陸地棉基因GhMIPS1A 的克隆及功能分析

徐婷婷，張弛，馮震，劉其寶，李黎貝，俞嘯天，張雅楠，喻樹迅,2*

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)/ 省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 311300；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南安陽 455000）

肌醇（myo-inositol），又稱環(huán)己六醇，分子式是C6H12O6，結(jié)構(gòu)類似于葡萄糖。 大量研究表明，肌醇是植物生長發(fā)育所必需的[1]，可以作為重要的前體和原料，廣泛參與植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的生物合成、生長發(fā)育、細(xì)胞膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、逆境調(diào)節(jié)等多種生命活動[2-4]。肌醇的合成主要分為3 個步驟： 首先D- 葡萄糖在己糖激酶的作用下磷酸化生成D- 葡萄糖-6- 磷酸， 然后D- 葡萄糖-6- 磷酸在肌醇-1- 磷酸合酶（myo-inositol-1-phosphate synthase,MIPS）[5]的作用下環(huán)化生成肌醇-1- 磷酸， 最后肌醇-1- 磷酸在肌醇單磷酸酶的作用下脫磷酸化生成游離的肌醇，其中MIPS 是限速酶，在維持肌醇穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用[6]。 研究表明，MIPS 不僅可以作為限速酶參與肌醇的合成，還可以作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子參與植物的生長發(fā)育[7]。

MIPS 廣泛存在于原核生物和真核生物中，目前已經(jīng)在高等植物、動物、真菌、細(xì)菌等多種生物中被分離并檢測出活性[8]。 已有多項(xiàng)研究表明MIPS 在植物的耐鹽性、耐旱性、生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用[9-10]。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中已鑒定出3 個MIPS基因，分別為AtMIPS1、AtMIPS2、AtMIPS3[11]。 其中，AtMIPS1在種子發(fā)育中起關(guān)鍵作用，缺失AtMIPS1會導(dǎo)致抗壞血酸（ascorbic acid,AsA） 和磷脂酰肌醇含量減少，從而導(dǎo)致子葉出現(xiàn)病斑、葉片卷曲、植株矮化[12]。 通過RNA 干擾技術(shù) （RNA interference, RNAi）抑制馬鈴薯（Solanum tuberosum）中MIPS基因的表達(dá)，會導(dǎo)致葉片形態(tài)變化和塊莖產(chǎn)量降低[13]。利用RNAi 降低蘋果（Malus pumila）中MdMIPS基因的表達(dá)，導(dǎo)致肌醇含量降低，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡，葉和根壞死，最終造成植株死亡，表明MIPS在蘋果中發(fā)揮重要的生理作用[14]。 從1 種鹽生稻（Porteresia coarctata）中分離出MIPS耐鹽基因PINO1， 將該基因轉(zhuǎn)入煙草（Nicotiana tabacum）植株后檢測肌醇含量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草在高鹽環(huán)境中能夠積累更多的肌醇，表明PINO1基因在植物的抗逆中起著關(guān)鍵作用[15]。 轉(zhuǎn)PdMIPS山新楊（Populus davidiana）比野生型山新楊具有更好的鹽脅迫耐受性， 說明PdMIPS基因參與植物抗逆脅迫過程[16]。 在玉米中克隆獲得2 個ZmMIPS基因， 發(fā)現(xiàn)這2 個MIPS基因都能響應(yīng)鹽、干旱等多種非生物脅迫[17]。

棉花（Gossypiumspp.）是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物之一[18]，其中陸地棉（G.hirsutum）因產(chǎn)量高、纖維較長、品質(zhì)較好是重要的栽培種[19]。 目前，高產(chǎn)仍然是棉花育種的主要目標(biāo)[20]。 棉纖維是由胚珠外突起的表皮細(xì)胞分化發(fā)育而來的，纖維突起的密度和衣分呈顯著正相關(guān)。 大量研究表明，棉花產(chǎn)量與衣分有著十分密切的關(guān)系[21]。GhMIPS1D基因在陸地棉纖維細(xì)胞起始期和伸長期早期高水平表達(dá)，且可以有效地彌補(bǔ)擬南芥mips1突變體的生長發(fā)育缺陷[22]。近年來，土壤鹽漬化和干旱等非生物脅迫因素同樣嚴(yán)重制約著棉花產(chǎn)量的提高[23]。因此，利用各種分子育種手段挖掘潛在的有價值的基因并進(jìn)行功能分析，從而提高棉花在逆境中的生存能力和產(chǎn)量顯得尤為重要[24-25]。 研究表明，肌醇的氧化產(chǎn)物D- 葡萄糖醛酸（Dglucuronic acid,GlcA） 可用于細(xì)胞壁果膠類非纖維素化合物和抗壞血酸的合成。 果膠前體、抗壞血酸以及由抗壞血酸過氧化物酶催化的代謝產(chǎn)物在棉纖維伸長發(fā)育中起關(guān)鍵作用[26]。

