翅蚜和無翅蚜體內(nèi)細(xì)菌相對(duì)豐度的差異顯著性。

1.5 多樣性分析方法

根據(jù)OTU 利用軟件Mothurs （v1.30，http://www.mothur.org）采用Shannon 和Chao 1 指數(shù)[31]進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析。采用主坐標(biāo)分析（principal coordinatesanalysis,PCoA）和主成分分析（principle component analysis, PCA）對(duì)不同數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化[32]。 使用RDP classifier（https://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/）在Silva（SSU128）16SrRNA數(shù)據(jù)庫中以70%的置信度分析每個(gè)16S rRNA 基因序列的分類[33]；整理分析從屬到門的OTU 水平上的細(xì)菌相對(duì)豐度（某屬細(xì)菌在有翅與無翅棉蚜體內(nèi)細(xì)菌中的占比） 分布， 并使用Microsoft Excel 制作屬水平上群落相對(duì)豐度柱狀圖； 采用威爾科克森秩和檢驗(yàn)方法在屬水平上對(duì)有翅型棉蚜和無翅型棉蚜體內(nèi)細(xì)菌的相對(duì)豐度進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)為0.05[34]。對(duì)相似性水平為97%的屬到門水平的樣品， 使用R 語言（v3.3.1）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和維恩圖（Venn diagram）制作。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

為了研究已鑒定的棉蚜OTU 的進(jìn)化關(guān)系，使用ClustalW 在默認(rèn)設(shè)置下對(duì)16S rDNA 序列進(jìn)行比對(duì)。 基于比對(duì)結(jié)果在Mega（v5.05）中使用鄰接法（neighbor-joining,NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，設(shè)置自展值（bootstrap value）為1 000[35]。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rDNA 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

在Illunina Miseq PE 300 平臺(tái)上對(duì)有翅型與無翅型棉蚜體內(nèi)細(xì)菌16S rRNA 基因V3～V4 區(qū)進(jìn)行測(cè)序， 共得到360 461 條高質(zhì)量讀長， 全長154 598 655 bp，平均長度約為429 bp（表1）。 為去除微量的差異，對(duì)所有的樣本按照最小樣本數(shù)進(jìn)行抽平， 并基于97%的序列相似性進(jìn)行OTU聚類。 通過Shannon 指數(shù)和Chao 1 指數(shù)稀釋曲線對(duì)樣本進(jìn)行物種多樣性評(píng)估，曲線在樣品讀長數(shù)下均能趨于平穩(wěn)（圖1A、1B），表明測(cè)序樣本量足夠，可在此基礎(chǔ)上進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 各樣本質(zhì)控后的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistical data of each sample after quality control

圖1有翅（AL）和無翅（AP）棉蚜體內(nèi)細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)稀釋曲線和樣本聚類分析結(jié)果Fig. 1 Rarefaction curves from α-diversity indices and samples cluster analysis plot of bacteria communities from alate (AL) and apterous (AP) morphs of A. gossypii

2.2 物種注釋與分析

2 組棉蚜樣本共聚類到234 個(gè)OTU， 這些OTU 按分類階元可劃分為16 門、32 綱、64 目、107 科、148 屬、187 種。 在門水平上，變形菌門（Proteobacteria）為優(yōu)勢(shì)菌門（相對(duì)豐度99.55%）；在綱水平上，丙型變形菌綱（Gammaproteobacteria）為優(yōu)勢(shì)菌綱（相對(duì)豐度99.50%）；在目水平上，腸桿菌目（Enterobacteriales）為優(yōu)勢(shì)菌目（相對(duì)豐度99.46%）； 在科水平上， 腸桿菌科（Enterobacteriaceae）為優(yōu)勢(shì)菌科（相對(duì)豐度99.46%）（表2）。

表2 棉蚜體內(nèi)細(xì)菌在不同分類水平上的組成Table 2 Community composition of bacteria in A. gossypii at different taxonomic levels considering both alate and apterous morphs