宿俊吉[27]利用簡化測序的關(guān)聯(lián)分析結(jié)合連鎖分析定位到與陸地棉衣分相關(guān)的候選基因GhMIPS1A（Gh_A02G1268），屬于MIPS基因家族成員， 比對后發(fā)現(xiàn)該基因與擬南芥調(diào)節(jié)胚胎、種子發(fā)育的基因AtMIPS2（AT2G22240）同源。 目前對于MIPS 參與棉纖維發(fā)育過程的調(diào)控機(jī)制研究較少。 因此，本研究從陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系材料TM-1中克隆得到GhMIPS1A基因，通過生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位、擬南芥過表達(dá)試驗(yàn)、病毒誘導(dǎo)的基因沉默 （virus-induced gene silencing,VIGS）技術(shù)和逆境脅迫響應(yīng)分析，對該基因的功能進(jìn)行初步研究，為培育抗逆高產(chǎn)的棉花新品種提供優(yōu)質(zhì)的基因資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

將陸地棉材料TM-1、新陸早18 號、德字棉531 種植于浙江農(nóng)林大學(xué)平山溫室試驗(yàn)基地。 選取新陸早18 號和德字棉531 的根、莖、葉、萼片、花瓣、雄蕊，以及開花前3 d（－3 days post anthesis,－3 DPA）、開花當(dāng)天、開花后3 d 和5 d 的胚珠（5 DPA 及之前纖維與胚珠無法準(zhǔn)確區(qū)分），開花后10 d、15 d 和20 d 的胚珠和纖維用于實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR）分析，每個樣品取3 個生物學(xué)重復(fù)。

使用本生煙（N.benthamiana）進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)化，材料種植于浙江農(nóng)林大學(xué)人工氣候室，溫室的培養(yǎng)條件為：溫度22 ℃，光照16 h/ 黑暗8 h，相對濕度75%。

使用擬南芥哥倫比亞型（Col-0）進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，材料種植于浙江農(nóng)林大學(xué)人工氣候室，培養(yǎng)條件為：溫度25 ℃，光照16 h/ 黑暗8 h，相對濕度50%。

1.2 載體和試劑

所用的載體pBI121、pCAMBIA3301、pCLCr-VA、pCLCrVB 保存于本課題組。大腸桿菌DH5α感受態(tài)、農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101、LBA4404 感受態(tài)購于上海唯地生物公司。 限制性內(nèi)切酶購于NEB 公司。 DNA 提取試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司。 多糖多酚植物的RNA 提取試劑盒、 質(zhì)粒小提試劑盒購于天根生化科技有限公司。GXL DNA Polymerase高保真酶、 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、 熒光試劑TB GreenPremix Ex Taq TMⅡ（Tli RnaseH Plus）購于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。 乙酰丁香酮、2-嗎啉乙磺酸、1/2 MS 固體培養(yǎng)基購于源葉生物。 肌醇提取試劑盒、D- 葡萄糖提取試劑盒購于北京智微科技有限公司。 引物合成和測序由杭州有康生物有限公司完成。 本研究所用引物序列見表1。

表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.3 棉花DNA、RNA 的提取與基因表達(dá)分析

棉花DNA 的提取參考說明書。 參考多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒說明書，提取1.1 中各材料的RNA。 使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成第一條鏈互補(bǔ)DNA（complementary DNA,cDNA）。 將得到的cDNA 加水稀釋50 倍后作為qRT-PCR 模板。 反應(yīng)體系參考試劑盒說明書，使用Stepone Plus Real-time PCR System 儀器檢測分析，每個材料進(jìn)行3 次技術(shù)重復(fù)。以GhHistone 3為棉花的內(nèi)參基因， 以AtUBQ5為擬南芥的內(nèi)參基因。

1.4 陸地棉GhMIPS1A 基因的克隆及生物信息學(xué)分析

從CottonFGD 網(wǎng)站 （http://cottonfgd.org/）獲得Gohir.A02G132300基因的全長序列， 該基因位于A02 染色體上，根據(jù)Ma 等[22]的命名規(guī)則，將其命名為GhMIPS1A。 從陸地棉TM-1 中克隆GhMIPS1A基因， 通過雙酶切構(gòu)建過表達(dá)載體PBI121-GhMIPS1A。 通過熱激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。通過CottonFGD 網(wǎng)站獲得陸地棉、雷蒙德氏棉（G.raimondii）、亞洲棉（G.arboreum）和海島棉 （G.barbadense） 中MIPS 蛋白序列。 通過NCBI 在線網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）查找獲得榴蓮（Durio zibethinus）、可可（Theobroma cacao）、大 豆（Glycine max）、擬 南 芥、玉 米（Zea mays）和水稻（Oryza sativa）6 個物 種 的MIPS 蛋白序列。 使用ClustalX（http://www.clustal.org/）進(jìn)行氨基酸序列比對， 利用MEGA 7.0 軟件（http://www.mega-software.net/） 采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，自展值設(shè)為1 000，其余參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。 使用DNAMAN 軟件對GhMIPS1A氨基酸序列進(jìn)行保守性分析。 使用GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）進(jìn)行外顯子- 內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析。

1.5 亞細(xì)胞定位分析

采用凍融法，將構(gòu)建的35S∷GhMIPS1AGFP 融合表達(dá)載體、35S∷GFP 空載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101。 利用煙草瞬時轉(zhuǎn)化進(jìn)行亞細(xì)胞定位，選取生長4 周左右的煙草的第三或第四片平滑且完整的葉片進(jìn)行注射。 注射后避光培養(yǎng)24 h， 恢復(fù)光照繼續(xù)培養(yǎng)48 h， 然后在蔡司LSM510 激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。

1.6 病毒誘導(dǎo)的基因沉默試驗(yàn)及擬南芥轉(zhuǎn)化

參考Gu 等[28]的具體試驗(yàn)步驟構(gòu)建VIGS 載體并進(jìn)行棉花侵染。 VIGS 所用載體系統(tǒng)為：pCLCrVA （空 載 體）、pCLCrVB （輔 助 載 體）、pCLCrVA-PDS（陽性對照）。 以TM-1 葉片cDNA為模板進(jìn)行基因片段的克隆，構(gòu)建pCLCrVAGhMIPS1A 載體并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。陽性菌液可添加終濃度為20%（體積分?jǐn)?shù)）甘油，長期保存于－80 ℃冰箱。 將TM-1 種子播種于育苗盤，放于長日照條件（16 h 光照/8 h 黑暗）下的光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待生長至子葉完全展平后使用注射法侵染棉花幼苗子葉， 以pCLCrVA-PDS 作為陽性對照， 侵染后的棉花幼苗在黑暗中放置24 h后， 重新放置于培養(yǎng)箱（25 ℃，16 h 光照/8 h 黑暗）培養(yǎng)，后續(xù)持續(xù)觀察表型。

采用花序侵染法，將構(gòu)建好的GhMIPS1A過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥， 使用含有卡那霉素的1/2 MS 固體培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)基因株系， 對篩選的陽性植株移栽并進(jìn)行檢測。 至T3進(jìn)行陽性鑒定、表型觀察、肌醇含量測定。

1.7 代謝物肌醇和D-葡萄糖含量的測定

待測樣品制備方法：精確稱取并記錄植物樣品組織質(zhì)量，加入適量蒸餾水，使用研磨機(jī)粉碎制成勻漿， 將勻漿完全轉(zhuǎn)移至干凈的100 mL 容量瓶中備用，按照肌醇提取試劑盒說明書測定肌醇含量和D-葡萄糖含量。

1.8 干旱、鹽脅迫處理及脯氨酸、丙二醛含量的測定

將TM-1 棉花種子播種于育苗盤， 放于長日照條件（16 h 光照/8 h 黑暗）下的光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)生長，待棉花生長至幼苗4 葉期，選取展平的真葉在水中培養(yǎng)1 d 后， 將離體葉片分別轉(zhuǎn)移至含有200 mmol·L－1NaCl 及20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）聚乙二醇6000（PEG 6000）溶液中進(jìn)行脅迫處理，以水處理的葉片作為對照[29-30]。 分別在處理0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h 后進(jìn)行取樣，樣品立即用蒸餾水洗凈后擦干水分， 用剪刀去掉葉脈，剩余部分剪成0.5 cm×0.5 cm 小塊，在液氮中速凍后，于－80 ℃冰箱儲存或直接用于RNA 提取、生理指標(biāo)的測定。 以上樣品均取3 個生物學(xué)重復(fù)。脯氨酸（proline,Pro）含量測定方法為酸性茚三酮法[31]，丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量測定方法為硫代巴比妥酸法[32]。