2.3 棉蚜體內(nèi)主要細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

選取相對(duì)豐度前100 個(gè)OTU 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建， 在門水平上發(fā)育樹一共有10 個(gè)分支，分別為放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）、酸桿菌門（Acidobacteria）、單糖菌門（Saccharibacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）和變形菌門。 其中：變形菌門為門水平上最大類群，包含34 個(gè)OTU；其次為放線菌門，包含31 個(gè)OTU（圖2）。

圖2 基于OTU 的棉蚜體內(nèi)主要細(xì)菌系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of bacteria in A. gossypii based on OTU sequence

2.4 有翅和無翅型體內(nèi)細(xì)菌多樣性的對(duì)比

通過PCA、PCoA 分析發(fā)現(xiàn)： 有翅型棉蚜4個(gè)重復(fù)和無翅型棉蚜4 個(gè)重復(fù)各形成1 個(gè)類群（圖1C、D）。 鑒定出的234 個(gè)OTU 中，有翅型棉蚜體內(nèi)細(xì)菌多樣性相對(duì)較低， 僅有143 個(gè)OTU，隸屬于14 門、26 綱、45 目、72 科、97 屬、120 種；無翅型棉蚜體內(nèi)細(xì)菌多樣性較高， 共有172 個(gè)OTU， 隸屬于12 門、23 綱、50 目、82 科、106 屬、136 種。 維恩圖（圖3）顯示，無翅型棉蚜特有的OTU 隸 屬 于2 門、6 綱、19 目、35 科、51 屬、67種，有翅型棉蚜特有的OTU 隸屬于4 門、9 綱、14目、25 科、42 屬、51 種， 有10 門、17 綱、31 目、47科、55 屬、69 種為無翅型、有翅型棉蚜所共有。 在門水平上， 無翅型棉蚜特有的是脫鐵桿菌門（Deferribacteres）和儉菌總門（Parcubacteria），有翅型棉蚜特有的是硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、浮霉菌門（Planctomycetes）、梭桿菌門和未定義門（Unclassified），兩者共有的為放線菌門、厚壁菌門、藍(lán)藻門、變形菌門等10 個(gè)門；在綱水平上，無翅型棉蚜特有的為脫鐵桿菌綱（Deferribacteres）、δ- 變 形 菌 綱（Deltaproteobacteria）、ε- 變 形 菌 綱（Epsilonproteobacteria） 等6 個(gè)綱， 有翅型棉蚜特有的為浮霉菌綱（Planctomycetacia）、硝化螺旋菌綱（Nitrospira）、綠彎菌綱（Chloroflexia）等9 個(gè)綱，而共有的為β- 變形菌綱（Betaproteobacteria）、擬桿菌綱（Bacteroidia）、丙型變形菌綱等17 個(gè)綱。

圖3 有翅與無翅棉蚜各分類水平的細(xì)菌群落維恩圖Fig. 3 Venn diagram of community of bacteria from alate and apterous morphs of A. gossypii at different classification levels

在屬水平上，有翅型和無翅型棉蚜體內(nèi)細(xì)菌群落中，布赫納氏菌屬（Buchnera）所占比例最高， 在有翅型棉蚜體內(nèi)細(xì)菌中平均占比為99.6%， 在無翅型棉蚜體內(nèi)細(xì)菌中平均占比為99.5%。 其次是紅球菌屬（Rhodococcus），在有翅型和無翅型棉蚜成蟲中分別占0.136%和0.078%（圖4A）。 在2 種翅型的棉蚜中，多種細(xì)菌的豐度具有顯著差異， 紅球菌屬在有翅型棉蚜中的相對(duì)豐度顯著高于其在無翅型棉蚜中的相對(duì)豐度，而未分類- 藍(lán)藻綱（“未分類”表示該綱的未分類屬） 在有翅型棉蚜中的相對(duì)豐度（0.005%）顯著低于其在無翅型棉蚜中的相對(duì)豐度（0.024%）（圖4B）。