2 結(jié)果與分析

2.1 MIPS 基因家族成員鑒定及保守序列分析

MIPS基因家族是一個非常小的家族， 在大多數(shù)植物中通常包含1～2 個成員。 但是在陸地棉和海島棉中分別發(fā)現(xiàn)4 個MIPS基因。 為研究MIPS基因家族在植物中的進(jìn)化特征，將陸地棉、海島棉、雷蒙德氏棉、亞洲棉、榴蓮、可可、大豆、擬南芥、玉米、水稻10 個物種中的29 個MIPS 蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示單子葉植物的MIPS 蛋白聚在一起， 雙子葉植物的MIPS 蛋白聚在一起（圖1）。 將GhMIPS1A 和其他6 個物種的MIPS 蛋白進(jìn)行多序列比對發(fā)現(xiàn)，MIPS 蛋白在植物中的保守性很高，氨基酸序列相似性高達(dá)93%，并且存在4 段高度保守的序列（圖2）：GWGGNNG、LWTANTERY、NGSPQNTFVPGL、SYNHLGNNDG， 推測這4 個保守基序?qū)τ贛IPS 發(fā)揮功能至關(guān)重要。

圖1 10 種植物的29 個MIPS 同源蛋白序列的進(jìn)化分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of 29 MIPS proteins of ten species

圖2 7 個代表性植物MIPS 蛋白的多重序列比對Fig. 2 Multiple sequence alignment of MIPS proteins in seven representative plants

2.2 MIPS 基因的結(jié)構(gòu)分析

為了進(jìn)一步研究MIPS基因家族成員的進(jìn)化關(guān)系， 對4 個陸地棉MIPS基因序列和其他9 個植物25 個MIPS基因進(jìn)行外顯子- 內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析。在絕大多數(shù)高等植物中，MIPS基因都有10個外顯子， 說明MIPS基因在進(jìn)化過程中高度保守。 然而擬南芥中AtMIPS1和AtMIPS12基因分別含有9 個和7 個外顯子， 這表明擬南芥在進(jìn)化過程中可能經(jīng)歷了特殊的進(jìn)化事件（圖3）。

圖3 10 種代表性植物MIPS 基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)Fig. 3 Exon-intron structure of MIPS genes in ten species

2.3 GhMIPS1A 的時空表達(dá)模式分析

為了探究GhMIPS1A的組織表達(dá)特性和空間表達(dá)特性， 分別使用高衣分材料新陸早18 號和低衣分材料德字棉531 進(jìn)行基因表達(dá)分析，結(jié)果顯示：GhMIPS1A在0 DPA、3 DPA、5 DPA 的胚珠中較高水平表達(dá)（圖4A），在根、莖、葉、纖維中表達(dá)量較高（圖4B），而且GhMIPS1A基因在高衣分材料新陸早18 號上述器官中的表達(dá)量均高于其在低衣分材料德字棉531 中的表達(dá)量（圖4）。由此推測，該基因在陸地棉纖維發(fā)育早期發(fā)揮重要作用，可能影響陸地棉的產(chǎn)量。

圖4 GhMIPS1A 的時空表達(dá)分析Fig. 4 Temporal and spatial expression patterns of GhMIPS1A

2.4 GhMIPS1A 的亞細(xì)胞定位

亞細(xì)胞定位試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，GhMIPS1A-GFP融合蛋白的綠色熒光僅分布于細(xì)胞膜 （圖5A～C），而對照的熒光分布于整個細(xì)胞中（圖5D～F）。