3 討論

共生菌與宿主存在互利共生關(guān)系， 在昆蟲的生長發(fā)育、繁殖、寄主適應(yīng)等過程中發(fā)揮重要作用，是最近研究的熱點(diǎn)[36]。 共生菌在沙漠蝗（Schistocerca gregaria）腸道產(chǎn)生一些對(duì)其有益的酚類物質(zhì)能夠抗菌和防御病原體[37]；吳玉新 等[38]研 究 發(fā) 現(xiàn) 桃 蚜（Myzus persicae） 與 其 共生菌存在協(xié)同進(jìn)化的關(guān)系。 研究發(fā)現(xiàn)，宿主的表型是由其基因組和微生物基因組共同決定的[39]。 近年的研究表明，許多微生物參與宿主各種表型可塑性，其中一些微生物似乎與蚜蟲的翅多型現(xiàn)象有關(guān)[40]。 為了更好地了解棉蚜體內(nèi)細(xì)菌群落與翅多型之間的關(guān)系，本研究對(duì)有翅型與無翅型棉蚜體內(nèi)細(xì)菌群落進(jìn)行測(cè)序，分析有翅與無翅2 種翅型棉蚜體內(nèi)細(xì)菌的多樣性與豐度差異。 本研究共鑒定出棉蚜體內(nèi)細(xì)菌187 種，其中有翅蚜特有的為51 種，無翅蚜特有的為67 種。

在16S rRNA 基因序列高通量測(cè)序中， 布赫納氏菌屬是棉蚜優(yōu)勢(shì)菌屬，在2 組樣品中平均相對(duì)豐度均最高，這與Shang 等[20]的研究一致。布赫納氏菌為初級(jí)共生細(xì)菌，在蚜蟲宿主體內(nèi)經(jīng)歷了長期的平行進(jìn)化，參與蚜蟲生長發(fā)育和繁殖等主要生命活動(dòng)[41]。它可以影響麥長管蚜翅的可塑性，為宿主提供生長發(fā)育的必需氨基酸[17,42]。 布赫納氏菌屬在有翅型棉蚜中的相對(duì)豐度為99.6%，在無翅型棉蚜中的相對(duì)豐度為99.5%，差異不顯著。這一結(jié)果與Hardie 等[43]的研究結(jié)果相悖，可能是因?yàn)槲锓N的差異，也可能是因?yàn)闇y(cè)序手段存在一定的局限性。 紅球菌屬在有翅型棉蚜中的相對(duì)豐度為0.136%， 而在無翅型棉蚜中的相對(duì)豐度為0.078%，在2 種翅型棉蚜中的相對(duì)豐度存在顯著差異； 雖然藍(lán)藻綱細(xì)菌在棉蚜中的相對(duì)豐度低，但其在2 種翅型棉蚜中的相對(duì)豐度具有顯著差異（圖4B）。 對(duì)昆蟲中紅球菌屬細(xì)菌的研究不多，在蚜蟲中的相關(guān)研究更是寥寥無幾。 本研究中紅球菌屬在2 種翅型棉蚜中的相對(duì)豐度不高卻存在顯著差異，這是否與棉蚜翅型分化存在聯(lián)系有待驗(yàn)證。

圖4 有翅型和無翅型棉蚜在屬水平上的細(xì)菌多樣性差異Fig. 4 The difference of diversity of bacteria on genus level in alate and apterous morphs of A. gossypii

4 結(jié)論

本研究分析了有翅型與無翅型棉蚜體內(nèi)細(xì)菌群落的差異，以探究其與宿主翅型分化之間的聯(lián)系。 結(jié)果顯示：無翅型棉蚜成蟲的體內(nèi)細(xì)菌群落多樣性高于有翅型棉蚜成蟲；在棉蚜有翅型與無翅型成蟲中都含有大量布赫納氏菌屬細(xì)菌，且有翅型棉蚜成蟲體內(nèi)布赫納氏菌屬的相對(duì)豐度略高；在2 種翅型棉蚜中均檢測(cè)到一定含量的紅球菌屬細(xì)菌，并且該菌屬在2 種翅型棉蚜中的相對(duì)豐度存在顯著差異。