圖5 GhMIPS1A 蛋白的亞細(xì)胞定位Fig. 5 Subcellular localization of GhMIPS1A protein

2.5 病毒誘導(dǎo)的GhMIPS1A 基因沉默

轉(zhuǎn)化pCLCrVA-PDS 的陽性對照植株整株葉片出現(xiàn)不同程度的白化現(xiàn)象，表明該沉默系統(tǒng)成功且有效。 轉(zhuǎn)化空載體的對照植株及GhMIPS1A沉默植株在表型上并沒有明顯差異 （圖6A）。qRT-PCR 結(jié)果表明， 在GhMIPS1A沉默株系VL1、VL2、VL3 中，GhMIPS1A的表達(dá)量不同程度地降低，說明該基因被成功沉默（圖6B）。 測定代謝物肌醇和D- 葡萄糖的含量（圖6C）發(fā)現(xiàn)，隨著GhMIPS1A基因的沉默， 肌醇含量也隨之顯著降低，3 個沉默株系的肌醇含量分別降低31.83%、32.90%、29.46%，但葡萄糖含量無顯著變化。 測定成熟棉鈴衣分發(fā)現(xiàn)，與空載體對照植株相比，GhMIPS1A沉默植株的纖維密度降低（圖6D），3 個GhMIPS1A沉默株系VL1、VL2、VL3 的衣分分別降低4.48、4.93、3.95 百分點(diǎn)（圖6E）。

圖6 GhMIPS1A 沉默植株的表型Fig. 6 Phenotypes of GhMIPS1A-silenced plants

2.6 GhMIPS1A 在擬南芥中的功能研究

為了探究GhMIPS1A基因在植物生長發(fā)育過程中所發(fā)揮的功能，構(gòu)建過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥，得到3 個過表達(dá)株系，分別為L1、L2、L3（圖7A～B）。將T3種子播種于1/2 MS 固體培養(yǎng)基上垂直培養(yǎng)1 周，觀察測定擬南芥根長，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長顯著長于野生型 （圖7A、7C）。 同時測定肌醇含量和D- 葡糖糖的含量發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥中肌醇含量比野生型擬南芥高1 倍以上，但是D- 葡萄糖含量無顯著差異，其原因可能是D- 葡萄糖的含量由多條不同的代謝途徑共同決定（圖7D）。

圖7 GhMIPS1A 基因在擬南芥中的功能研究Fig. 7 Functional analysis of GhMIPS1A in A. thaliana

2.7 干旱脅迫下和鹽脅迫下GhMIPS1A 的表達(dá)變化及相關(guān)代謝物含量的變化

為了分析GhMIPS1A在多種脅迫下的表達(dá)模式， 本研究使用4 葉期的陸地棉幼苗作為材料，分別進(jìn)行干旱、高鹽脅迫處理，檢測處理后葉片脯氨酸和丙二醛含量。 結(jié)果顯示：隨著干旱或鹽脅迫處理時間的延長，脯氨酸的含量也隨之增加（圖8B），同時丙二醛的含量整體呈現(xiàn)增加的趨勢（圖8A），表明棉花葉片對脅迫做出了響應(yīng)。qRT-PCR 結(jié)果表明， 無論是鹽脅迫還是干旱脅迫，GhMIPS1A的表達(dá)量都呈現(xiàn)先增后減的趨勢（圖8C～D），肌醇含量隨著GhMIPS1A基因的表達(dá)呈現(xiàn)相同的變化趨勢（圖8E～F），這些結(jié)果均表明GhMIPS1A基因積極響應(yīng)鹽脅迫和干旱脅迫，可能在抗逆脅迫過程中發(fā)揮重要作用。

圖8 非生物脅迫下GhMIPS1A 的表達(dá)模式及相關(guān)代謝物含量Fig. 8 Expression patterns of GhMIPS1A and relative metabolite contents under different abiotic stresses

3 討論

MIPS基因家族成員非常少，除了擬南芥有3個MIPS家族成員，陸地棉、海島棉、大豆和玉米各有4 個MIPS家族成員外， 絕大多數(shù)植物中僅有1～2 個成員[33]。所有高等植物MIPS基因大多編碼約510 個氨基酸， 氨基酸序列相似性高達(dá)93%，且存在4 個高度保守的基序，這與前人的研究結(jié)果[34-35]一致。而內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)分析顯示擬南芥可能經(jīng)歷了復(fù)雜的進(jìn)化事件。

MIPS 是肌醇及其衍生物合成中的關(guān)鍵酶，在植物的生長發(fā)育、 細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的生成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗逆調(diào)節(jié)等過程中起關(guān)鍵調(diào)控作用。 已有的研究表明，MIPS基因在陸地棉纖維發(fā)育的起始期和伸長期早期發(fā)揮重要的作用[22]，棉花的產(chǎn)量通常由棉纖維起始期的突起細(xì)胞數(shù)目決定，分析高低衣分材料間基因表達(dá)量的差異， 推測GhMIPS1A可能是控制陸地棉產(chǎn)量的正向調(diào)控因子。

在擬南芥中發(fā)現(xiàn)3 個MIPS基因AtMIPS1、AtMIPS2、AtMIPS3。 其中，AtMIPS1對于種子的發(fā)育至關(guān)重要，缺少AtMIPS1可使脫落酸和肌醇衍生物含量減少，從而產(chǎn)生葉片卷曲、植株矮小、子葉病變等異常表型。 MIPS 能夠改變植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)植物細(xì)胞對營養(yǎng)成分的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，在植物對逆境脅迫的耐受中起非常重要的作用。 在擬南芥中過表達(dá)GhMIPS1A基因，轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長顯著增加，肌醇含量也隨著提高。 亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示MIPS 蛋白定位于細(xì)胞膜中， 由此推測GhMIPS1A基因是參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、影響植物生長的重要信號分子。

已有報(bào)道表明，果膠前體物質(zhì)和抗壞血酸對于棉纖維的生長發(fā)育是必不可少的[36-37]，MIPS 影響果膠前體UDP-D- 葡萄糖醛酸和抗壞血酸的合成[38]。 UDP-D-葡萄糖醛酸、磷脂酰肌醇和磷脂酰肌醇激酶是重要的肌醇衍生物，已被證明是細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的重要組成部分，參與棉花纖維的伸長生長[39]。 為了進(jìn)一步探究GhMIPS1A在陸地棉中發(fā)揮的作用， 本研究通過VIGS 試驗(yàn)沉默GhMIPS1A基因在棉花TM-1 中的表達(dá)， 導(dǎo)致肌醇含量降低， 發(fā)現(xiàn)隨著該基因表達(dá)量的降低，棉花的纖維密度和衣分均降低， 初步表明GhMIPS1A基因?qū)τ陉懙孛廾蘩w維的生長發(fā)育起正向調(diào)控的作用。 若要進(jìn)一步明確GhMIPS1A基因在纖維發(fā)育過程中所發(fā)揮的作用，則需要進(jìn)行更深入的研究。 如針對該基因構(gòu)建CRISPRCas9 載體，獲得突變株系進(jìn)一步探究其在陸地棉中的調(diào)控機(jī)制。

肌醇是植物的第二信使分子1，4，5- 三磷酸肌醇（IP3） 的前體物質(zhì)，IP3通過液泡膜和粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣離子通道結(jié)合，激活鈣調(diào)蛋白，形成Ca2+/CaM 復(fù)合物，并激活一系列下游蛋白，從而調(diào)控與抗逆脅迫相關(guān)的一系列級聯(lián)反應(yīng)[40]。 肌醇的生物合成是不同生化途徑高度調(diào)控的過程，因此GhMIPS1A基因是如何與其他相關(guān)酶基因相互協(xié)作參與肌醇代謝通路調(diào)控，以及如何和生長素、赤霉素等植物激素相互作用影響植物的生長發(fā)育需深入挖掘。

干旱、鹽堿等非生物脅迫是限制植物生長發(fā)育和作物產(chǎn)量的主要因素，因此挖掘優(yōu)異的耐鹽耐旱基因資源具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[41]。 本研究利用200 mmol·L－1NaCl 和20%PEG 6000 處理模擬鹽脅迫和干旱脅迫環(huán)境，發(fā)現(xiàn)GhMIPS1A基因可以快速響應(yīng)逆境脅迫，且肌醇含量在鹽脅迫和干旱脅迫下顯著增加。 然而，該基因在逆境脅迫響應(yīng)信號中的位置以及如何作用尚不清楚，需進(jìn)行更深入的研究驗(yàn)證其耐鹽、耐旱性。

4 結(jié)論

本研究從陸地棉TM-1 中克隆出1 個MIPS基因，將其命名為GhMIPS1A。 通過氨基酸序列保守性分析、系統(tǒng)發(fā)育樹分析、外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析表明MIPS 在進(jìn)化過程十分保守。 亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示GhMIPS1A蛋白定位于細(xì)胞膜。GhMIPS1A基因在根、莖、葉、纖維組織中具有較高的表達(dá)量，在纖維發(fā)育的起始期和伸長期早期優(yōu)勢表達(dá)，且在高低衣分材料中的表達(dá)量有顯著差異。過表達(dá)GhMIPS1A基因的擬南芥植株根長增加，肌醇含量隨之增加。VIGS 技術(shù)沉默GhMIPS1A基因后的棉花植株出現(xiàn)纖維密度降低的現(xiàn)象， 且衣分也隨之減少。GhMIPS1A基因在鹽脅迫、干旱脅迫響應(yīng)途徑中具有積極作用。